專利名稱：：一種鼠李糖脂生物發(fā)酵液的工業(yè)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物表面活性劑的生產(chǎn)方法，尤其是一種鼠李糖脂生物發(fā)酵液的工業(yè)化制備方法。技術(shù)背景.-鼠李糖脂屬于一種糖脂類表面活性劑，是在發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)到一定階段在適宜的條件下產(chǎn)生的一種胞外代謝產(chǎn)物，它是生物表面活性劑中效果較好的一種，同其它合成的表面活性劑一樣，其分子結(jié)構(gòu)具有親水和疏水兩種性能，并能降低表面張力，同時(shí)它有自己的特點(diǎn)具有很高的生物降解性和更低的生物毒性、低的臨界膠束濃度和更高的表面活性、吸收逐步、活性持續(xù)等特點(diǎn)。目前鼠李糖脂的研究一直都處在室內(nèi)研究階段，沒有形成工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模并且發(fā)酵液鼠李糖脂含量低。目前，生產(chǎn)鼠李糖脂大多采用微生物發(fā)酵法，但僅限于實(shí)驗(yàn)室階段，尚為進(jìn)入工業(yè)化大生產(chǎn)階段且沒有與之相匹配的制備方法，并且現(xiàn)有的制備方法效率低、成本高及含量低，因此應(yīng)用受到限制。
發(fā)明內(nèi)容為了克服
背景技術(shù)：
的不足，本發(fā)明提供一種新型的鼠李糖脂生物發(fā)酵液的工業(yè)化生產(chǎn)方法，這種生產(chǎn)工藝具有產(chǎn)量高、效率高、裝料系數(shù)高、發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單，使產(chǎn)品綜合成本降低，完全適合工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)鼠李糖脂生物表面活性劑的推廣及大規(guī)模應(yīng)用起到了重要的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是該鼠李糖脂發(fā)酵液是由在石油污染的土壤中提取并經(jīng)過分離純化得到的銅綠假單胞菌經(jīng)亞硝基胍誘變發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生，該生物材料分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、保藏編號(hào)為CGMCC2200、保藏日期為2007年10月17曰、保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心、地址北為京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，具體發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下A、菌種VTS—1接入搖瓶培養(yǎng)，溫度為32士2。C、120轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)1216小時(shí)，得到搖瓶菌種；B、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將A步驟中的搖瓶菌種按5%10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的一級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32士2。C、pH6.57.5、通風(fēng)比1:0.51及攪拌速度為100150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)1018小時(shí)，得到一級(jí)發(fā)酵菌種；C、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將B步驟中的一級(jí)發(fā)酵菌種按59&10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32±2°C、pH6.57.5、通風(fēng)比l:0.5l及攪拌速度為100150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)1018小時(shí)，得到二級(jí)發(fā)酵菌種；D、發(fā)酵培養(yǎng)將C步驟中的二級(jí)發(fā)酵菌種按5%10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的三級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32±2°〇、pH6.57.5、通風(fēng)比1:0.51、攪拌速度為100150轉(zhuǎn)/分及補(bǔ)料條件下發(fā)酵培養(yǎng)4555小時(shí)，再進(jìn)行8(TC滅菌得到鼠李糖脂發(fā)酵液。上述的斜面培養(yǎng)基配方牛肉膏O.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、瓊脂2%，其余為蒸餾水，pH6.2;搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方玉米油25%、尿素0.21.5%、糖蜜1520%、KC10.051.0%、0.051.2%、K2HP040.051.5%、酵母膏0.0050.1%及復(fù)合微量元素O.0050.0淺，余量為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.0g/L及溶劑水復(fù)配而成；步驟D中所補(bǔ)的料是玉米油，每次補(bǔ)料量為1%5%;各級(jí)發(fā)酵罐的裝料系數(shù)是6075%。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明是通過特定的微生物在適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、工藝控制等條件下和工藝下進(jìn)行微生物發(fā)酵培養(yǎng)得到的一種生物發(fā)酵液。整個(gè)生產(chǎn)制備過程是逐級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵純培養(yǎng)的過程。得到的鼠李糖脂生物表面活性劑發(fā)酵液經(jīng)過殺菌和離心分離后，根據(jù)各種用途的需要純化成不同等級(jí)的產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于三次采油、日化、農(nóng)藥、食品、土壤修復(fù)等行業(yè)。該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的鼠李糖脂生物表面活性劑，具有產(chǎn)量高、周期短、裝料系數(shù)高、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂生物表面活性劑的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(l)本發(fā)明首次將化學(xué)誘變方法應(yīng)用與假單胞菌，并且成功得到了一株鼠李糖脂高產(chǎn)菌株P(guān)seudomonassp.VTS—1，為將來的基因工程改造假單胞菌奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)；(2)本發(fā)明的鼠李糖脂含量達(dá)到3545g/L，并取得了工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的成功，發(fā)酵周期縮短到50小時(shí)，大大降低了生產(chǎn)成本；(3)本發(fā)明首次將工業(yè)化生產(chǎn)的鼠李糖脂發(fā)酵液應(yīng)用現(xiàn)場(chǎng)，將其注入地下油層，使原來難以注水的區(qū)塊水順利注入，并且使原油采收率提高了37%;效率高。圖1為吸光度曲線。圖2生物表面活性劑在不同濃度時(shí)的界面張力值。具體實(shí)施方式-下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例l、化學(xué)誘變法篩選高產(chǎn)菌株下述實(shí)驗(yàn)中用的培養(yǎng)基如下富集培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、雙蒸水1000mL及瓊脂20g，pH7.07.2。血瓊脂平板培養(yǎng)基此培養(yǎng)基購于北京益德益華科技有限公司；藍(lán)瓊脂平板培養(yǎng)基硫酸銨O.1%，硝酸鈉0.2%，硫酸鎂0.03%，磷酸二氫鉀1%，磷酸氫二鈉0.4%，酵母粉0.05%及余量水，pH7.07.2，浸有原油的粗濾紙。篩選步驟-1、菌株的富集培養(yǎng)稱取長(zhǎng)期受原油污染的土壤1g溶到100ml無菌水后，吸取1mL接入于富集培養(yǎng)基中，置37"C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2、分離純化將富集培養(yǎng)后得到的菌懸液吸取0.2ml菌懸液進(jìn)行血瓊脂平板涂布，于37'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，挑選菌落周圍溶血圈大的菌株搖瓶培養(yǎng)后采用相同的方法涂布到藍(lán)平板后分離純化培養(yǎng)48小時(shí)。3、誘變改良在上述方法篩選到的菌種制成菌懸液后涂布到平板后，在平板內(nèi)邊緣放上少許亞硝基胍晶體，倒置37i:恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，觀察亞硝基胍周圍的抑菌圈情況，誘變后挑取僅靠抑菌圈外側(cè)少許菌苔到LB培養(yǎng)基中制成菌懸液，37'C震蕩培養(yǎng)過夜，再取少量過夜培養(yǎng)的菌懸液涂布平板，培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定鼠李糖脂含量、發(fā)酵液表面張力及驅(qū)油效果，結(jié)果如下-(1)、發(fā)酵液中鼠李糖脂表面活性劑的比色法檢測(cè)含量顯色液配制A試齊!J:60X濃H2S04，B試劑1.6%3，5-二羥基甲苯，用之前7.5A:1B混合。A.制備標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。B.發(fā)酵液中生物表面活性劑檢測(cè)(a)、發(fā)酵液搖勻，取lml，用去離子水稀釋至6ml(稀釋6倍)；取上述稀釋溶液0.1ml，稀釋至5ml(稀釋50倍，可先加入5ral蒸餾水，從中吸出0.1ml蒸餾水，再加入稀釋后的溶液0.1ml);累計(jì)稀釋300倍。(b)、取稀釋后的溶液0.5ml，加顯色液4.5ml，混勻(做兩個(gè)平行樣)。(c)、空白樣0.5ml蒸餾水，加顯色液4.5ml，混勻。(d)、水浴加熱至8(TC，30min，取出冷水浴迅速冷卻至室溫后421nm檢測(cè)0D值，先用空白樣校零，后用少許待測(cè)樣潤(rùn)洗后，再測(cè)待測(cè)樣0D值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算出發(fā)酵液中生物表面活性劑的含量。(曲線對(duì)應(yīng)的含量X300+1000二最后含量g/L)。(2)、生物表面活性的界面張力檢測(cè)A.實(shí)驗(yàn)儀器JJ2000B型旋轉(zhuǎn)滴界面張力測(cè)量?jī)x、萬分之一天平、電子秤、燒杯、吸管等。B.實(shí)驗(yàn)材料生物表面活性劑VTS-1菌的發(fā)酵液濃度為0.051%、水大慶油田地層水、原油大慶原油，密度為0.8806g/m:'。C.檢測(cè)方法參見中華人民共和國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T5370-1999。D.檢測(cè)結(jié)果生物表面活性劑濃度為0.051.0%時(shí)與大慶原油之間的界面張力值見圖2。(3)、室內(nèi)驅(qū)油實(shí)驗(yàn)A.實(shí)驗(yàn)材料人造均質(zhì)巖心Y:①9.18X2.5cm;大慶原油密度為0.84g/ml、粘度值為18mp's;大慶油田地層水。藥劑鼠李糖脂表面活性劑復(fù)合體系配方為鼠李糖脂發(fā)酵液(1%)十木質(zhì)素磺酸鹽(0.2%)+碳酸鈉(1.2%)+余量水。B.模擬地質(zhì)條件采用人造均質(zhì)巖芯，其水相滲透率150200md;油層溫度50。C。C.實(shí)驗(yàn)方法參見中華人民共和國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T5336—1996。D.驅(qū)油結(jié)果見下表l表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>總結(jié)經(jīng)此種方法篩選到一株能以原油為碳源的銅綠假單胞菌(PseudomonasspVTS—1，菌種保藏號(hào)為CGMCC2200，其經(jīng)發(fā)酵后鼠李糖脂含量可達(dá)到3545g/L，45°C0.051%濃度的發(fā)酵液能使原油與地層水界面張力降低至0.40.7mN/m，在水相有效滲透率150一200md、殘余油飽和度4655%、注入量為0.4pv鼠李糖脂發(fā)酵液濃度為1%、5(TC的條件下，原油采收率比水驅(qū)提高了15.5%左右。4、小試搖瓶實(shí)驗(yàn)將誘變后菌種接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基上37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接入到滅好菌的一級(jí)種子培養(yǎng)基中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為130rpm、溫度為30士2。C。將培養(yǎng)24h的一級(jí)種瓶轉(zhuǎn)接至二級(jí)發(fā)酵種瓶中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)5d，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為130rpm、溫度為37t:，在第四天利用上述的比色法檢測(cè)含量為40.5g/L。實(shí)施例2、工業(yè)化方法生產(chǎn)鼠李糖脂生物發(fā)酵液-搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為玉米油2%、尿素1%、糖蜜15%、KC10.1%、KH2P040.05%、K2HP040.3%、酵母膏0.005%、復(fù)合微量元素0.008%,其余為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.0g/L及溶劑水復(fù)配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)利用實(shí)施例l所得的斜面菌種，培養(yǎng)30h，轉(zhuǎn)接入5L搖瓶(裝入2L培養(yǎng)基)，接種量5%(菌液濃度在0Dfi。=0.81.0)、溫度為32±2°C、120rpm培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接入500升的一級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為70%，接種量5%、溫度為32±2°C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入3.5噸二級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為70%，接種量5%、溫度為32士2'C、通風(fēng)比為1:1、PH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入30噸三級(jí)發(fā)酵罐，裝料量為20噸，三級(jí)發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度32土2。C、滅菌前pH調(diào)到6左右，后期用0.245噸NaOH將pH控制在6以上，通風(fēng)比為1:1、攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm，期間累計(jì)補(bǔ)加2.0噸玉米油，發(fā)酵培養(yǎng)50小時(shí)后用比色法檢測(cè)鼠李糖脂含量為39.5g/L。實(shí)施例3、工業(yè)化方法生產(chǎn)鼠李糖脂生物發(fā)酵液-搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為玉米油3%、尿素1.5%、糖蜜17%、KC11.0%、KH2P040.2%、K2HP0J.5%、酵母膏0.02%、復(fù)合微量元素0.01%，其余為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.Og/L及溶劑水復(fù)配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)利用實(shí)施例1所得的斜面菌種，培養(yǎng)30h，轉(zhuǎn)接入5L搖瓶(裝入2L培養(yǎng)基)，接種量5%、32±2°C、120rpm培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)接入500升的一級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為67%,接種量5%、32±2°C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入3.5噸二級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為67%，接種量5%、32土2。C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入30噸三級(jí)發(fā)酵罐，裝料量為20噸，三級(jí)發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度32±2°C、滅菌前pH調(diào)到6左右，后期用0.210噸NaOH將pH控制在6以上，通風(fēng)比為l:1、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，期間累計(jì)補(bǔ)加玉米油1.9噸，發(fā)酵培養(yǎng)54小時(shí)后用比色法檢測(cè)鼠李糖脂含量為37.8g/L。實(shí)施例4、工業(yè)化方法生產(chǎn)鼠李糖脂生物發(fā)酵液搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為玉米油5%、尿素0.2%、糖蜜20%、KC10.05%、KH2P0".2%、K2HP040.05%、酵母膏0.1%、復(fù)合微量元素0.005%，其余為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.0g/L及溶劑水復(fù)配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)利用實(shí)施例1所得的斜面菌種，培養(yǎng)30h，轉(zhuǎn)接入5L搖瓶(裝入2L培養(yǎng)基)，接種量5%、32士2。C、120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入500升的一級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為60%，接種量5%、32±2°C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入3.5噸二級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為60%，接種量5%、32±2°C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入30噸三級(jí)發(fā)酵罐，裝料量為18噸，三級(jí)發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度32士2。C、滅菌前pH調(diào)到6左右，后期用0.185噸NaOH將pH控制在6以上，通風(fēng)比為1:1、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，期間累計(jì)補(bǔ)加玉米油1.8噸，發(fā)酵培養(yǎng)52小時(shí)后用比色法檢測(cè)鼠李糖脂含量為40.4g/L。實(shí)施例5、工業(yè)化方法生產(chǎn)鼠李糖脂生物發(fā)酵液搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為玉米油3%、尿素1%、糖蜜20%、KC10.5%、KH2P040.5%、K2HP040.5%、酵母膏0.05%及復(fù)合微量元素0.005%，其余為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.0g/L及溶劑水復(fù)配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)利用實(shí)施例1所得的斜面菌種，培養(yǎng)30h，轉(zhuǎn)接入5L搖瓶(裝入2L培養(yǎng)基)，接種量5%、32士2。C、120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入500升的一級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為75%,接種量5%、32±2°C、通風(fēng)比為1:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入3.5噸二級(jí)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為75%，接種量5%、32士2'C、通風(fēng)比為l:1、pH為6.57.5、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入30噸三級(jí)發(fā)酵罐，裝料量為22.5噸，三級(jí)發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度32±2'C、滅菌前pH調(diào)到6左右，后期用0.255噸NaOH將pH控制在6以上，通風(fēng)比為l:1、攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，期間累計(jì)補(bǔ)加玉米油1.8噸，發(fā)酵培養(yǎng)55小時(shí)后用比色法檢測(cè)鼠李糖脂含量為42.7g/L。由上述幾個(gè)實(shí)例可以看出釆用此生產(chǎn)工藝發(fā)酵鼠李糖脂含量可達(dá)到35—45g/L。實(shí)施例6、鼠李糖脂表面活性劑驅(qū)油現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)2007年4月將鼠李糖脂表面活性劑復(fù)合體系配方鼠李糖脂發(fā)酵液(1%)+木質(zhì)素磺酸鹽(0.2%)+碳酸鈉(1.2%)+余量水對(duì)大慶油田采油五廠杏13-33-26井區(qū)的4口注水井(杏13-33-25、杏13-丁3-28、杏13-丁4-26、杏13-33-28)進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)驅(qū)油試驗(yàn)。杏十三區(qū)過渡帶位于大慶長(zhǎng)垣杏樹崗油田最南端，原始地層壓力11.27MPa，飽和壓力6.28MPa，該井區(qū)共有油水井14口，其中油井10口，水井4口，布井面積O.3445km2，控制地質(zhì)儲(chǔ)量6.3116X104t，截止至i』2007年4月份，該區(qū)日注水152m:i，日產(chǎn)液134t，日產(chǎn)油16.9t，綜合含水87.4%，流壓3.47MPa，累計(jì)注水26.8029X104m3，累計(jì)產(chǎn)油1.8353X104t，累計(jì)產(chǎn)水12.4661X10W,采出程度29.07%。這4口注水井均為杏十三區(qū)西部過渡帶擴(kuò)邊分層井，平均單井射開砂巖厚度為24.4m，有效厚度為6.4m，平均注水壓力12.8MPa，實(shí)際注入生物表面活性劑量見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>77.52.試驗(yàn)效果檢測(cè):現(xiàn)場(chǎng)注入生物表面活性劑3個(gè)月后，試驗(yàn)井組陸續(xù)見到驅(qū)油效果，井組日產(chǎn)油由16.9t上升到20.5t。杏13-丁3-26井日產(chǎn)液由驅(qū)油前的2.2t上升到2007年10月的3.0t，與試驗(yàn)前對(duì)比，單井日增油0.9t，含水保持穩(wěn)定。10口油井全部獲得增產(chǎn)，截止2007年10月底井組增油1893.4噸。生物表面活性劑驅(qū)油試驗(yàn)區(qū)4口水井周圍油井增油量表表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明中假單胞菌VTS-l在發(fā)明中所提的配方和工藝條件下得到的鼠李糖脂發(fā)酵液復(fù)合體系在7個(gè)月時(shí)間內(nèi)效果明顯，日增產(chǎn)原油約0.9噸/口井。權(quán)利要求1、一種鼠李糖脂生物發(fā)酵液的制備方法，其特征在于該鼠李糖脂發(fā)酵液是由在石油污染的土壤中提取并經(jīng)過分離純化得到的銅綠假單胞菌再經(jīng)亞硝基胍誘變后得到銅綠假單胞菌VTS-1(Pseudomonassp.VTS-1)保藏編號(hào)為CGMCC2200，具體發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下A、菌種VTS-1接入搖瓶培養(yǎng)，溫度為32±2℃、120轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)，得到搖瓶菌種；B、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將A步驟中的搖瓶菌種按5％～10％的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的一級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32±2℃、pH6.5～7.5、通風(fēng)比1∶0.5～1及攪拌速度為100～150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10～18小時(shí)，得到一級(jí)發(fā)酵菌種；C、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將B步驟中的一級(jí)發(fā)酵菌種按5％～10％的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32±2℃、pH6.5～7.5、通風(fēng)比1∶0.5～1及攪拌速度為100～150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10～18小時(shí)，得到二級(jí)發(fā)酵菌種；D、發(fā)酵培養(yǎng)將C步驟中的二級(jí)發(fā)酵菌種按5％～10％的接種量轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的三級(jí)發(fā)酵罐中，在溫度為32±2℃、pH6.5～7.5、通風(fēng)比1∶0.5～1、攪拌速度為100～150轉(zhuǎn)/分及補(bǔ)料條件下發(fā)酵培養(yǎng)45～55小時(shí)，再進(jìn)行80℃滅菌得到鼠李糖脂發(fā)酵液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠李糖脂生物發(fā)酵液的制備方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基配方牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、瓊脂2%，其余為蒸餾水，pH6.2;搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方玉米油25%、尿素0.21.5%、糖蜜1520%、KC10.051.0%、KH2P040.051.20/0、K2HP040.051.5%、酵母膏0.0050.1%及復(fù)合微量元素0.0050.01%，余量為水，pH為6.5，所述的復(fù)合微量元素為Zn1.5g/L、Cu1.0g/L、Mn1.0g/L、Se1.5g/L、Co1.0g/L及溶劑水復(fù)配而成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠李糖脂生物表面活性劑的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟D中所補(bǔ)的料是玉米油，每次補(bǔ)料量為1%5。/。。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠李糖脂生物發(fā)酵液的制備方法，其特征在于各級(jí)發(fā)酵罐的裝料系數(shù)是6075%。全文摘要本發(fā)明涉及一種鼠李糖脂生物發(fā)酵液的制備方法。該方法包括下列步驟在石油污染的土壤中提取并經(jīng)過分離純化得到的銅綠假單胞菌，該菌種經(jīng)亞硝基胍誘變后得到銅綠假單胞菌VTS-1(Pseudomonassp.VTS-1)保藏編號(hào)為CGMCC2200，具體發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下A.菌種VTS-1接入搖瓶培養(yǎng)；B.一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)；C.二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)；D.發(fā)酵培養(yǎng)。該方法工藝具有產(chǎn)量高、效率高、裝料系數(shù)高、發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單，使產(chǎn)品綜合成本降低，完全適合工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)鼠李糖脂生物表面活性劑的推廣及大規(guī)模應(yīng)用起到了重要的作用。文檔編號(hào)C12P19/02GK101177696SQ20071016651公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者康婷婷,徐遠(yuǎn)洋,偉李,李玉梅,超沈,沈玉江,芳王,金艷芳,陳韶軍,馬艷玲申請(qǐng)人:大慶沃太斯化工有限公司