專利名稱：一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(embryonic stem，ES)是一種全/多能干細胞，源自處于囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團，不僅能夠在體內(nèi)發(fā)育分化形成新生個體的各個組織器官，而且可以在體外培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化形成各種特化細胞類型，如心室肌細胞，平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞，紅細胞，胰島細胞等等。人胚胎干細胞體外建系的成功和誘導(dǎo)分化技術(shù)的成熟，使胚胎干細胞成為臨床上器官移植治療和細胞移植治療的重要細胞來源。
由冠狀動脈病變引起的心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是現(xiàn)代社會中人們最常見的疾病和主要致死原因。雖然近年在其診療方面有眾多進展，但心肌梗塞后受損的心肌逐漸被無收縮功能的纖維組織代替，從而導(dǎo)致的心力衰竭仍是主要的心臟病變。心臟移植或植入左室機械性的支撐系統(tǒng)，可挽救終末期心力衰竭病人的生命，但受限于供源的短缺(前者)和有限的使用壽命(后者)。由于心肌細胞是一種終末分化細胞，沒有增殖能力，因此，如何修復(fù)丟失損傷的心肌細胞，改善病變心肌血供和MI后心功能不全成為國際國內(nèi)心臟學領(lǐng)域研究熱點。隨著干細胞生物學的研究突破和其培養(yǎng)技術(shù)的改進，通過細胞移植(將健康的細胞移植入病變心臟)以重建受損心肌、恢復(fù)病變心臟功能的嘗試為治療心臟疾病展示了令人興奮的前景。
定向分化是胚胎干細胞走向臨床的必要步驟。體外培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎干細胞的分化得到的類胚體中含有各種特化細胞類型，所以如何提高心肌細胞的豐度、如何分離出純化的心肌細胞是將胚胎干細胞作為細胞移植供體所急需解決的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法，所述方法可大大提高類胚體中心肌細胞的豐度，從而可為心肌梗塞的干細胞臨床治療提供更多的細胞來源。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法，包括步驟(a)在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±24小時，得到第一培養(yǎng)物；(b)在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±24小時，得到第二培養(yǎng)物，在第二培養(yǎng)物中心肌細胞占所有細胞的10-15％；并且，所述的低氧環(huán)境是氣體環(huán)境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環(huán)境條件是氣體環(huán)境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細胞在以下的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)DMEM+15％FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細胞選自未分化的胚胎干細胞、或分化早期的胚胎干細胞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的分化早期為胚胎干細胞開始分化起的0-48小時。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的低氧環(huán)境含有3±0.5體積百分比的氧氣；或者，所述的常氧環(huán)境含有21±0.5體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的低氧環(huán)境含有3±0.2體積百分比的氧氣；比如可以含有3體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的常氧環(huán)境含有21±0.2體積百分比的氧氣；比如可以含有21體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細胞為哺乳動物的胚胎干細胞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動物選自人、鼠、或猴。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±12小時；或者，在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±12小時。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(a)和步驟(b)中，培養(yǎng)條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備心肌細胞的方法，包括步驟(a)在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±24小時，得到第一培養(yǎng)物，(b)在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±24小時，得到第二培養(yǎng)物，在第二培養(yǎng)物中心肌細胞占所有細胞的10-15％，(c)從第二培養(yǎng)物中分離出心肌細胞；并且，所述的低氧環(huán)境是氣體環(huán)境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環(huán)境條件是氣體環(huán)境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用于培養(yǎng)心肌細胞的裝置，所述的裝置包括一個封閉的箱體，以及位于箱體上的箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調(diào)節(jié)箱體內(nèi)的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了轉(zhuǎn)入心肌特異性啟動子NCX1心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型驅(qū)動綠色熒光蛋白基因的ES細胞誘導(dǎo)向心肌細胞的分化。其中，圖1A顯示了在類胚體博動區(qū)域特異性表達綠色熒光蛋白；圖1B顯示了分離單個心肌細胞中有綠色熒光蛋白的表達；本圖證明本發(fā)明人建立的心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型驅(qū)動綠色熒光蛋白基因的ES細胞能夠表達心肌細胞特異性的綠色熒光。
圖2顯示了低氧處理提高類胚體向心肌的分化率。
圖3顯示了低氧處理能夠提高類胚體中心肌細胞的比例。低氧處理對類胚體的形態(tài)和大小無明顯影響，卻可以明顯提高胚體中表達綠色熒光蛋白的心肌細胞的比例。
圖4顯示了低氧處理能夠上調(diào)類胚體中心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的表達。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，出乎意料地發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)分化的胚胎干細胞的分化早期給以低氧刺激，能夠促進胚胎干細胞向心肌細胞的分化，大大提高類胚體中心肌細胞的豐度，從而可為心肌梗塞的干細胞臨床治療提供更多的細胞來源?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
胚胎干細胞如本發(fā)明所用，所述的胚胎干細胞為未分化的胚胎干細胞、或為分化早期(為胚胎干細胞開始分化起的0-48小時)的胚胎干細胞。其中，未分化胚胎干細胞來源于囊胚期內(nèi)細胞團。
在本發(fā)明中，所述的胚胎干細胞為哺乳動物的胚胎干細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的哺乳動物包括但不限于人、鼠、牛、羊、豬、狗、貓、兔、馬、或猴；更優(yōu)選的，所述的哺乳動物包括但不限于人、鼠、或猴。
在本發(fā)明中，所述的胚胎干細胞可采用常規(guī)的方法來制備，或可獲自細胞保藏機構(gòu)，例如ATCC。
細胞培養(yǎng)的條件在本發(fā)明中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)來培養(yǎng)胚胎干細胞。比如在合適的條件下，可將胚胎干細胞培養(yǎng)在滋養(yǎng)層細胞上。
可用于本發(fā)明的培養(yǎng)基沒有特別限制，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的適用于培養(yǎng)胚胎干細胞的培養(yǎng)基。代表性的例子比如DMEM+15％FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME；其中，DMEM為一種通用培養(yǎng)基，F(xiàn)BS指特級胎牛血清，L-Glu指L型谷氨酸，P-S指鏈霉素+青霉素，MEM為非必需氨基酸，β-ME為β-巰基乙醇。
這些培養(yǎng)基可以用常規(guī)方法配制或購買獲得，例如，DMEM培養(yǎng)基可購自GIBCO公司。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，胚胎干細胞如下培養(yǎng)選用絲裂霉素C(購自SIGMA)處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞作為滋養(yǎng)層細胞，將胚胎干細胞培養(yǎng)在滋養(yǎng)層細胞上。培養(yǎng)基使用DMEM，添加15％胎牛血清，L-谷氨酸，鏈霉素-青霉素，非必需氨基酸，β-巰基乙醇(0.0007％)，平均36小時傳代。傳代采用0.05％Trypsin-EDTA。
更佳地，胚胎干細胞的培養(yǎng)條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的培養(yǎng)環(huán)境如本發(fā)明所用，所述的“低氧環(huán)境”與“低氧氣氛”可互換使用，均是指一種氣體環(huán)境，所述氣體環(huán)境中除了對氧氣、二氧化碳、氮氣的含量進行調(diào)節(jié)外，其它氣體及其配比基本上接近空氣或與空氣完全等同。所述低氧環(huán)境中含有3±1體積百分比的氧氣；更優(yōu)選的，所述的低氧環(huán)境含有3±0.5體積百分比的氧氣；比如可以含有3體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方式中，所述的低氧環(huán)境的氣壓等于常氧環(huán)境的氣壓，本發(fā)明人通過調(diào)節(jié)氮氣的濃度來調(diào)節(jié)出低氧環(huán)境，因而在低氧環(huán)境中氮氣的濃度相對于常氧環(huán)境有升高(即與常氧相比，氧氣體積的減少量基本等于或完全等于氮氣體積的增加量)。
如本發(fā)明所用，所述的“常氧環(huán)境”和“常氧氣氛”可互換使用，均是指一種氣體環(huán)境，其中氧氣的含量接近于或等于空氣中氧氣的含量，其它氣體及其配比接近空氣或與空氣完全等同。所述常氧環(huán)境中含有21±1體積百分比的氧氣；更優(yōu)選的，所述的常氧環(huán)境含有21±0.5體積百分比的氧氣；比如可以含有21體積百分比的氧氣。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的“常氧環(huán)境”為一般的空氣環(huán)境，但是CO2濃度為5％。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，本發(fā)明人進行了心肌特異性熒光表達試驗，心肌特異性基因表達水平試驗等檢測，均說明低氧刺激能夠大大促進胚胎干細胞向心肌細胞的分化。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)通過本發(fā)明的方法，僅需要調(diào)節(jié)環(huán)境中的含氧量，即可實現(xiàn)胚胎干細胞向心肌細胞的定向分化。一般地，持續(xù)在常氧條件下培養(yǎng)分化的胚胎干細胞所得培養(yǎng)物中心肌細胞占所有細胞的5％，而本發(fā)明在對胚胎干細胞在分化早期的低氧處理明顯增加了心肌細胞的比例。
(1)本發(fā)明首次將低氧處理技術(shù)用于胚胎干細胞向心肌細胞定向誘導(dǎo)，從而可大大提高心肌細胞的獲得率，可使用本發(fā)明制備的心肌細胞取代受損的心肌細胞，發(fā)揮重建受損心肌、恢復(fù)病變心臟功能。
(2)現(xiàn)有的胚胎干細胞體外誘導(dǎo)向心肌細胞的分化方法往往復(fù)雜煩瑣且效果不理想，而采用本發(fā)明的低氧處理技術(shù)，不僅心肌細胞的獲得率高，條件易于控制、操作簡單，而且無需加入誘導(dǎo)試劑，成本低廉。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1胚胎干細胞的培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化小鼠R1胚胎干細胞(ES)系(Roder JC，Canada購自美國ATCC)培養(yǎng)在滋養(yǎng)層細胞上，滋養(yǎng)層細胞選用絲裂霉素C(購自SIGMA)處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞(來源自遠交系昆明白鼠，13-15天齡胚胎)，培養(yǎng)使用DMEM，添加15％胎牛血清(購自Hyclone公司，ES cell qualified)，L-谷氨酸，P-S(青霉素+鏈霉素)，非必需氨基酸，(購自GIBCO，100X稀釋)，β-巰基乙醇(0.0007％)，平均36小時傳代。傳代采用0.2％Trypsin-EDTA(購自GIBCO)。
體外誘導(dǎo)分化采用懸滴培養(yǎng)方法，將適宜細胞密度(1.5-3.0×106細胞/培養(yǎng)皿(直徑60mm))的小鼠R1胚胎干細胞(用0.05％Trypsin-EDTA消化成單個細胞懸液，采用差速貼壁的方法除去其中的滋養(yǎng)層細胞，使滋養(yǎng)層細胞占細胞總數(shù)小于5％，用血球記數(shù)板記數(shù)；然后，用含有20％FBS的細胞培養(yǎng)液稀釋細胞至終濃度為約600細胞/20μl，然后將細胞懸液接種為每滴20μl的懸滴，以懸滴狀態(tài)培養(yǎng)兩天；然后，將形成的類胚體收集到無Matrigel處理的培養(yǎng)皿中，懸浮培養(yǎng)3天；然后，將經(jīng)培養(yǎng)的類胚體接種到0.1％明膠-包被的(gelatin-coated)培養(yǎng)板上。
實施例2質(zhì)粒構(gòu)建和ES細胞的轉(zhuǎn)染先利用載體質(zhì)粒pEGFP-N1(BD，購自Clontech)，用內(nèi)切酶AatII酶切然后大片段自連，將原有的CMVIE啟動子失活，再用內(nèi)切酶PstI酶切失活后的載體，然后將克隆的心肌特異性鈉鈣交換蛋白一型基因啟動子(采用常規(guī)的方法從基因組DNA中克隆得到，或可購自NIH/NIA研究所)用內(nèi)切酶PstI切出，用T4連接酶連接，得到的克隆分別用PstI，SalI，AseI酶切鑒定，挑出其中正確插入的陽性克隆，大量擴增質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。用AseI酶切線性化質(zhì)粒，得到的線性化質(zhì)粒15μg，利用電轉(zhuǎn)儀(BioRad，GenePulser)轉(zhuǎn)染ES細胞，電轉(zhuǎn)條件設(shè)置為250V，500μF，ES細胞懸液為5×106/800μl，轉(zhuǎn)染后接種到有Neo抗性的滋養(yǎng)層細胞(Neo處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞)上，36小時后在培養(yǎng)液中加入300μg/ml的G418(購自GIBCO)，培養(yǎng)7-10天，挑取單個克隆，培養(yǎng)擴增鑒定，選出陽性克隆并誘導(dǎo)分化成為心肌細胞。
結(jié)果，轉(zhuǎn)染篩選得到7個獨立克隆，挑選其中的兩個(克隆19和克隆20)做體外誘導(dǎo)分化實驗。NCX1-EGFP ES細胞系可以在分化得到的心肌細胞中表達綠色熒光蛋白，檢測胚體中綠色熒光就可以檢測胚體中心肌細胞的比率。
如圖1所示，誘導(dǎo)分化第6天，第9天熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在類胚體的搏動區(qū)域有特異性的綠色熒光，分離培養(yǎng)的單個心肌細胞免疫組化染色發(fā)現(xiàn)綠色熒光和心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白α-sarcomeric actin(肌漿網(wǎng)肌動蛋白α亞型)分布在共同的細胞中。
因此，可見NCX1啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白基因表達轉(zhuǎn)染ES細胞，得到表達心肌特異性綠色熒光蛋白表達的ES細胞系。
實施例3 ES細胞的低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)分化將正常培養(yǎng)的ES細胞(轉(zhuǎn)染鈉鈣交換蛋白啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白(NCX1)基因后的ES細胞)做成懸滴以后，分成低氧處理組和正常對照組。
將低氧處理組細胞放入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(Thermo Forma)，培養(yǎng)條件為3％O2，5％二氧化碳，，持續(xù)培養(yǎng)48小時(2天)，而正常對照組細胞在21％O2，5％CO2條件下培養(yǎng)，懸滴培養(yǎng)結(jié)束后，兩組細胞都在正常氧濃度條件下培養(yǎng)。
實施例4 ES細胞向心肌細胞分化率的統(tǒng)計a.測定陽性胚體數(shù)將分化的類胚體接種到24孔板中，然后開始觀察類胚體中的跳動情況，有自主搏動心肌細胞的類胚體記為陽性胚體，每天觀察得到陽性胚體占總胚體個數(shù)的百分率，得到ES細胞向心肌細胞分化的曲線(profile)。
結(jié)果如圖2，可見與正常條件培養(yǎng)組相比，低氧培養(yǎng)組有更大比例的類胚體中有搏動的心肌細胞。
b.測定熒光面積含有NCX1-EGFP基因的ES細胞誘導(dǎo)分化后，有自主搏動出現(xiàn)的類胚體在熒光顯微鏡(Leica)下觀察其綠色熒光的表達和分布并拍照，從照片上的綠色熒光面積的來鑒定單個類胚體中心肌細胞的比率。
結(jié)果如圖3所示，在單個類胚體中，相對于正常條件培養(yǎng)組，低氧處理組類胚體中有更多的綠色熒光，這就意味著低氧培養(yǎng)過的胚體中有更大比例的心肌細胞。
實施例5心肌細胞的免疫細胞化學染色從類胚體中分離出來的單個心肌細胞用4％多聚甲醛固定后用，0.1％Triton破膜，用10％羊血清封閉，然后加入0.1％的抗α-sacromeric actin(購自SIGMA，鼠源)，4℃過夜，接著加入二抗5％TRITC標記山羊抗小鼠IgG二抗(anti-mouseTRITC-conjugated，購自Santa Cruz公司)，室溫下放置1小時，熒光顯微鏡下檢測。
實施例6心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因表達的RT-PCR檢測分化不同天數(shù)的類胚體收集用于提取總RNA，然后利用Superscript II(購自Invitrogene)做逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物當作模板做PCR，檢測低氧處理對不同基因表達的影響。各種引物的序列以及PCR的擴增條件分別如下NKX2.5正向引物(Sense)gCC AAC AgC AAC TTC gTg A(SEQ ID NO1)；反向引物(Antisense)CCg gTC CTA gTg Tgg AAT C(SEQ ID NO2)；94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 40s，35個循環(huán)。
MEF2C正向引物(Sense)AgA TAC CCA CAA CAC ACC A(SEQ ID NO3)；反向引物(Antisense)ATC CTT CAg AgA gTC gCA T(SEQID NO4)；94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 40s，35個循環(huán)。
MLC-2v正向引物(Sense)TGT GGG TCA CCT GAG GCT GTG GTT CAG(SEQ ID NO5)；反向引物(Antisense)GAA GGC TGA CTA TGT CCG GGA GAT GC(SEQ IDNO6)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，29個循環(huán)。
aMHC正向引物(Sense)GCA GAC CAT CAA GGA CCT，(SEQ ID NO7)；反向引物(Antisense)GTT GGC CTG TTC CTC CGC C；(SEQ ID NO8)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，33個循環(huán)。
M28s正向引物(Sense)AgC AgC CgA CTT AgA ACT gg (SEQ IDNO9)；
反向引物(Antisense)TAg ggA CAg Tgg gAA TCT Cg(SEQ IDNO10)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，21個循環(huán)。
RT-PCR實驗檢測心肌特異性基因表達的結(jié)果見圖4，心肌特異性的轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5，MEF2C，心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白MLC-2v，RyR2，低氧培養(yǎng)組類胚體中上述基因的表達顯著上調(diào)，說明相對于正常培養(yǎng)條件，低氧處理的類胚體中有更大比例的心肌細胞。
實施例7分化得到心肌細胞的純化利用轉(zhuǎn)入NCX1-EGFP基因(即前面實施例2中鈉鈣交換蛋白基因啟動子驅(qū)動下的EGFP基因)的ES細胞誘導(dǎo)分化，用0.25％胰酶消化低氧處理過分化到第8天的類胚體，37℃ 6分鐘，每隔2分鐘敲打一次，消化結(jié)束后加入培養(yǎng)液，離心收集細胞，棄上清，用培養(yǎng)液重懸，得到單細胞懸液。
利用BD公司FaCSAria流式細胞儀分選出有綠色熒光蛋白表達的細胞，即得到純化的心肌細胞。
實施例8培養(yǎng)心肌細胞的裝置一種培養(yǎng)心肌細胞的培養(yǎng)箱，該培養(yǎng)箱包括一個箱體和一個箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置；其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調(diào)節(jié)箱體內(nèi)的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
培養(yǎng)小鼠R1 ES細胞時，打開箱門，將處于分化早期的胚胎干細胞培養(yǎng)物置于箱體內(nèi)部，調(diào)節(jié)氮氣供給裝置和氧氣排出裝置，調(diào)節(jié)氧氣含量，使氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
總結(jié)綜上所述，在本發(fā)明的實施例中，通過分化時程，心肌特異性熒光表達，心肌特異性基因表達水平等指標的檢測，證實低氧能夠有效的體外誘導(dǎo)胚胎干細胞向心肌細胞的分化。低氧作為一種新的誘導(dǎo)胚胎干細胞體向心肌細胞的分化干預(yù)手段，有望為心肌梗塞的干細胞臨床治療提供更多的細胞來源。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法<130>060605<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1gccaacagca acttcgtga 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ccggtcctag_tgtggaatc 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3
agatacccac aacacacca19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4atccttcaga gagtcgcat19<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tgtgggtcac ctgaggctgt ggttcag 27<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6gaaggctgac tatgtccggg agatgc26<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7
gcagaccatc aaggacct18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8gttggcctgt tcctccgcc 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9agcagccgac ttagaactgg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10tagggacagt gggaatctcg 20
權(quán)利要求
1.一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于，包括步驟(a)在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±24小時，得到第一培養(yǎng)物；(b)在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±24小時，得到第二培養(yǎng)物，在第二培養(yǎng)物中心肌細胞占所有細胞的10-15％；并且，所述的低氧環(huán)境是氣體環(huán)境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環(huán)境條件是氣體環(huán)境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細胞選自未分化的胚胎干細胞、或分化早期的胚胎干細胞。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分化早期為胚胎干細胞開始分化起的0-48小時。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的低氧環(huán)境含有3±0.5體積百分比的氧氣；或者，所述的常氧環(huán)境含有21±0.5體積百分比的氧氣。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細胞為哺乳動物的胚胎干細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物選自人、鼠、或猴。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±12小時；或者在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±12小時。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)和步驟(b)中，培養(yǎng)條件是37±1℃，5±0.5％CO2。
9.一種制備心肌細胞的方法，其特征在于，包括步驟(a)在低氧環(huán)境中，培養(yǎng)胚胎干細胞48±24小時，得到第一培養(yǎng)物，(b)在常氧環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)第一培養(yǎng)物120±24小時，得到第二培養(yǎng)物，在第二培養(yǎng)物中心肌細胞占所有細胞的10-15％，(c)從第二培養(yǎng)物中分離出心肌細胞；并且，所述的低氧環(huán)境是氣體環(huán)境，其中含有3±1體積百分比的氧氣；所述的常氧環(huán)境條件是氣體環(huán)境，其中含有21±1體積百分比的氧氣。
10.一種用于培養(yǎng)心肌細胞的裝置，其特征在于，所述的裝置包括一個封閉的箱體，以及位于箱體上的箱門，所述的箱體中包括氮氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氮氣供給裝置和氧氣排出裝置調(diào)節(jié)箱體內(nèi)的氧氣含量，使得氧氣在氣體中的含量為3±1體積百分比。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進胚胎干細胞向心肌細胞分化的方法，包括將胚胎干細胞培養(yǎng)物置于低氧環(huán)境中，培養(yǎng)適當?shù)臅r間。本發(fā)明首次將低氧處理技術(shù)用于胚胎干細胞向心肌細胞的定向誘導(dǎo)，從而可明顯提高心肌細胞的獲得率，并且，采用本發(fā)明的低氧處理技術(shù)，條件易于控制、操作簡單、成本低廉。
文檔編號C12N5/08GK101074428SQ20061002657
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者楊黃恬, 王嶸 申請人:中國科學院上海生命科學研究院