專利名稱：：一種制備多糖生物絮凝劑的酶學方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)保類水處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種制備多糖生物絮凝劑的酶學方法。
背景技術(shù)：
：水處理是一個關(guān)系到人們生產(chǎn)和生活的重要環(huán)保問題。絮凝劑是水處理中最為常用和有效的制劑。遺憾的是，目前國內(nèi)外所使用的絮凝劑絕大多數(shù)都是無機或有機合成的化合物，其中不少都具有一定的毒副作用。因此，研發(fā)無毒無害，沒有二次污染的生物絮凝劑是當今水處理領(lǐng)域中最受重視的課題之一。有關(guān)生物絮凝劑，包括多糖生物絮凝劑的研究相當活躍，并取得某些進展。但總體看來還處在初級階段。許多生物合成過程中，仍沿襲傳統(tǒng)細菌發(fā)酵方法。這種方法無法合成可控制分子量的產(chǎn)品，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝劑，而這種產(chǎn)品恰恰是某些重要水處理領(lǐng)域，包括貴重金屬選礦回收處理中所需要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對目前水處理中所使用絮凝劑的缺陷，提供一種先進的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，以便在控制條件下，工業(yè)上大規(guī)模合成各種不同分子量，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝劑，滿足目前市場對這類產(chǎn)品的迫切需求。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，包括如下步驟(1)根據(jù)水處理中對多糖生物絮凝劑動力粘度的要求，配制具體濃度的蔗糖溶液；(2)在蔗糖溶液中加入氯化鈣溶液，氯化鈣溶液作為酶的激活劑；(3)用30%醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)上述溶液的pH值在5.25.4范圍；(4)向上述溶液中加入適量的葡聚糖蔗糖酶溶液，混勻后，用10%醋酸調(diào)節(jié)pH值在5.25.4范圍；(5)將上述溶液置于恒溫水浴中，調(diào)節(jié)攪拌，充分反應直至溶液達到所要求的動力粘度；(6)對反應產(chǎn)物進行加熱滅菌，過濾除雜，純化濃縮后即得最終7&口廣叩o如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(1)中共配制四種不同濃度的蔗糖溶液，分別為第一種0.80mol/L、第二種0.73mol/L、第三種0.58mol/L、第四種0.44mol/L。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(2)中每100ml蔗糖溶液加入1毫升0.5%的氯化鈣溶液。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，步驟(3)調(diào)節(jié)完pH值后，將溶液高壓消毒或煮沸15分鐘后，冷卻備用。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(4)中，根據(jù)四種不同濃度的蔗糖溶液，加入的葡聚糖蔗糖酶溶液依次分別為每100ml蔗糖溶液加入800、1000、1200和1400國際單位(IU)的酶液。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，步驟(5)中四種不同濃度的溶液分別置于的水浴溫度依次為2022°C、2224°C、2426°C、2426°C。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，步驟(5)中四種不同濃度的溶液的動力粘度依次為第一種30005000CPS，第二種500015000CPS，第三種3000045000CPS，第四種6000080000CPS。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(6)中加熱滅菌時，溫度控制在809(TC并持續(xù)攪拌1小時，然后降溫至40。C以下。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(6)中純化濃縮的方法為沉淀法，將過濾后的濾液用1倍體積95%以上濃度的甲醇或乙醇或異丙醇進行沉淀，沉淀后靜置l小時以上，然后吸去上清液*，再將沉淀溶解于蒸餾水中，使產(chǎn)物濃度不低于10%，再用等體積甲醇或乙醇或異丙醇進行第二次沉淀；如此重復，直至樣品的還原糖含量低于1%，則將沉淀用蒸餾水或純水溶解，加熱除去有機溶劑，并真空濃縮至15%濃度。如上所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其中，在步驟(6)中純化濃縮的方法為超濾膜循環(huán)過濾法，物料的濃度為1%2%，循環(huán)過濾直至樣品的還原糖含量低于1%，然后將沉淀用蒸餾水或純水溶解，加熱除去有機溶劑，并真空濃縮至15%濃度。本發(fā)明的有益效果如下(1)本發(fā)明采用酶學合成方法制備多糖生物絮凝劑，可以合成可控分子量，尤其是超高分子量的產(chǎn)品；(2)該方法可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，可實現(xiàn)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的目標；(3)通過本發(fā)明所制備的產(chǎn)品無毒、無害，而且具有極其良好的絮凝效果，質(zhì)量優(yōu)異。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。葡聚糖蔗糖酶的制備，包括產(chǎn)酶菌的選育、培養(yǎng)、酶的生產(chǎn)、分離與純化，過程比較復雜和專業(yè)化。詳細過程可參考中國專利"一種含異麥芽低聚糖和果糖的糖漿及其制備方法"(ZL03100280.3)。不同分子量的多糖生物絮凝劑可通過改變底物濃度、酶濃度和反應條件予以制備?，F(xiàn)根據(jù)國際幾個最大水處理公司提出的特殊要求，25°C時的動力粘度依次為A、高分子量30005000CPS(15%濃度)B、較高分子量500015000CPS(15%濃度)C、超高分子量3000045000CPS(15%濃度)D、極高分子量6000080000CPS(10%濃度)其制備方法如下(1)基質(zhì)液的配制①分別配制四種不同濃度的蔗糖溶液A.0.80mol/L蔗糖溶液稱取蔗糖274克，用500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再加蒸餾水至總體積1000毫升。B.0.73mol/L蔗糖溶液稱取蔗糖250克，用500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再加蒸餾水至總體積1000毫升。C.0.58mol/L蔗糖溶液稱取蔗糖198.5克，用500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再加蒸餾水至總體積1000毫升。D.0.44mol/L蔗糖溶液稱取蔗糖150.6克，用500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再加蒸餾水至總體積1000毫升。②于上述四種蔗糖濃度溶液中，按每100ml容積加入1毫升0.5%氯化鈣溶液，氯化鈣溶液作為酶的激活劑。③用新鮮配制的30%醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH在5.25.4范圍。有條件時，將上述溶液高壓消毒或煮沸15分鐘后，冷卻備用。(2)反應液的制備于上述四種基質(zhì)液中，按每100ml容積依次加入800、1000、1200和1400國際單位(IU)酶液，仔細混勻后，再用1(P/。醋酸調(diào)節(jié)pH在5.25.4范圍。1個國際單位(IU)葡聚糖蔗糖酶活性被定義為在一定條件下(例如30'C底物蔗糖濃度15%)，在1小時內(nèi)能將1毫克蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的量。(3)合成過程和反應條件的控制①將上述四種反應液置不同溫度的恒溫水浴中-A.2022°C;B.2224。C;C.2426。C;D.2426。C;②適當調(diào)節(jié)攪拌速度和時間A.攪拌速度3040轉(zhuǎn)/分，每攪拌1小時，停2小時；B.攪拌速度4050轉(zhuǎn)/分，每攪拌1小時，停半小時；C.攪拌速度5080轉(zhuǎn)/分，每攪拌2小時，停半小時；D.攪拌速度80100轉(zhuǎn)/分，連續(xù)攪拌，可適當短暫停止，必要時可適當通入過濾空氣?！蚍磻獣r間與終點判斷在上述控制條件下，一般反應所需時間依次為A,約2024小時；B.約2528小時；C.約2830小時；D.約3235小時。具體終止反應時間應根據(jù)粘度高低來加以判斷，其標準如下A:30005000CPS(25°C15%)B:500015000CPS(25。C15%)C:30，00045，000CPS(25°C15%)D:60,00080,000CPS(25°C10%)(4)反應產(chǎn)物的處理①加熱滅菌，以終止反應。方法是將反應物加熱至809(TC并持續(xù)攪拌1小時，然后降溫至4(TC以下。②過濾除雜，工業(yè)上可用板框壓濾機，實驗室可用小型加壓過濾器。以除去酶蛋白及其他雜質(zhì)。必要時可加活性炭以除去色素及其他低分子物質(zhì)。(5)反應物的純化與濃縮有兩種方法其一是沉淀法，將過濾后的濾液用1倍體積95%以上濃度的甲醇、乙醇或異丙醇進行沉淀，沉淀后應靜置l小時以上，然后吸去上清液，進行回收再生。再將沉淀溶解于蒸餾水中，使產(chǎn)物濃度不低于10%，再用等體積甲醇、乙醇或異丙醇進行第二次沉淀。然后取少量樣品進行化學分析，若還原糖含量低于1%，則可將沉淀用蒸餾水或純水溶解，加熱除去有機溶劑，并真空濃縮至15%濃度。如測定還原糖過高則須進行第三次沉淀洗滌，以確保產(chǎn)品的純度。第二種純化方法是采用超濾膜循環(huán)過濾，應選擇適當?shù)哪た?，一般以IO萬分子量為宜，物料濃度不宜過高，一般采用1%2%。循環(huán)過濾的周期取決于物料中還原糖含量。只有當還原糖達標(低于1%)時方可停止。然后再進行濃縮(方法同上)。(6)產(chǎn)品的技術(shù)指標本發(fā)明產(chǎn)品的技術(shù)指標如表1所示表l多糖生物絮凝劑的技術(shù)指標<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例1取潔凈的2000毫升燒杯或三口燒瓶1只，加入優(yōu)質(zhì)蔗糖274克，然后加入適量蒸餾水，攪拌使溶，并將體積調(diào)至1000毫升，進一步加入10毫升0.5%氯化鈣溶液，攪拌混勻；再用30%醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至5.25.4。將上述溶液煮沸15分鐘后，冷卻至25"。加入新鮮制備的酶液(本批酶活性為456IU/ml)800IU(即17.5毫升)攪拌混勻，再用10。/。醋酸調(diào)pH至5.25.4范圍。將上述反應物置2022匸恒溫水浴中，開啟攪拌器，調(diào)節(jié)攪拌速度至3040轉(zhuǎn)/分，并開始記時，以后按每攪拌l小時，停止2小時的方式進行操作，期間溫度應維持恒定，并保持操作環(huán)境潔凈，避免雜菌污染。當反應進行到18小時后，應每隔1小時，抽樣測定反應物的粘度，當粘度達到30005000CPS即可終止反應。將反應物加熱升溫至8090°C1小時，然后將溫度降至40。C左右，用小型紙板加壓濾器過濾。濾液用95%酒精沉淀三次，每次酒精用量1100毫升。將第三次沉淀溶于蒸餾水，使體積約800毫升，測定其中還原糖含量(低于1%)，然后加熱除去殘留酒精并濃縮至15%濃度。本例終點產(chǎn)品，體積為770毫升，實際濃度為15.2%，得率為85.4%。質(zhì)量分析表明產(chǎn)品外觀為無色透明液體，灰分0.58%，固含物15.2%，pH5.8，動力粘度4500CPS。實施例2取潔凈10升玻璃或不銹鋼容器，加入優(yōu)質(zhì)蔗糖1.25公斤，加入蒸餾水3升，攪拌溶解后，再加入蒸餾水使溶液體積為5升，攪拌混勻，再加入0.5%氯化鈣溶液50毫升，攪拌混勻，然后用30%醋酸緩沖液調(diào)pH至5.25.4，加熱煮沸15分鐘后，冷卻至室溫。將上述溶液置2224'C恒溫水浴中，攪拌約半小時，待溶液內(nèi)溫恒定在上述范圍時，加入酶液(活性同實施例1)50,000IU(即109.6毫升)，攪拌混勾，并用10n/。醋酸調(diào)pH至5.25.4范圍，繼續(xù)攪拌，并將轉(zhuǎn)速調(diào)至4060轉(zhuǎn)/分，每攪拌l小時后，可停半小時，直至粘度達到5,00015，000時即可加熱終止反應。反應物的分離、純化和濃縮過程與實施例l相同。本例終點產(chǎn)物體積為3400毫升，濃度為14.8%，得率為80.5%，質(zhì)量分析表明產(chǎn)品外觀為無色透明液體，固含物14.8%，灰分0.77%，pH6.0，動力粘度11250CPS。實施例3將250升帶夾層的不銹鋼反應罐清洗干凈，并用高壓蒸氣消毒15分鐘后。加二級反滲透純水50升，在攪拌條件下，加入20公斤優(yōu)質(zhì)蔗糖，待完全溶解后，再加純水至體積達100升。再加入5%氯化鈣溶液100毫升，攪拌混勻后，再用30。/。醋酸緩沖液調(diào)pH至5.25.4。然后開啟溫控系統(tǒng)，使夾層溫度在2426"C范圍，繼續(xù)攪拌半小時，待溶液溫度達到平衡狀態(tài)時，加入酶液(本批酶活性480IU/ml)12xl05IU(即2500毫升)，攪拌混勻，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速在5080轉(zhuǎn)/分范圍。每攪拌2小時，停半小時，維持溫度在2426'C，持續(xù)反應至25小時后，開始測定產(chǎn)物的粘度，以后每隔1小時測定一次至粘度達到30，00045,000時，即可加熱至809(TCl小時，以終止反應，然后通過框壓濾機或袋式濾機過濾，除去雜質(zhì)。再用100升95%乙醇或甲醇沉淀，靜置1小時后，吸去上層酒精至回收塔，下層沉淀加適量純水使溶并將體積調(diào)至100升左右，再加100升95%乙醇或甲醇進行第二次沉淀。必要時可進行第三次沉淀(方法同上)。當還原糖測定合格時，即可將沉淀溶解后，轉(zhuǎn)入真空濃縮罐濃縮至14%16%范圍。本例所得產(chǎn)品容積為54升，濃度為15.3%，得率為82.6%，質(zhì)量分析表明產(chǎn)品外觀為無色透明粘膠液，固含物15.3%，灰分0.93%，pH5.7，動力粘度40100CPS。實施例43000升閉式搪玻璃雙層反應罐，清洗干凈，并用高壓蒸氣消毒15分鐘，再用純水漂洗一次，然后關(guān)閉出口閥門，加入純水500升，在攪拌條件下加入優(yōu)質(zhì)蔗糖150公斤，攪拌使溶，再加純水至總體積1000升?；靹蚝笤偌尤?%氯化鈣溶液1000毫升，攪拌混勻，再用30%醋酸緩沖液調(diào)pH至5.25.4，并持續(xù)低速攪拌。然后開啟蒸氣，升溫至溶液沸騰15分鐘后降溫至25°C。待反應罐內(nèi)溶液溫度穩(wěn)定后，按14IU/ml加入酶液。本例反應液應加酶14xl06IU(相當于29.2升活性為480IU/ml酶液)。加完酶液后加蓋，并維持操作環(huán)境潔凈，調(diào)節(jié)并維持溫度在2426"C范圍，持續(xù)攪拌，開始時轉(zhuǎn)速不必太快，隨著反應物粘度增加，轉(zhuǎn)速應適當加快(6080轉(zhuǎn)/分)，至粘度太高，轉(zhuǎn)動困難時可通入過濾空氣，以加快反應速度。一般在反應28小時后，應每隔1小時測定反應物粘度一次，直至粘度達到60,000以上時，即可加熱終止反應。然后用板框壓濾機或袋式過濾機過濾除雜，再用有機溶劑沉淀或超濾方法進行純化，方法已如前述。本例終點產(chǎn)物容積600升，濃度10.5%，得率84%，質(zhì)量分析產(chǎn)品外觀為無色粘膠狀液體，固含物10.5%，灰分0.88%，pH6.2，動力粘度65,000CPS(25。C10°/。)。權(quán)利要求1.一種制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，包括如下步驟(1)根據(jù)水處理中對多糖生物絮凝劑動力粘度的要求，配制具體濃度的蔗糖溶液；(2)在蔗糖溶液中加入氯化鈣溶液；(3)用30％醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)上述溶液的pH值在5.2～5.4范圍；(4)向上述溶液中加入適量的葡聚糖蔗糖酶溶液，混勻后，用10％醋酸調(diào)節(jié)pH值在5.2～5.4范圍；(5)將上述溶液置于恒溫水浴中，調(diào)節(jié)攪拌，充分反應直至溶液達到所要求的動力粘度；(6)對反應產(chǎn)物進行加熱滅菌，過濾除雜，純化濃縮后即得最終產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求1所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(1)中共配制四種不同濃度的蔗糖溶液，分別為第一種0.80mol/L、第二種0.73mol/L、第三種0.58mol/L、第四種0.44mol/Lo3.如權(quán)利要求1所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(2)中每100ml蔗糖溶液加入1毫升0.5%的氯化鈣溶液。4.如權(quán)利要求1所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于步驟(3)調(diào)節(jié)完pH值后，將溶液高壓消毒或煮沸15分鐘后，冷卻備用。5.如權(quán)利要求2所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(4)中，根據(jù)四種不同濃度的蔗糖溶液，加入的葡聚糖蔗糖酶溶液依次分別為每100ml蔗糖溶液加入800、1000、1200和1400國際單位的酶液。6.如權(quán)利要求2或5所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于步驟(5)中四種不同濃度的溶液分別置于的水浴溫度依次為2022。C、2224°C、2426°C、2426°C。7.如權(quán)利要求6所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于步驟(5)中四種不同濃度的溶液的動力粘度依次為第一種30005000CPS,第二種500015000CPS,第三種3000045000CPS,第四種6000080000CPS。8.如權(quán)利要求1所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(6)中加熱滅菌時，溫度控制在8090。C并持續(xù)攪拌1小時，然后降溫至40'C以下。9.如權(quán)利要求1或8所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(6)中純化濃縮的方法為沉淀法，將過濾后的濾液用1倍體積95%以上濃度的甲醇或乙醇或異丙醇進行沉淀，沉淀后靜置l小時以上，然后吸去上清液；再將沉淀溶解于蒸餾水中，使產(chǎn)物濃度不低于10%，再用等體積甲醇或乙醇或異丙醇進行第二次沉淀；如此重復，直至樣品的還原糖含量低于1%，則將沉淀用蒸餾水或純水溶解，加熱除去有機溶劑，并真空濃縮至15%濃度。10.如權(quán)利要求1或8所述的制備多糖生物絮凝劑的酶學方法，其特征在于在步驟(6)中純化濃縮的方法為超濾膜循環(huán)過濾法，物料的濃度為1%2%，循環(huán)過濾直至樣品的還原糖含量低于1%，然后將沉淀用蒸餾水或純水溶解，加熱除去有機溶劑，并真空濃縮至15%濃度。全文摘要本發(fā)明屬于環(huán)保類水處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種制備多糖生物絮凝劑的酶學方法。該方法根據(jù)產(chǎn)品不同分子量的要求，制備不同的底物濃度的蔗糖溶液，然后加入1％的氯化鈣溶液，并用30％醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH在5.2～5.4；調(diào)節(jié)加入的酶量并調(diào)節(jié)pH至上述范圍；同時，對溫度、攪拌速度和反應時間等反應條件進行控制；通過測定動力粘度，決定終點以停止反應，然后采用乙醇或甲醇或異丙醇沉淀，或用超濾膜系統(tǒng)進行分離純化，使不同分子量產(chǎn)品的各項技術(shù)指標完全達到國際市場關(guān)于新型多糖生物絮凝劑的質(zhì)量標準。本發(fā)明可以合成可控分子量，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝劑產(chǎn)品，可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12P19/04GK101392280SQ200710152150公開日2009年3月25日申請日期2007年9月18日優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日發(fā)明者莊漢忠申請人:莊茅