專利名稱：：使用新型乳酸菌生產發(fā)酵乳的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及使用屬于乳球菌屬(Xac/ococw"的新型乳酸菌生產發(fā)酵乳的方法以及根據該生產方法制備的發(fā)酵乳。本申請要求2007年2月13曰提交的曰本特愿2007-032646號的優(yōu)先權，該申請的內容在本文引入供參考。
背景技術：
：7>《口長只又jt支才干菌屬菌(_&//Y<ic>^acfei^'u/iz7ozz^"utz)、？又A支桿菌(^W^^c"hwm9屬菌(以下稱為"雙歧桿菌")是在人腸道內形成的腸道菌群的優(yōu)勢菌種之一，已知雙歧桿菌具有恢復腸內細菌平衡的調整腸道作用、免疫增強作用、抗癌作用等。因此，近年來隨著消費者健康意識的提高，對雙歧桿菌發(fā)酵乳等包含存活的雙歧桿菌的發(fā)酵乳食品的需求增加。雙歧桿菌在乳性培養(yǎng)基中的增殖性差。因此，為了在發(fā)酵乳中含有一定量的例如1x10化FU/mL的雙歧桿菌，通常添加各種各樣繁殖促進物質。但是，該繁殖促進物質通常價格比較高，并且，風味可能會受損。另外，雙歧桿菌難以在酸性條件下保存、易死亡。因此，發(fā)酵乳制品等在流通過程中，其中存活的雙歧桿菌量急劇減少。因此，通過改善雙歧桿菌的繁殖性、保存生存性，不但可制造出大量含有存活的雙歧桿菌的發(fā)酵乳，而且期待即使在消費者食用時，也與剛制造完時同樣富含存活的雙歧桿菌。已公開了通過與雙歧桿菌以外的乳酸菌混合發(fā)酵，不添加該繁殖促進物質等也可改善雙歧桿菌的繁殖性、保存生存性的種種方法。關于改善發(fā)酵乳制造中的雙歧桿菌繁殖性的方法，例如(1)公開了酸奶及其制造方法，其特征在于，其含有乳酸享L-求菌乳酉臾亞種fZ^"ococcM51/<3c/&subsp./a"/s入孝L酉交乳5求菌乳月旨亞種f丄a"ococcj^/a"/ssubsp.cremo"^J以及又又A支才干菌(例如參照專利文獻l。)。此外，關于改善發(fā)酵乳中的雙歧桿菌保存生存性的方法，例如(2)公開了雙歧桿菌發(fā)酵乳的制造方法，其特征在于，在以乳為主成分的培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)短雙歧桿菌("5(/^o6ac/e〃'wmZ>ve人以及不生成雙乙酰和乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亞種。(例如參照專利文獻2。)專利文獻l:日本特許第3364491號7>才艮專利文獻2:日本特許第3068484號公才艮
發(fā)明內容發(fā)明要解決的問題可是，上述(1)的方法雖可促進雙歧桿菌的繁殖、縮短發(fā)酵時間，但在專利文獻l中，關于雙歧桿菌的保存生存性根本沒有記載。另一方面，上述(2)的方法通過使用由特定的雙歧桿菌和特定的乳酸菌組成的混合菌，雖可以看到促進增殖的效果和改善生存性的效果，但對于短雙歧桿菌以外的雙歧桿菌、例如在食品方面廣泛應用的長雙歧桿菌根本沒有記載。本發(fā)明的目的在于提供使用可改善雙歧桿菌的繁殖性和保存生存性的乳酸菌來生產發(fā)酵乳的方法以及通過該生產方法制備的發(fā)酵乳。用于解決問題的方法
技術領域：
：本發(fā)明人為了解決上述問題進行了深入研究，結果，對在10%(w/w)復原脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵性優(yōu)異的乳酸菌的菌抹，與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)進行發(fā)酵試驗，發(fā)現具有如下性質的乳酸菌，其性質為促進長雙歧桿菌繁殖的性能，即，pH達到4.44.6時，長雙歧桿菌的菌數在5xl()SCFU/g以上；提高長雙歧桿菌的保存生存性的性能，即，發(fā)酵結束后快速冷卻并在10。C下保持2周時，長雙歧桿菌的存活率在30%以上，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供生產發(fā)酵乳的方法，其特征在于，使用雙歧桿菌(B(/^M"c&hww)屬菌和具有下述細菌學性質的乳球菌(La"ococcw)屬菌作為乳酸菌進行發(fā)酵。(l)發(fā)酵性，即，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中、在25-37。C的溫度范圍內培養(yǎng)16小時的情況下，使培養(yǎng)基凝固；(2)促進長雙歧桿菌繁殖的性能，即，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時，長雙歧桿菌的菌數達到5xl08CFU/g以上，以及(3)提高長雙歧桿菌的保存生存性的性能，即，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時快速冷卻后在l(TC下保持2周時，長雙歧桿菌的存活率達到30%以上。另外，本發(fā)明提供發(fā)酵乳的生產方法，其中，上述乳球菌屬菌不具有同化木糖的能力，而且，不生成雙乙酰和乙偶姻。本發(fā)明還提供生產發(fā)酵乳的方法，其中，上述乳球菌屬菌是孝L酉臾吝丄5求菌享L酉臾亞牙中(丄ac/ococcws/ac〃ssubs.p.本發(fā)明還提供了生產發(fā)酵乳的方法，其中，上述乳球菌屬菌的菌抹是選自由乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852(FERMBP—10742)、乳酉吏乳3求菌乳酉交亞種MCC857(FEHMBP—10757)、乳酸乳球菌乳酸亞種MCC859(FERMBP-10744)、乳酸乳J求菌乳酸亞種MCC865(FERMBP-10745)和乳酸乳^求菌乳酸亞種MCC866(FERMBP-10746)所組成的組中的一種以上。本發(fā)明還提供生產發(fā)酵乳的方法，其中，上述雙歧桿菌屬菌是長又又it支斥干菌(^W^/oZmc/en'WW/0WgWW7)。本發(fā)明還提供生產發(fā)酵乳的方法，其中，上述長雙歧桿菌的菌4朱為長雙歧桿菌FERMBP-7787。本發(fā)明還提供生產發(fā)酵乳的方法，其特征在于，進一步使用嗜熱《連5求菌(5^e/^ococcz^Aermop/zz'/t^)禾口{呆力口利亞專'l^干菌(丄(3"o6"C/〃M516w/g"r/CWS)4乍為上述享L酉臾菌。本發(fā)明還提供通過上述任何一種生產發(fā)酵乳的方法所制備的發(fā)酵乳。發(fā)明效果根據本發(fā)明的發(fā)酵乳的生產方法，可高效制造目前沒有的大量含有雙歧桿菌特別是長雙歧桿菌的發(fā)酵乳。另外，本發(fā)明的發(fā)酵乳，即使在流通過程中也可充分維持存活的雙歧桿菌特別是長雙歧桿菌的含量，因此調整腸道效果更高，在健康維護方面也有用。具體實施例方式本發(fā)明是生產發(fā)酵乳的方法，特征在于使用雙歧桿菌與具有上述(1)、(2)和(3)的特性的乳球菌屬菌進行發(fā)酵。尤其適合于使用長雙歧桿菌發(fā)酵生產發(fā)酵乳。本發(fā)明中所使用的長雙歧桿菌為長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹，長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌抹等。長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹由于在乳性培養(yǎng)基中的發(fā)酵性、流通過程中的耐酸性以及耐胃酸性優(yōu)異，所以是特別優(yōu)選的。長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹于2001年10月31日保藏于獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東l丁目1番地1中央第6(由卩政編碼305-8566))。本發(fā)明中使用的乳球菌屬菌具有上述(1)、(2)和(3)的特性。(1)涉及發(fā)酵性。如果乳酸菌能夠快速增殖并具有強的發(fā)酵性，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中、在25-37。C的溫度范圍內培養(yǎng)16小時時能夠使培養(yǎng)基凝固，那么，在生產發(fā)酵乳時，可以更加有效地改善雙歧桿菌尤其是長雙歧桿菌的繁殖性等。這里的"使培養(yǎng)基凝固"是指，通過酸性發(fā)酵，培養(yǎng)基的pH低于乳蛋白的等電點，從而乳蛋白凝集、培養(yǎng)基凝固。另夕卜，"10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基"可以通過以10質量％的濃度將還原脫脂奶粉(例如，森永乳業(yè)公司生產)溶解在水中來制備。通常，適于乳球菌屬菌的發(fā)酵溫度范圍是20-30°C,但本發(fā)明中使用的乳球菌屬菌在25-37。C的溫度范圍內具有強大的發(fā)酵性。也就是說，本發(fā)明中使用的乳球菌屬菌，是在適于雙歧桿菌、尤其長雙歧桿菌的發(fā)酵溫度范圍(30-40°C)內具有充分發(fā)酵性的細菌。(2)涉及促進長雙歧桿菌繁殖的性能。如果10。/。(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基等乳性培養(yǎng)基的pH接近4.6,通常，所含有的酪蛋白等成分沉淀，培養(yǎng)基全部凝固，從而變得具有優(yōu)異的味道、口感和外觀的產品。因此，在生產發(fā)酵乳制品的情況下，通常，在pH達到4.6左右的時候，通過快速冷卻等方式來停止發(fā)酵。因此，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，如果乳酸菌所具有的繁殖促進性能使得在pH達到4.4-4.6時，長雙歧桿菌的菌數達到5x108CFU/g以上的高濃度，那么在生產發(fā)酵乳時，該乳酸菌可以更有效地改善發(fā)酵乳中的雙歧桿菌、尤其長雙歧桿菌的含量。(3)涉及提高長雙歧桿菌的保存生存性的性能。發(fā)酵乳制品的保質期在10。C以下的保存條件下通常為2周左右。因此，在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時快速冷卻后在10。C下保持2周，如果乳酸菌具有使長雙歧桿菌的存活率達到30%以上的提高保存生存性的性能，那么能夠生產即使在保質期結束時也含有充分量的雙歧桿菌、尤其長雙歧桿菌的發(fā)酵乳。本發(fā)明中所使用的乳球菌屬菌例如可以通過以下方法來獲得。首先，從各種試樣中分離出菌林，從中選擇在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中具有優(yōu)異發(fā)酵性的菌抹，即，具有在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中、在25-37。C的溫度范圍內培養(yǎng)16小時時，能夠使培養(yǎng)基凝固的發(fā)酵性。然后，進行所選擇的菌抹與長雙歧桿菌的混合培養(yǎng)試驗，選擇具有上述(2)和(3)所規(guī)定的促進雙歧桿菌繁殖的性能和提高保存生存性的性能的菌抹。進一步優(yōu)選的是選擇不具有木糖同化性和不產生雙乙酰和乙偶姻的菌才朱。下文將更詳細說明本發(fā)明。1、菌抹的獲得本發(fā)明人為了從自然界獲得具有上述性質的菌抹，將從日本國內的自然界采集的樣品用厭氧稀釋液(1980年叢文公司發(fā)行，光岡知足著"腸內菌的世界，，，第322頁，以下稱為參考文獻1)稀釋，涂布在Briggs肝肉湯(briggsliverbroth)(參見上述參考文獻1,第319頁)的平板上，在3(TC下厭氧培養(yǎng)。而且，在所得菌落中挑選顯示了鏈球菌形態(tài)而且通過涂布標本的顯微鏡觀察為革蘭氏陽性的菌抹。將所挑選的菌株劃線涂布在BL瓊脂培養(yǎng)平板上，用如上所述的方法反復厭氧培養(yǎng)，獲得純分離菌抹。使用下述方法即首先將這些菌抹在10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，獲得20抹具有上述(1)中規(guī)定的發(fā)酵性的菌抹。接著，與長雙歧桿菌進行混合培養(yǎng)試驗，獲得5抹菌抹，該5抹菌林具有在pH達到4.4-4.6時，能使長雙歧桿菌菌數達到5x108CFU/g以上的促進繁殖的性能，以及具有在pH達到4.4-4.6時快速冷卻后在l(TC下保持2周的情況下，能夠使長雙歧桿菌的存活率達到30%以上的提高保存生存性的性能。該5林菌林分別—皮命名為MCC852、MCC857、MCC859、MCC865和MCC866。2、細菌學性質以下示出了上述5抹菌抹的細菌學性質。另外，用于測定細菌學性質的試驗大體上根據Bergey，sManualofSystematicBacteriology,PeterH.A.Sneath編，第2巻，WilliamsandWilkinsCompany,1986年)進行。(I)細菌形態(tài)(在BL瓊脂培養(yǎng)平板上、在30。C下厭氧培養(yǎng)72小時之后通過光學顯微鏡觀察)大小直徑1~2微米形狀鏈球菌(II)革蘭氏染色陽性(III)石蕊牛奶凝固(IV)芽孢形成陰性(V)由葡萄糖產氣無(VI)運動性無(VII):過氧化氫酶活性陰性(VIII):精氨酸脫羧酶試驗陽性(IX):由檸檬酸產氣陰性(X):溫度壽丈感性(60。C下30分鐘和在65。C下30分鐘)在兩種情況下均壽文感(XI):葡萄糖降解產物L-乳酸[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述細菌學性質(I)-(XI)是所有前述5抹菌林共有的，而且也是乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌抹ATCC19435所共有的。表l分別示出了繁殖溫度(XII)、耐鹽性(XIII)、耐pH性(XIV)、耐亞曱基藍性(XV)、由精氨酸產氨的能力(XVI)和糖發(fā)酵性(XVII)。另外，使用光岡的糖發(fā)酵性用培養(yǎng)基(1974年，光岡知足著"乳酸菌的細菌學"，臨床檢查18,第1163-1172頁)對28種糖測試糖發(fā)酵性。從上述結果可以看出，上述5抹菌抹共同具有乳酸乳球菌乳酸亞種菌種所具有的細菌學性質。也就是說，該5抹菌林被確認是乳酸乳球菌乳酸亞種菌種。另一方面，從上述(XII)-(XVII)所示的細菌學性質可以得出，上述5抹菌抹，尤其，從沒有同化木糖的能力這一點來看，不同于乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌株。因此，申請人將上述5抹菌抹作為新型菌抹保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東l丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566))。乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852菌抹的保藏號是FERMBP-10742,乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌林的保藏號是FERMBP-10757,乳酸乳球菌乳酸亞種MCC859菌抹的保藏號是FERMBP-10744,乳酸乳球菌乳酸亞種MCC865菌抹的保藏號是FERMBP-10745,乳酸乳球菌乳酸亞種MCC866菌林的保藏號是FERMBP-10746。乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852、859、865和866于2006年12月1日保藏，乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857于2007年1月IO日保藏。3、在10。/。(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中的發(fā)酵性試驗將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在95。C下滅菌30分鐘，在該復原脫脂乳培養(yǎng)基中接種3%(V/V)的各菌抹的發(fā)酵劑，在25°C、30。C和37。C的每一種溫度下培養(yǎng)16小時。將所得培養(yǎng)液快速冷卻，測定凝固狀況、pH和所含的乳酸菌數量。乳酸菌數量使用市售BCP加計數瓊脂培養(yǎng)基(榮研機材公司制造)平板來測定。測定的結果在表2中示出。另外，使用專利文獻2中記載的乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌抹ATCC19435菌抹作為對照菌抹。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>在使用乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852、857、859、865和866的每一抹菌抹，即本發(fā)明中所使用的乳球菌屬菌的情況下，在任何一種溫度條件下，pH都降低到4.4-4.6,培養(yǎng)基凝固。另外，所含有的乳酸菌數量也在lxl0(9)CFU/g左右，因此具有非常好的增殖性、發(fā)酵性。另一方面，在使用乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌抹ATCC19435菌林的情況下，在任何一種溫度條件下，pH都在5.5以上，培養(yǎng)基未凝固。而且，與本發(fā)明的乳球菌屬菌比較，尤其在30℃以上，乳酸菌數量明顯減少。4、與長雙歧桿菌的混合培養(yǎng)試-驗(1)與長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹的混合培養(yǎng)試驗使用乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌林ATCC19435作為對照菌抹。首先，按照后面記載的實施例1中所述的方法，分別制備享L酉臾乳3求菌乳酉交亞種MCC852、857、859、865禾口866這5才朱菌抹每一菌抹的培養(yǎng)物以及長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹的培養(yǎng)物。另外，將1000mL的含有0.2%(W/W)酵母提取物(Difco公司生產)的10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基，在90。C下滅菌30分鐘，接種30ml的乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌林ATCC19435菌抹的培養(yǎng)物，在30。C下培養(yǎng)16小時，從而制備乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌抹ATCC19435菌抹的培養(yǎng)物。將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌IO分鐘，在該復原脫脂乳培養(yǎng)基上接種1%(V/V)的如以上所述制備的每一乳酸乳球菌乳酸亞種菌抹的培養(yǎng)物和1%(V/V)的長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹的培養(yǎng)物，在37°C下培養(yǎng)16小時，得到發(fā)酵乳。將該發(fā)酵乳快速冷卻，測定pH和所含有的雙歧桿菌數。另外，在10。C下保存2周，測定保存之后1周和2周的雙歧桿菌數。雙歧桿菌數通過TOS丙酸瓊脂培養(yǎng)基(由YAKULTPHARMACEUTICALINDUSTRYCO.,LTD.藥品工業(yè)公司制備)平板進行測定。測定結果在表3中示出。囷抹雙歧桿菌數量(CFU/g)pH發(fā)酵剛結束后1周后2周后發(fā)酵剛結束后MCC8525.5x1085.5x1084.52MCC8577.5x1086.5x1084.47MCC8596.8xl086.9x1085.7x1084.55MCC8658.3x1088.0x1087,3x1084,56MCC8666.4x1086.3x1084.42ATCC194351.2x108pH是5以上，不能過t行保存試驗分別采用乳酸乳J求菌乳酸亞種MCC852、857、859、865和866五林菌株的發(fā)酵乳，在發(fā)酵后pH大約為4.5,雙歧桿菌數量達到5xl()SCFU/g以上。另外，該發(fā)酵乳在10。C下保存2周時的雙歧桿菌存活率均為80%以上。另一方面，使用乳酸乳球菌乳酸亞種模式菌株ATCC19435菌林的發(fā)酵乳，不能進行發(fā)酵，發(fā)酵后pH為5.0以上，不能進行10。C下的保存試驗。而且，發(fā)酵剛結束之后的雙歧桿菌為大約lxl08CFU/g，與本發(fā)明的乳球菌屬菌相比明顯減少。因此，可以看出，與其它公知的乳酸乳J求菌乳酸亞種菌林相比，乳酸乳5求菌乳酸亞種MCC852、857、859、865和866五抹菌林對長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹的繁殖促進性能和提高保存生存性的性能更優(yōu)異。另外，還可以看出，在將專利文獻2中所述的不產生雙乙酰和乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亞種與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況與使用短雙歧桿菌的情況不同，既不能得到如專利文獻2中所述的雙歧桿菌的增殖促進效果，也不能得到生存性改善效果。(2)與長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌抹的混合培養(yǎng)試驗使用長雙歧桿菌FERMBP-7787菌林與長雙歧桿菌模式菌林ATCC15707菌抹，檢驗本發(fā)明中所使用的乳球菌屬菌對長雙歧桿菌的繁殖促進性能和提高保存期存活率的性能。首先，按照后面記載的實施例1中所述的方法，制備乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌才朱的培養(yǎng)物以及長雙ot支桿菌FERMBP-7787菌抹的培養(yǎng)物。另外，按照后面記載的實施例2中所述的方法，制備嗜熱《連5求菌(^SV"/^ococci^Z/^rmo/7/n7w51)禾口寸呆力口利亞享L才干菌(丄flf"oZac/〃M51Z)w/gar/cws)的混合i晉養(yǎng)物。另外，將含有0.2%(W/W)酵母提取物的11%(W/W)脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，在該脫脂乳培養(yǎng)基中接種10%(V/V)的長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌林的發(fā)酵劑，在37。C下培養(yǎng)至pH達到4.6,從而制備長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌林的培養(yǎng)物。將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌10分鐘。在該復原脫脂乳培養(yǎng)基上接種1%(V/V)如以上所述制備的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的培養(yǎng)物、1%(V/V)長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹的培養(yǎng)物或者1Q/。(V/V)長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌抹的培養(yǎng)物、以及0.01o/。(V/V)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)至pH達到4.6，得到發(fā)酵乳。將該發(fā)酵乳快速冷卻，測定所含有的雙歧桿菌數。另外，在10。C下保存2周，測定保存之后1周和2周的雙歧桿菌數。另一方面，作為對照，將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌10分鐘。在該復原脫脂乳培養(yǎng)基上接種1.5%(V/V)如上述那樣調制的長雙歧桿菌FERMBP-7787菌株的培養(yǎng)物或者1.5%(V/V)長雙歧桿菌模式菌4朱ATCC15707菌抹的培養(yǎng)物以及0.4%(V/V)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)至pH達到4.6，同樣地測定所得發(fā)酵乳的雙歧桿菌數。結果在表4中示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通過將長雙歧桿菌FERMBP-7787與長雙歧桿菌模式菌抹ATCC1570兩抹菌抹與乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌林混合培養(yǎng)，發(fā)酵乳中的雙歧桿菌數顯著增加。在10。C下保存2周后的雙歧桿菌存活率均為30%以上，其中長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹為71%,長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌林為31%。相反，在不與乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌林混合培養(yǎng)的情況下，在l(TC下保存2周后的雙歧桿菌的存活率為長雙歧桿菌FERMBP-7787菌4朱的存活率為20%,而長雙Jt支桿菌才莫式菌抹ATCC15707菌才朱沒有檢出存活的雙歧桿菌。另外，分別4吏用乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852、859、865或866菌抹代替乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌林，獲得了同樣的結果。即，可以看出乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852、857、859、865和866的每一林菌抹，對于具有優(yōu)異的保存生存性的長雙歧桿菌FERMBP-7787菌抹以外的長雙歧桿菌，也具有優(yōu)異的繁殖促進性能和提高保存生存性的性能。5.與專利文獻1中所記載的乳酸乳球菌乳酸亞種與乳酸乳球菌乳脂亞種的混合物的對比試驗首先，按照上述4(2)中所述的方法，制備乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的培養(yǎng)物、長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌抹的培養(yǎng)物、以及嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物。將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌IO分鐘，在該復原脫脂乳培養(yǎng)基上接種1%(V/V)的如以上所述制備的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的培養(yǎng)物、1%(V/V)的長雙歧桿菌模式菌4朱ATCC15707菌抹的培養(yǎng)物以及O.01%(V/V)的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)至pH達到4.6,得到發(fā)酵乳。將該發(fā)酵乳快速冷卻，測定所含有的雙歧桿菌數。另一方面，作為對照，將10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌IO分鐘，在該復原脫脂乳培養(yǎng)基上接種1%(V/V)的如上所述制備的長雙歧桿菌模式菌抹ATCC15707菌抹的培養(yǎng)物和2%(V/V)的由乳酸乳3求菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種組成的混合物"EZALMA14"(Rhodia公司生產)，在38°C下培養(yǎng)至pH達到4.6,同樣地測定所得發(fā)酵乳的雙歧桿菌數。另外，"EZALMA14"對應于專利文獻1中所述的混合物"EZALMR014"(Rhodia/^司生產)。在使用乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的發(fā)酵乳中，雙歧桿菌數為5.5xl()8CFU/g。與之相反，把使用"EZALMA14"的發(fā)酵乳稀釋106倍獲得稀釋溶液，從該稀釋液中完全纟全測不到雙歧桿菌，因此表明該發(fā)酵乳中含有的雙歧桿菌數為1x106CFU/g以下。換句話說，可以看出，在將專利文獻l所述的乳酸乳球菌乳酸亞種與乳酸乳球菌乳脂亞種和長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，不能獲得如專利文獻1中所述那樣的促進雙歧桿菌繁殖和縮短發(fā)酵時間的效果。如上所述，乳酸乳3求菌乳酸亞種MCC852、857、859、865和866五抹菌抹，即本發(fā)明中使用的乳球菌屬菌在適于雙歧桿菌的發(fā)酵溫度范圍內、在乳性培養(yǎng)基中表現了強的發(fā)酵性，另夕卜，在與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，表現了優(yōu)異的促進雙歧桿菌繁殖和保存生存性的效果。因此，可以看出它們具有公知的乳球菌屬菌所沒有的性能。另外，本發(fā)明中所使用的乳球菌屬菌由于不產生雙乙酰和乙偶姻，預期可以制備良好味道的發(fā)酵物。在本發(fā)明中，對用于雙歧桿菌和乳球菌屬菌的預培養(yǎng)的培養(yǎng)基只要是通常使用的培養(yǎng)基就沒有特定限制，但乳性培養(yǎng)基是優(yōu)選的。復原脫脂乳培養(yǎng)基由于處理簡便是更優(yōu)選的。該復原脫脂乳培養(yǎng)基的濃度優(yōu)選為3%(W/W)以上，尤其優(yōu)選8%(w/w)以上。另外，在預培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基中，可以添加酵母提取物等繁殖促進物質和L-半胱氨酸等還原劑等。尤其，由于雙歧桿菌在乳性培養(yǎng)基中的增殖能力低，因此優(yōu)選使用添加了繁殖促進物質的培養(yǎng)基。例如，可以<吏用含有O.l-1%(W/W)的酵母提取物的培養(yǎng)基。另外，預培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基使用進行滅菌處理后的培養(yǎng)基。該滅菌處理可以根據常規(guī)方法進行，例如，可以通過在80-122。C下加熱處理5-40分鐘，優(yōu)選在85-95。C下加熱處理5-35分鐘來進4亍。在本發(fā)明中，采用雙歧桿菌和乳球菌屬菌的發(fā)酵中所使用的發(fā)酵用基本培養(yǎng)基，只要是發(fā)酵乳制備中常用的培養(yǎng)基就沒有特定限制。發(fā)酵用基本培養(yǎng)基例如可以通過在牛乳、脫脂乳、鮮奶、黃油、全脂奶粉、脫脂奶粉等中根據需要配合蔗糖等甜味劑、果膠、水果、果汁、瓊脂、明膠、油脂、香料、著色劑、穩(wěn)定劑、還原劑等，根據常規(guī)方法滅菌，均質化，冷卻等來制備。對接種到發(fā)酵用基本培養(yǎng)基中的雙歧桿菌與乳球菌屬菌的發(fā)酵劑的接種比例沒有特定限制，優(yōu)選為100:1~1:10,更優(yōu)選10:1-1:1。另外，對在發(fā)酵用基本培養(yǎng)基中的添加量也沒有特定限制，以發(fā)酵用基本培養(yǎng)基為基準計，雙歧桿菌與乳球菌屬菌的總添加量優(yōu)選是O.Ol~IO(V/V)%，尤其優(yōu)選O.l~5(V/V)%。本發(fā)明中所使用的乳酸菌中，只要是在不妨礙乳球菌屬菌對雙歧桿菌的繁殖促進效果和提高保存生存性的效果的范圍內，還可以進一步含有雙歧桿菌和乳球菌屬菌以外的其它乳酸菌。對所述其它乳酸菌沒有特定限制，只要是在通常發(fā)酵乳制備中使用的乳酸菌即可，但優(yōu)選是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。對作為發(fā)酵劑接種到發(fā)酵用基本培養(yǎng)基中的雙歧桿菌與乳球菌屬菌的總引入量與此外的乳酸菌的總引入量之間的接種比例只要不干擾乳球菌屬菌對雙歧桿菌的效果就沒有特定限制，但優(yōu)選是1000:1-10:1。在本發(fā)明的發(fā)酵乳生產方法中，混合培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30~40°C,尤其優(yōu)選3638。C。因為這是雙A支桿菌與本發(fā)明中使用的乳球菌屬菌二者可以充分繁殖的溫度范圍。另外，培養(yǎng)時間根據所要制備的發(fā)酵乳的種類來適當決定，培養(yǎng)時間優(yōu)選為5~18小時。通過培養(yǎng)得到的發(fā)酵乳可以直接作為食品，也可以例如均質化加工成液態(tài)。另外，例如還可以適宜添加果汁、水果等。對填充到容器內的方法沒有特定限制，可以使用常用的方法。在下文中通過實施例來進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。實施例1將10%(W/W)復原脫脂奶粉(森永乳業(yè)公司生產)在水中溶解由此得到1000mL的10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基，將其在90。C下滅菌30分鐘，然后接種30mL的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的種子培養(yǎng)物，在25。C下培養(yǎng)16小時。另一方面，將1000mL含有0.2%(W/W)酵母提取物的11%(W/W)脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，接種100mL長雙歧桿菌FERMBP-7787菌林的種子培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)6小時。除此之外，將通過將包括脫脂奶粉、全脂奶粉、果膠和蔗糖的原料混合并溶解而獲得的50L含有0.5%(W/W)乳脂肪、8.0%(W/W)非脂乳固體組分、5.0%(W/W)蔗糖和0.2%(W/W)果膠的基本培養(yǎng)基在9(TC下滅菌10分鐘，冷卻到40°C。在該滅菌過的基本培養(yǎng)基中，接種50mL如上所述進行預培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857菌抹的培養(yǎng)物和500mL長雙歧桿菌FERMBP-7787的培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)16小時，獲得發(fā)酵乳。立即將該發(fā)酵乳攪拌、冷卻，將冷卻的發(fā)酵乳在15MPa的壓力下均質化，隨后填充到200mL容積的玻璃容器內，密封，獲得酸性乳飲料。所獲得的酸性乳飲料具有0.68%的乳酸含量，4.64的pH和75mPa.s的粘度，并且含有7.0x108CFU/g的雙A支桿菌。當將該酸性乳飲料在l(TC下保存21天時，雙歧桿菌數為5.2xl08CFU/g,存活率為74%。實施例2將1000mL的10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，然后接種30mL乳酸乳球菌乳酸亞種MCC866菌抹的種子培養(yǎng)物，隨后在25。C下培養(yǎng)16小時。另一方面，將1000mL含有0.2%(W/W)酵母提取物的11%(W/W)脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，接種100mL長雙歧桿菌FERMBP-7787菌林的種子培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)6小時。另夕卜，將1500mL的10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，接種50mL的嗜熱鏈球菌(HANSEN生產)和保加利亞乳桿菌(HANSEN生產)的混合培養(yǎng)物，然后在37。C下培養(yǎng)5小時。除此之外，將50L含有3.0%(W/W)乳脂肪和9.0%(W/W)非脂乳固體組分的原料乳加熱到70°C，在15MPa的壓力下均質化，然后，在90。C下滅菌10分鐘，冷卻到40°C。在該滅過菌的基本培養(yǎng)基中，接種500mL如上所述進行預培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC866菌4朱的培養(yǎng)物、500mL的長雙歧桿菌FERMBP-7787菌林的培養(yǎng)物以及5mL的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物，填充到500mL容積的樹脂容器內，密封，在37。C下培養(yǎng)7小時，然后立即冷卻。所獲得的發(fā)酵乳具有0.72%的乳酸含量，4.55的pH,并且含有5.8xl08CFU/g的雙歧桿菌。當將該發(fā)酵乳在l(TC下保存21天時，雙歧桿菌數為3.6xl08CFU/g,存活率為62%。實施例3將1000mL的10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，然后接種30mL的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC865菌抹的種子培養(yǎng)物，在25。C下培養(yǎng)16小時。另一方面，將1000mL含有0.2%(W/W)酵母提取物的11%(W/W)脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，接種1OOmL長雙歧桿菌FERMBP-7787菌4朱的種子培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)6小時。另外，將1500mL10%(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基在90。C下滅菌30分鐘，接種50mL的嗜熱鏈球菌(HANSEN生產)和保加利亞乳桿菌(HANSEN生產)的混合培養(yǎng)物，然后在42。C下培養(yǎng)5小時。除此之外，將500L的含有3.4%(W/W)乳脂肪和12.2%(W/W)非脂乳固體組分的原料乳加熱到70°C,在15MPa的壓力下均質化，然后，在90。C下滅菌IO分鐘，隨后冷卻到4CTC。在該滅過菌過的基本培養(yǎng)基中，接種5L如上所述進行預培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳酸亞種MCC865菌4朱的培養(yǎng)物、5L的長雙歧桿菌FERMBP-7787菌林的培養(yǎng)物以及50mL的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物，在37。C下培養(yǎng)7.5小時，然后立即冷卻。通過將所得發(fā)酵乳進一步攪拌，將凝乳粉碎，將粉碎過的發(fā)酵乳與通過常規(guī)方法制備的藍莓果漿按7:3的比例混合，攪拌至均一后，填充到容積120mL的隔絕氧氣性的紙制容器內。這樣獲得的具有藍莓果漿的發(fā)酵乳具有0.80%的乳酸含量，4.55的pH和5.5xl08CFU/g的雙歧桿菌。這種含有藍莓果漿的發(fā)酵乳在10°C下保存21天時，雙歧桿菌數為3.9xl08CFU/g,存活率為71%。工業(yè)實用性通過本發(fā)明的生產方法，能夠制備即使到了消費者手中也能含有以往所沒有的大量存活的雙歧桿菌的發(fā)酵乳，因此可以在發(fā)酵乳等的生產領域中應用。權利要求1.生產發(fā)酵乳的方法，包括使用雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬菌和乳球菌(Lactococcus)屬菌作為乳酸菌進行發(fā)酵，所述乳球菌屬菌具有下述細菌學性質:(1)發(fā)酵性，即，在10％(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中在25-37℃的溫度范圍內培養(yǎng)16小時的情況下，使該培養(yǎng)基凝固；(2)促進長雙歧桿菌繁殖的性能，即，在10％(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時，長雙歧桿菌的菌數達到5×108CFU/g以上；以及(3)提高長雙歧桿菌的保存生存性的性能，即，在10％(W/W)復原脫脂乳培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時快速冷卻后在10℃下保持2周時，長雙歧桿菌的存活率達到30％以上。2.根據權利要求1所述的生產發(fā)酵乳的方法，其中，所述乳球菌屬菌不具有同化木糖的能力，而且，不生成雙乙酰和乙偶姻。3.根據權利要求1或2所述的生產發(fā)酵乳的方法，其中，所述乳3求菌屬菌是豸L酉交專'L^求菌專'L面復亞種(丄""ococci^subsp./ac/7s)。4.根據權利要求1~3的任一項所述的生產發(fā)酵乳的方法，其中，所述乳球菌屬菌的菌抹是選自由乳酸乳球菌乳酸亞種MCC852(FERMBP-10742)、乳酸乳球菌乳酸亞種MCC857(FERMBP-10757)、乳酸乳球菌乳酸亞種MCC859(FERMBP—10744)、孝L酉交享LJ求菌乳酉臾亞種MCC865(FERMBP—10745)和乳酸乳5求菌乳酸亞種MCC866(FERMBP-10746)所組成的組中的一種以上。5.根據權利要求1~4的任一項所述的生產發(fā)酵乳的方法，其中，所述雙ji支桿菌屬菌是長雙歧桿菌(S(/MoZm"ehwm/owgi/m)。6.根據權利要求5所述的生產發(fā)酵乳的方法，其中，所述長雙歧桿菌的菌4朱為長雙歧桿菌FERMBP-7787。7.根據權利要求1~6的任一項所述的生產發(fā)酵乳的方法,其中,進一步4吏用嗜熱《連球菌(5Vrej^ococcwsAermo//n7ws)禾口4呆力口利亞^才干菌(丄a"oZmc,7/i^6w/g"〃'cwsM乍為上述乳酉臾菌。8.通過權利要求1~7的任一項所述的生產發(fā)酵乳的方法所制備的發(fā)酵乳。全文摘要本發(fā)明涉及生產發(fā)酵乳的方法，以及通過該生產方法制備的發(fā)酵乳；所述生產發(fā)酵乳的方法，其特征在于，使用雙歧桿菌屬菌和乳球菌屬菌作為乳酸菌進行發(fā)酵，所述乳球菌屬菌具有下述細菌學性質(1)發(fā)酵性，即，在10％復原脫脂乳培養(yǎng)基中、在25-37℃的溫度范圍內培養(yǎng)16小時的情況下，使該培養(yǎng)基凝固；(2)促進長雙歧桿菌繁殖的性能，即，在上述培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時，使該雙歧桿菌的菌數達到5×10⁸CFU/g以上，以及(3)提高長雙歧桿菌保存生存性的性能，即，在上述培養(yǎng)基中與長雙歧桿菌混合培養(yǎng)的情況下，在pH達到4.4-4.6時快速冷卻后在10℃下保持2周時，長雙歧桿菌的存活率達到30％以上。文檔編號A23C9/123GK101378662SQ200780004900公開日2009年3月4日申請日期2007年11月1日優(yōu)先權日2007年2月13日發(fā)明者宮地一裕,小川康一,木曾慶明,清水金忠,石田貴子申請人:森永乳業(yè)株式會社