專利名稱：微流體裝置的制作方法
微流體裝置
A. 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明
在國防部授予的項目號W911SR-04-P-0047 、 NIH授予的資助號 5R01HG003583-01、 HSARPA授予的合同號NBCHC050133、 HSARPA授予的 順序號TTA-1-0014(協(xié)議號W81XWH-04-9-0012)中一個或多個的政府支持下
進行本發(fā)明的各個方面。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
B. 背景
在過去的10-20年中，開發(fā)了各種不同且常常不相容的微流體裝置設(shè)計， 通常其目的是減小生物分析方法中的樣品體積需求。在不存在控制外部尺寸形 狀因子、上游和下游外部接口的特性、以及內(nèi)部微流體通路的長度、橫截面幾 何形狀和直徑的標準的情況下，這種微流體裝置常常互不相容，并且與現(xiàn)有的 上游純化和下游分析裝置不相容。
盡管微型制造取得的進步使得可能在微升、甚至納升或皮升級進行分析， 但首次獲得的許多生物和環(huán)境樣品的體積比現(xiàn)有微流體分析裝置的量級大得 多并與其不相容。
因此，本領(lǐng)域需要一種模塊化微流體部件，它可用作集成流體系統(tǒng)的部件， 可將具有不同外部尺寸形狀因子、外部接口和/或內(nèi)部流體幾何形狀的微流體部
件連接成有效的流體連通，并可連接微流體制備和/或分析部件和在較大量級上 操作的制備模塊或方法。
C. 發(fā)明概述
本發(fā)明解決了本領(lǐng)域的這些和其它需求。
D. 附圖簡要說明本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下述附圖僅僅為了說明目的，而不旨在以任何方 式限制本發(fā)明的范圍。


圖1說明了樣品捕獲和純化模塊(SCPM)和生物處理器模塊(BPM)工作流
程的一種實施方式。
圖2說明了毒素試驗工作流程的一種實施方式。
圖3說明了集成生物處理器模塊(BPM)的樣品捕獲和純化模塊(SCPM)的
一種實施方式。
圖4說明了芯片外流過筒(off-chip flow-through cartridge)的一種實施方式。 圖5說明了行波流過式珠攪拌器(traveling wave flowthrough bead beater)
的一種實施方式。
圖6說明了流過式(flowthrough)超聲處理的一種實施方式，其中將探頭 直接插入收集器流出物。
圖7說明了核酸純化模塊的一種實施方式。
圖8說明了納米生物處理器模塊化系統(tǒng)的一種實施方式，包括空氣取樣 器、樣品濃縮模塊以及微流體樣品擴增和分析模塊，可用于生物防衛(wèi)應(yīng)用。 圖9說明了 MOVTM閥的一種實施方式。 圖IO說明了顯微制造泵的一種實施方式。 圖11說明了顯微制造路由選擇器的一種實施方式。
圖12說明了提供樣品凈化基質(zhì)的三維連接工作通道的橫截面的一種實施 方式。
圖13說明了將一種或多種反應(yīng)物加入反應(yīng)室的流體線路的一種實施方式。
圖14說明了循環(huán)測序模塊(CSM)重復(fù)單元的一種實施方式。 圖15說明了單個生物處理器單元的一種實施方式。 圖16說明了采用外部致動的MOV閥和泵的微芯片筒的一種實施方式。 圖17說明了 12單元生物處理器筒的一種實施方式。 圖18說明了非生物處理器單元和微芯片設(shè)計的一種實施方式。 圖19說明了微芯片實施方式MBI-11。圖A顯示蒙板(mask)設(shè)計，其 中流體層顯示為藍色，致動層顯示為紅色。圖B顯示其中一個子組件，其具有兩組輸入和輸出儲存庫、反應(yīng)室和存儲室以及三向路由選擇器。該閥門的8條 氣動控制線終止于與氣動裝置相連的標準連接器。圖C顯示出蝕刻的微流體晶
片。圖D顯示出組裝的MBI-11三層微芯片，用實驗室記號筆標出了比例尺。 圖20說明了微芯片實施方式MBI-12，其裝有集成樣品制備的顯微毛細管 電泳OtCAE)所用的納米流體結(jié)構(gòu)。用藍色表示流體通道，用紅色表示MOV致 動通道。
圖21說明了具有雙分析通道的雙成對-末端讀出親和捕獲樣品凈化的一種 實施方式。深色層是微流體，灰線是工作層。闊致動層未顯示。淺色虛線框確 定了DNA分析重復(fù)單元。
圖22說明了集成的樣品、制備、凈化和分析MINDS微芯片重復(fù)單元的 一種實施方式。
圖23說明了 16-通道200 nL循環(huán)測序模塊微芯片的一種實施方式。
圖24說明了加入微珠的集成的樣品、制備、凈化和分析MINDS微芯片
重復(fù)單元的一種實施方式。顯示出25nL樣品制備室具有兩條親和捕獲和分離通道。
圖25說明了設(shè)計為包括板載試劑、核酸純化和毒素模塊的一次性筒的微 芯片的一種實施方式。
圖26說明了微芯片接口裝置的設(shè)備控制的一種實施方式。
圖27說明了 MiniPrep設(shè)備中裝配有管道的微芯片真空吸盤的一種實施方式。
圖28說明了操縱MiniPrep設(shè)備內(nèi)的生物處理器微芯片的關(guān)聯(lián)硬件的一種 實施方式。
圖29說明了路徑長度增加的RT-PCR室的一種實施方式。 圖30說明了旋轉(zhuǎn)掃描器的一種實施方式。
圖31說明了可用于核酸分析(RT-PCR和pCAE)的生物處理器模塊的蒙板 設(shè)計的一種實施方式。
圖32說明了生物處理器微芯片的晶片級設(shè)計的一種實施方式，其中在6" 晶片上有48個單元，各單元具有RT-PCR和^CAE能力。圖33說明了多重生物處理器線路的一種實施方式。MOV路由選擇器將樣 品分為三個多重RT-PCR反應(yīng)，產(chǎn)生法醫(yī)(forensics)樣品和再測試樣品，并 可選擇樣品進行nCAE驗證。
圖34說明了用8"晶片模擬12"晶片。
圖35顯示出用珠在一定濃度范圍內(nèi)捕獲大腸桿菌(E. co//)。
圖36顯示出在大腸桿菌的免疫捕獲中偶聯(lián)于DYNALTM珠的單克隆抗體 的滴定。
圖37顯示出蠟樣芽孢桿菌^. ce"^)對大腸桿菌的免疫捕獲的影響。
圖38顯示出用免疫捕獲從摻入(spike)空氣取樣器液體中回收大腸桿菌。
圖39顯示出圖38的特定滴度104 CFU/ml的數(shù)據(jù)組。
圖40顯示對通過100 mg 二氧化硅提取物-清潔(Extract-Clean) SPE介質(zhì) 床的各種樣品組分中高滴度大腸桿菌進行濃縮的結(jié)果。
圖41顯示出通過100 mg 二氧化硅提取物-清潔SPE介質(zhì)床的各種組分中 存在的高濃度大腸桿菌樣品的總細菌百分數(shù)。
圖42顯示出用二氧化硅珠(左)和大珠(右)回收P-半乳糖苷酶。
圖43顯示出用大珠回收大腸桿菌。
圖44顯示出將凈化樣品直接注射入分離通道的直接注射方案的一種實施 方式。
圖45顯示出用MOV裝置在芯片上混合的實施方式。 圖46顯示出用芯片上的MOV泵在MBI-13T形通道和團中進行混合的實
施方式。
圖47顯示"T"形混合的芯片設(shè)計的實施方式，其中由端口l泵送水，由 端口 2泵送紅色染料。在距"T"形接頭數(shù)毫米處觀察到基本混合，在2 mm 反應(yīng)室中沒有觀察到顏色差異。
圖48顯示4步泵送過程中"T"形通道接頭的實施方式的照片，其中每個 步驟計時1秒。通道尺寸為50pm深、150pm寬。泵閥體積約為50nL。
圖49顯示泵送步驟3中"T"接頭下游數(shù)毫米處拍攝的特寫照片。通道寬 度為150pm。出現(xiàn)與基本混合相一致的均一顏色。E.發(fā)明詳述
應(yīng)理解，上述總說明，包括附圖以及以下詳述僅為示范性和解釋性，不限 制本公開。在本公開中，采用單數(shù)形式時包括復(fù)數(shù)，除非另有特別說明。同時， 采用"或者"指"和/或"，除非另有說明。相似地，"包括"、"包含"不旨在限制。 術(shù)語如"元件"或"部件"包括包含一個單元的元件和部件，以及包含一個以上單 元的元件或部件，除非另有特別說明。本文所用的章節(jié)標題僅為組織目的，不 旨在限制所述主題。本文特別將引用的所有參考文獻和參考文獻的部分，包括 但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論文的全文納入本文作參考，用于所 有目的。在一個或多個摻入的參考文獻與本申請矛盾的情況下，本申請居于控 制地位。
本公開提供了集成的模塊化系統(tǒng)，它具有制備和分析各種樣品的靶分析物 的補充功能。本文所述系統(tǒng)可用于制備和分析各種靶分析物，包括但不限于 分子(如毒素、藥物)、生物分子(如核酸、多肽、脂質(zhì))、細胞(如真核和原核細 胞(如芽孢桿菌、埃希菌))、芽孢(spore)(如炭疽桿菌(S. a"Arac/力)、病毒(如 流感、天花)和其它材料，可根據(jù)實施人的判斷進行選擇。在各種示范性實施 方式中，可用一個或多個系統(tǒng)模塊進行樣品制備和分析，如下所述。
在一些實施方式中，本文所述系統(tǒng)包括用于樣品捕獲或純化(SCPM)的前 端模塊，在典型的實施方式中，它還能將捕獲和/或純化的樣品引入生物處理器 模塊(BPM)，該模塊可包括一個或多個微流體裝置(如微米級、納米級或皮米級 裝置)，用于進一步制備和/或分析。因此，本文公開的是用于捕獲、濃縮或純 化樣品中的靶分析物，然后將該靶分析物引入一個或多個微流體裝置的模塊化 系統(tǒng)和方法。在一些實施方式中，微流體裝置可向芯片外平臺供料。
在各種示范性實施方式中，SCPM可通過各種方法，如通過裂解、乳化、 超聲處理、離心、層析、固相提取(SPE)、免疫捕獲(如免疫磁性分離(IMS))、 基于珠的捕獲及其組合捕獲、純化或濃縮靶分析物。在一些實施方式中，SCPM 可將大規(guī)模樣品溶液減少到小規(guī)模體積(例如通過將毫升濃縮至微升或更小的 體積)以引入一種或多種微流體裝置。這些SCPM實施方式能夠用作模塊化規(guī) 模接口 ，允許將微米級和/或納米級裝置集成到包括在較大規(guī)模上操作的操作模 塊的流體系統(tǒng)中。這些SCPM實施方式可允許具有不同尺寸形狀因子的模塊集成到流體相連的系統(tǒng)中。在一些實施方式中，SCPM可通過去除可能存在于粗 樣品中的一種或多種物質(zhì)以及作為下游加工或分析的抑制劑的一種或多種物 質(zhì)而純化樣品。與常規(guī)方法相比，通過捕獲、純化或濃縮樣品中的靶分析物， SCPM可提高本文所述系統(tǒng)的靈敏度。
BPM —般包括一個或多個微流體裝置。本文所用"微流體裝置"指適合操 作、儲存、加工或分析毫升以下量，如微升0iL)、納升(nL)和/或皮升(pL)體積 的流體的裝置。在各種示范性實施方式中，微流體裝置可包括一個或多個微芯 片(如微米級、納米級或皮米級裝置)、毛細管及其組合?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的 顯微制造技術(shù)生產(chǎn)本文所述微芯片，這些芯片可包括閩、泵、室、通道、儲存 庫等，可能適合加工或分析一種或多種耙分析物。在各種示范性實施方式中， 微流體裝置可以是基于微芯片的筒(cartridge)，可以是不可替換/不可重復(fù)使 用的或一次性的。本文所述微芯片可具有任何形狀或尺寸。例如，微芯片可以 是具有一個或多個輻射狀樣品制備或分析單元的圓筒，可與操作微芯片的設(shè)備
一起使用。在一些實施方式中，微流體裝置可以是自動化裝置。例如，可將微 芯片儲存在"CD換片裝置"中并自動插入、操作來進行一項或多項功能，如果 需要，由可編程設(shè)備儲存。因此，設(shè)備可提供微芯片處理、外部氣動操作、溫 度控制、試劑溶液等，以同時或連續(xù)操作一個或多個微芯片。
在一些實施方式中，SCPM能夠?qū)⒖砂环N或多種附于其上的耙分析物 的懸液、膠體(如乳劑)或捕獲珠引入BPM，在各種這樣的實施方式中，將其引 入BPM的一個或多個微流體裝置中。在這種實施方式中，BPM的一個或多個 微流體裝置適合移動一種或多種所述固體如珠使其通過該裝置的微流體通路 而不堵塞。
珠或其它固體從SCPM進入BPM可用于實現(xiàn)含分析物的樣品體積的下 調(diào)，從而使大規(guī)模模塊與小規(guī)模裝置接口連接(interface)。因此，這種SCPM 和BPM實施方式能夠使規(guī)模和/或尺寸形狀因子不同的裝置模塊化地接口連 接，允許將微米級和/或納米級裝置集成到包括在較大規(guī)模上操作的操作模塊的 流體系統(tǒng)中。
在適合基于珠的微流體裝置加工的各種示范性實施方式中，可通過流體線 路內(nèi)插入閘板或其它物理阻礙物、磁場、珠的親和捕獲、電捕獲或其它機制將珠可逆地固定在微流體通道或線路的各點上。在各種實施方式中，可使珠通過 流體通道或線路，并可對其進行物理或化學(xué)加工。隨后，可將粘附、或附著、 或吸附、或吸收、或以其它方式附于珠的分析物移動到下游反應(yīng)室中，在芯片 上(即在微流體裝置內(nèi))進行進一步加工或分析。在一些實施方式中，如果需要， 可洗脫掉珠上的物質(zhì)，如靶分析物。在一些實施方式中，具有不同親和力的珠 系列可連接成具有高特異性和靈敏度的較復(fù)雜的生物分子工藝，如一個步驟可
將細胞結(jié)合到珠上，下一步驟可將特定DNA序列固定在珠上，以在反應(yīng)前凈
化，第三種珠可用于結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物，以在引入質(zhì)譜等之前進行純化。在一些實 施方式中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷選擇的各種步驟中也可采用含有親和捕 獲試劑的凝膠。
在一些實施方式中，BPM可用作獨立的樣品制備系統(tǒng)。因此，在各種示 范性實施方式中，BPM可連接于各種上游樣品收集裝置(如氣溶膠取樣器)或給 下游分析平臺或方法(如質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、毛細管陣列電泳(CAE)、 逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)、單分子檢測系統(tǒng)等)供料。然而，在一些實施方式中， 可在微芯片的通道、儲存庫、反應(yīng)室等或其組合中進行一種或多種分析方法。
本文所述系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于生物防衛(wèi)監(jiān)測、傳染病診斷、法醫(yī)學(xué)、基因組 學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它領(lǐng)域。在生物防衛(wèi)中，該技術(shù)提供了結(jié)構(gòu)緊湊的部件， 可用作(例如)建筑物、飛機或機場的野外病原體監(jiān)測裝置，或用于實驗室以解 決曰益增長的測試需求。該系統(tǒng)可制備和分析來自空氣、生物液體、農(nóng)產(chǎn)品或 其它來源的樣品，以檢測目標病原體。低消費成本與自動化制備和分析的組合 對分子診斷有顯著影響。在臨床診斷中，可使該技術(shù)適合產(chǎn)生采用無縫集成的 一次性裝置(目的是產(chǎn)生所需的額外分析)的PCR診斷設(shè)備。本文所述系統(tǒng)也可 應(yīng)用于藥物遺傳學(xué)、人類藥物遺傳學(xué)、生物醫(yī)藥研究、動物和植物分型以及人 類鑒定。
所述系統(tǒng)的其它應(yīng)用包括分子診斷，如檢測微生物、生物體基因型分析、 測序和法醫(yī)學(xué)；產(chǎn)生用于各種方法(如RT-PCR、再測序和蛋白質(zhì)分析)的樣品 的制備和分析平臺；產(chǎn)生用于大多數(shù)分析平臺，如質(zhì)譜、毛細管陣列電泳、差 別展示和單分子檢測的樣品制備臺；以及用于生物防衛(wèi)應(yīng)用。本文所述系統(tǒng)可(例如)通過采用機器人整體或部分自動化，它的大小可縮 放，從手持式裝置至野外監(jiān)測器至實驗室設(shè)備。
1.靶分析物的濃縮
在一些實施方式中，在引入微流體裝置進行進一步加工或分析之前可濃縮 樣品中的靶分析物。在一些實施方式中，可用可容納大規(guī)模體積(如毫升至升) 并將一種或多種靶分析物濃縮到小表面(例如微珠)上的一種或多種芯片外流過 裝置濃縮一種或多種耙分析物。在一些實施方式中，可采用可由容納大規(guī)模體 積的芯片外儲存庫供料的芯片上的流過裝置濃縮一種或多種靶分析物。在一些 實施方式中，芯片上和芯片外的裝置可組合使用。在一些實施方式中，捕獲的
靶分析物可選擇性洗脫成適合下游加工或分析的體積。如圖1所示，SCPM 1 可包括以下模塊免疫捕獲模塊2、裂解模塊3、核酸純化模塊4，并可與納米 生物處理器5集成。在一些實施方式中，可免疫捕獲分子如毒素，并將其直接 供給納米生物處理器5(圖2)。
適合將靶分析物捕獲到表面上的材料包括各種類型的提取基質(zhì)材料，可由 珠、整體料(monolith)、改性聚合物等組成。在一些實施方式中，提取基質(zhì)材料 可包含各種連接的官能團(如C4、 C18、羧基和氨基)，各種珠或化學(xué)物質(zhì)的混合 床，或親和捕獲部分(如抗體、凝集素、半抗原、配體(如生物素)、受體、核酸 等)。在一些實施方式中，可用羧化珠，如SPRI或未改性的二氧化硅珠捕獲核 酸，并洗脫入合適體積的極性溶劑如水中。在一些實施方式中，可采用納米級 的捕獲方法，其采用二氧化硅毛細管，其中離液劑如硫氰酸鹽將核酸壓到毛細 管表面上，洗滌后，可將濃縮和純化的核酸洗脫入緩沖液中用于進一步加工或 分析(參見美國專利號6,489,112)。各種靶分析物的其它固相捕獲方法參見例如， Weimer等，2001￡"v/ra".似/cra6/o/0gy， 67:1300-1307。
a)芯片外流過式(off-chip flowthrough)裝置
在一些實施方式中，可用芯片外流過裝置130濃縮靶分析物，該裝置通過 濃縮基質(zhì)140引導(dǎo)大規(guī)模樣品體積(圖4)。在一些實施方式中，濃縮基質(zhì)保留 了靶分析物，而本體溶液和干擾化合物通過該裝置。在一些實施方式中，干擾化合物或不需要的化合物保留在基質(zhì)140上，而耙分析物通過該裝置。根據(jù)樣
品形式(表面、水、土壤、氣溶膠、生物物質(zhì))，可采用粗過濾(ra. 20 jim)去除 本體污染物和顆粒。在一些實施方式中，芯片外流過裝置的底板上可包括燒結(jié) 的開口150，其中加載基質(zhì)，該裝置還可包括用于洗脫的孔(S1 mm)口(圖4)。 濃縮基質(zhì)可采用非親和介質(zhì)或親和捕獲介質(zhì)，如本文所述。與BPM微流體裝 置集成的芯片外流過裝置的例子見圖3。
i) 非親和捕獲
本文所用"非親和捕獲"指通過疏水、親水或離子相互作用在介質(zhì)上非特異 性捕獲耙分析物。
在一些實施方式中，靶分析物的非親和捕獲可采用Extract-CIeanTM固相 抽提(SPE)試劑盒(Alltech)，該試劑盒包括1.5mL(或4mL)柱，該柱中預(yù)先填充 有含有20 Mm聚乙烯熔塊的一種SPE介質(zhì)。該介質(zhì)可捕獲靶分析物用于進一 步洗脫，或可允許靶分析物通過而不需要的物質(zhì)保留在該介質(zhì)上。例如，范圍 分別為約l-104 CFU/mL、約102-103 PFU/mL和0.1-102 ng/mL的細胞、病毒或 細胞裂解物中的蛋白質(zhì)可施加于介質(zhì)?？墒止せ蛲ㄟ^機器人加載樣品，如果需 要，用真空使介質(zhì)流過。在一些實施方式中，靶分析物結(jié)合于可洗滌的填充材 料，可通過從介質(zhì)中洗脫來濃縮靶分析物。在各種示范性實施方式中，可采用 3 mL注射器筒體SPEC(ANSYS Technologies),其裝有二氧化硅微纖維盤，以 防止流動特性和保留特征的溝通(to prevent channeling for flow properties and retention charateristics)，或可采用大珠(Big Beads)。也可采用標準或特殊色 譜介質(zhì)濃縮或純化所需材料。在任何所選介質(zhì)中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可優(yōu)化 床體積、不同介質(zhì)制備、洗滌和洗脫條件，實現(xiàn)最大保留以提高靈敏度。
可用各種方法監(jiān)測流過該裝置的樣品，這些方法有，如釆用(例 如)Avalanche熒光掃描儀(GE)的免疫標記(immunotagging)和熒光檢觀ij、采用(例 如)MegaBACE 1000(GE)的毛細管電泳、細胞生長試驗或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的其它方法。
ii) 親和捕獲本文所用"親和捕獲"指用介質(zhì)捕獲靶分析物，介質(zhì)含有對靶分析物基本特 異的分子(如抗體、配體、受體、凝集素、半抗原、表位、寡核苷酸等)。在一 些實施方式中，可將用靶分析物(如細胞、生物體、芽孢或毒素)表面表位的單 克隆抗體修飾的磁珠加入樣品。在一些實施方式中，根據(jù)實施者的判斷，可連 續(xù)地或以各種組合將用特定生物體、細胞類型、亞型、種類、核酸、蛋白質(zhì)等 的抗體包被的珠的混合物或組施加于樣品。抗體包被的珠結(jié)合靶分析物，從而 從溶液中捕獲它們?？赏ㄟ^磁體來收集珠，可通過洗滌去除不需要的污染物和 可能的抑制劑。
在各種示范性實施方式中，可重懸收集、洗滌的珠，以在流過裝置或另一 裝置中進一步加工，或移動到BPM的微芯片上。如本文所述，在涉及生物防 衛(wèi)應(yīng)用的實施方式中，收集并洗漆的珠可重懸于10pL緩沖液中，插入小超聲
處理桿。在一些實施方式中，可利用采用如圖6所述裝置的流過超聲處理。在 超聲處理之后，可使經(jīng)超聲處理的材料通過濾膜，流到BPM微流體裝置上。
b)芯片上的流過式(on-chip flowthrough)裝置
在一些實施方式中，可用BMP微流體裝置濃縮靶分析物。在一些實施方 式中，靶分析物的芯片上濃縮可有利于在同一小室中進行模塊集成、應(yīng)用顯微 制造技術(shù)并能夠進行各種方法如PCR。在一些實施方式中，這可能需要采用直 徑相對較大的通道，以產(chǎn)生合適的流速。在一些實施方式中，免疫親和捕獲提 供了快速而特異地濃縮和純化樣品中的病原微生物或病毒、蛋白質(zhì)或其它靶分 析物的方法。例如，為了濃縮靶分析物，基于珠的樣品制備可適合成批方法至 芯片上的方法。例如，可用電動珠床填充和閘板珠捕獲法(Oleschuk等， 2000. Jwfl/W/ca/ C%em/Wo; 72:585-5909)將抗體包被的珠放置在集成的顯微制造 捕獲室中。
在一些實施方式中，流過模式的填充床中的羧化珠可用于顯微制造的玻璃 裝置，以便后加工多核苷酸，如DNA測序混合物?？捎肂orofloat玻璃顯微制 造裝有捕獲珠用的擋板的玻璃芯片?？稍O(shè)計擋板頂端和相對通道之間的擋板缺 口，使其適合羧化珠或其它類型的珠，如二氧化硅珠，能用抗體、凝集素或核 酸等親和捕獲的珠。首先可用HF蝕刻深通道，然后第二層淺蝕刻可確定擋板高度為0.5)im或更多，這取決于特定的珠和應(yīng)用。在一些實施方式中，可通過 壓力填充珠，用真空吸引去除珠。在一些實施方式中，可將免疫官能化的或其 它磁珠加入沒有閘板的小室中。垂直于小室平面施加小磁場后，珠自身組裝成 準規(guī)則的一系列豎柱，間距約 5-mm(Doyle等，2002. 295:2237)。
在各種示范性實施方式中，可采用基質(zhì)如色譜介質(zhì)、附著有抗體或其它親 和捕獲材料的凝膠、含有或不含化學(xué)修飾的凝膠、固相提取介質(zhì)、整體料或者 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它分離或結(jié)合基質(zhì)。
2.裂解模塊
在一些實施方式中，可在芯片上或芯片外破壞和裂解靶分析物。可被破壞 或裂解的靶分析物的非限制性例子是(如原核、真核、古細菌)、芽孢(如細菌(如 炭疽桿菌、梭狀芽孢桿菌(C7o^W扁》或真菌(如粗球孢子菌(C./ww/似))、細胞 器(如線粒體、核等)、核酸、染色體、質(zhì)粒、核糖體、蛋白體、病毒(如天花病 毒、流感病毒、西尼羅河病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、肝炎病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)。 在一些實施方式中，可通過超聲處理破壞或裂解靶分析物。在一些實施方式中， 可超聲處理捕獲到珠上的靶分析物，然后將其引入微芯片。
可采用浸入含有粗靶分析物溶液或已捕獲到珠上、濃縮和純化的靶分析物 的溶液中的桿進行超聲破壞。超聲處理器也可以是裝有可直接插入收集器流出 物的探頭的流過式超聲處理裝置(圖6)。也可設(shè)計該室，使其含有或捕獲氣溶 膠，并可如本文所述地自動化。
在一些實施方式中，可通過珠摩擦(bead beating)實現(xiàn)破壞或裂解。該珠 可與本文所述捕獲珠相同或不同。在一些實施方式中，用于裂解和/或捕獲的珠 的不同特性，如磁性與非磁性、不同密度等可用于分離各種類型的珠，以簡化 下游加工或分析。在一些實施方式中，可采用流過、行波、珠摩擦裝置IO(圖 5)。例如，如圖5所示，當極片被旋轉(zhuǎn)時，旋轉(zhuǎn)的磁性極片20產(chǎn)生沿著流過 管30行進的磁波。該旋轉(zhuǎn)可以高達約100 Hz，并可使珠產(chǎn)生足夠的加速通過
相鄰的管，以破碎流過該管的芽孢和其它類型的靶分析物。在一些實施方式中， 珠具有多種形狀以有利于裂解。為了評價破壞或裂解，可用活力損失與時間確定所需的動力設(shè)定、接觸時 間、體積和幾何形狀；本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)定這些參數(shù)。在一些實施方式中，
可用所選樣品測試TaqMan測定中DNA或RNA的釋放。可針對芽孢和正在剪 切的大分子來優(yōu)化破壞，以降低其粘度和截面積，而不使它們不適合下游加工 或分析。在一些實施方式中，可使裂解物通過孔徑大小至少約為lO)iim，甚至 至少約為20pm、 30)am或更大的濾膜，以去除可能堵塞微流體裝置的微通道 的凝塊。
在一些實施方式中，破壞或裂解的材料可用作芯片上或芯片外進一步純化 的給料。例如，為了測定核酸，在具有選擇性寡核苷酸的珠上進行核酸雜交這 一純化步驟可純化背景中的耙序列。對蛋白質(zhì)而言，捕獲到固體表面如疏水性、 羧化或其它化學(xué)物質(zhì)上可非特異性純化一類蛋白質(zhì)，而親和捕獲可在需要時提 供增強的特異性。相似地，可進行多步驟純化，其中采用芯片上和芯片外的混 合和匹配，以及基于珠的基質(zhì)和其它基質(zhì)(如果需要)。
在一些實施方式中，可在引入微芯片后進行裂解。在這種實施方式中，微 芯片接受含有待裂解細胞的樣品。
3.核酸純化模塊
在一些實施方式中，本發(fā)明系統(tǒng)可包括核酸純化模塊(NAPM)?？稍O(shè)計 NAPM，使其接受其它物理形式的溶液或樣品，如一種或多種珠、膠體、多相 (非均相或異相)溶液或其它組合物。在一些實施方式中，可設(shè)計NAP，使其接 受裂解模塊的輸入。NAPM接受的體積范圍可以從毫升至皮升以下。在一些實 施方式中，NAP輸出物可輸送至BPM微芯片或其它微流體裝置，進行進一步 加工或分析。
可使各種化學(xué)物質(zhì)適合NAPM使用。在各種示范性實施方式中，可設(shè)計 NAPM，以用各種方法進行總核酸純化，如用離液劑通過表面吸附/解吸純化； 通過(例如)電泳捕獲到含有寡核苷酸的凝膠上進行選擇性核酸純化；或通過雜 交到含有寡核苷酸的珠上進行選擇性核酸純化。NAPM的一個例子見圖7。
a)總核酸純化可采用非特異性捕獲法純化樣品中的總核酸，該方法采用離液劑將溶液中 的核酸壓到表面上。例如，美國專利號6,489,112描述了定量納米級"模板捕獲" 法，它采用離液劑如硫氰酸鹽或胍鹽將核酸壓到二氧化硅毛細管的表面上。洗 滌后，將濃縮和純化的核酸洗脫到緩沖液中，進行納米級樣品加工或分析，如 循環(huán)測序。也可用該方法純化裂解物中的核酸。
在一些實施方式中，可在玻璃珠或其它合適表面，如通道壁的存在下將輸 入樣品與離液劑混合。離液劑使核酸離開溶液，使它們吸附于玻璃珠或其它表 面。離液劑也使樣品中可能存在的核酸酶失活，從而基本抑制核酸降解。孵育 期后，可通過(例如)真空吸引去除離液劑中溶解的細胞碎片、變性蛋白質(zhì)和其 它組分，并將它們丟棄到廢液流中。可進一步洗滌純化的樣品，以去除其它污 染物，可將核酸洗脫到緩沖液中進行回收并引入微芯片或其它流體系統(tǒng)。
在一些實施方式中，核酸純化條件包括5M硫氰酸鈉，95 °C 90秒變性， 30°C 5分鐘結(jié)合于表面(如玻璃珠)，80MEtOH2秒。在一些實施方式中，可用 幾種不同的離液劑和洗脫回收化學(xué)物質(zhì)將核酸純化到改性珠，如SPRI羧化珠 上。
b)選擇性核酸純化
在一些實施方式中，可通過芯片外雜交于寡核苷酸捕獲序列選擇性純化靶 核酸。
在一些實施方式中，可通過電泳、流體動壓力、離心或其它力將樣品移動 到固定或可移動的基質(zhì)上，所述基質(zhì)包括未改性珠、改性珠、可更換的親和捕 獲凝膠、整體料、膠體、兩相溶液和其它材料。在各種示范性實施方式中，基 質(zhì)可以是未改性的，并根據(jù)材料的表面特性結(jié)合于靶核酸，可改性基質(zhì)以增加 或阻滯樣品組分的結(jié)合，或者基質(zhì)可附著有與靶序列互補的寡核苷酸序列、結(jié) 合抗體或其它親和捕獲材料。在一些實施方式中，寡核苷酸上的生物素標記可 與耙DNA雜交。珠上的鏈霉抗生素蛋白部分可結(jié)合于生物素，以純化所需的 耙核酸。
例如，可將包含靶核酸的樣品施加于結(jié)合有與靶核酸互補的寡核苷酸序列 的珠?？捎玫碗x子強度的緩沖液洗滌結(jié)合的靶核酸以去除鹽、污染物和錯配片段，可通過加熱和電壓洗脫納升體積的靶核酸。在一些實施方式中，親和捕獲 可以是一種快速(《7分鐘)和高效率(循環(huán)測序產(chǎn)物2卯％)的方法。可調(diào)節(jié)該方法
的規(guī)模，使其適應(yīng)芯片外構(gòu)造。輸出體積可約為lOnL-lmL，這取決于物理構(gòu) 造。
在一些實施方式中，也可用上述組合物和方法去除可測定蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、 糖或非關(guān)聯(lián)核酸的樣品中的核酸。
4. 將珠或溶液引入微芯片
可直接或在(例如)本文所述的捕獲和核酸純化加工后將樣品引入各種微 流體裝置或其它流體系統(tǒng)。在一些實施方式中，可將小體積，如微升或納升體 積的來自親和捕獲步驟的珠引入微芯片?？捎?如)注射器泵或移液裝置將珠泵 入微芯片上的儲存庫，可用微芯片上的泵將珠移動到微芯片的一個部分中，在 該部分可捕獲或保留珠。
在一些實施方式中，單個珠可在微芯片上移動，以進行加工或分析，如 DNA測序、單分子分析、蛋白質(zhì)的MS分析，包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離 (MALDI)掃描和肽指紋分析。在微芯片上可用(例如)流式細胞技術(shù)將單個珠導(dǎo) 向單獨小室?；蛘?，可用隨機分配法將單個珠放入小室，在這種方法中，平均 來說，預(yù)計每個小室僅有一個珠到達。
在一些實施方式中，可在各種類型的流體系統(tǒng)(如分批模式)或流過系統(tǒng)， 或其組合中進一步加工樣品。系統(tǒng)可基于微芯片、毛細管、管道、孔或其它容 器和微流體裝置。可通過生化方法或化學(xué)方法加工引入的樣品以分離組分、標 記組分，或在微芯片上進行分析，或準備用于下游分析。
5. BPM
BPM—般包括可由下述設(shè)備和可編程軟件任選地操作的一個或多個微流 體裝置。在一些實施方式中，微流體裝置可以是筒中裝配的微米芯片、納米芯 片或皮米芯片，該裝置能輸入SCPM的樣品、指導(dǎo)流體線路和反應(yīng)室之間的液 體路由、加入試劑和進行各種耙分析物(如核酸和毒素)的測定。在一些實施方 式中，各種類型的芯片可在單獨的生物處理器模塊中加工樣品，其中采用MOV閥、泵和路由選擇器作為系統(tǒng)控制零件，從而控制反應(yīng)時間和順序。在一些實 施方式中，本文所述芯片可與SCPM集成。
a) 微型機器人控制的芯片上的閥和泵(MOVTM)技術(shù)
MOV微型闊、微型泵和微型路由選擇器組合了兩個玻璃微流體層，具有 一個可形變的膜層和一個氣動層，可形變的膜層如聚二甲基硅氧烷(PDMS)， 它能打開和關(guān)閉閥，氣動層能使膜變形并起動該閥。上層玻璃層中蝕刻的流體 通道(圖9)不連續(xù)，并通向用作閥座的通路。PDMS膜40安置在閥座上，通常 關(guān)閉兩個通路之間的流體路徑。在PDMS膜40反面，蝕刻形成的氣動移位室 連接于全尺寸(fullscale)真空或壓力源。通過控制小型化的芯片外電磁閥，可 將真空或壓力(約半個大氣壓)施加于PDMS膜40，以通過彈性膜的簡單變形打 開50或關(guān)閉60該閥。
可通過協(xié)調(diào)三個閥70、 80、 90的操作制備自吸性MOV泵(圖10)，它可 產(chǎn)生雙向流動?？赏ㄟ^安排起動順序的定時、隔膜大小、改變通道寬度或其它 芯片上的尺寸實現(xiàn)各種流速?？捎眠@些閥和泵類似地形成路由選擇器(圖11)。 可用三個或多個閥形成路由選擇器，這些閥各自位于連接于中央隔膜閥100的 分離通道110、 120。通過起動合適的閥組合，可將通道之一的液體抽入中央隔 膜閥并排入不同通道，從而指導(dǎo)液體的路由。也可產(chǎn)生總線(bus)結(jié)構(gòu)。
可在一種制造方法中用一層PDMS膜同時產(chǎn)生MOV閥和泵，即在芯片上 產(chǎn)生5個MOV泵的成本與產(chǎn)生500個的成本相同。因此，本文所述內(nèi)容提供 了在芯片上產(chǎn)生復(fù)雜的微米、納米、皮米流體線路的方法，并且，事實上能夠 將任何反應(yīng)或測定引入到芯片上。通常，此技術(shù)可能至少對溶液離子強度和表 面污染的變化基本不敏感，并且不需要施加電場。
b) 微流體裝置
圖31顯示了可用于核酸分析的一個生物處理器模塊的例子。在這個設(shè)計 中，可將結(jié)合有來自IMS和核酸純化的純化核酸的捕獲珠輸入下方通道350。 芯片上的MOV泵351將該珠移動到閘板352，在此處可通過局部加熱釋放核 酸并將核酸泵入pRT-PCR室353作為實時PCR試劑，可通過試劑輸入加入內(nèi)標。環(huán)繞該室的閥關(guān)閉以進行熱循環(huán)。
圖32顯示了采用圖31的設(shè)計在6"微芯片上設(shè)計48個單元的例子。在一 些實施方式中，可將96個或更多單元輻射狀地布置在6"芯片上。在一些實施 方式中，可將384個分離通道布置在8"芯片上。如果通道僅重復(fù)使用約3次， 那么96通道微芯片可操作約30天。在一些實施方式中，可將240個單元輻射 狀地布置在12"微芯片上，這取決于最終規(guī)格的要求、所測試的靶分析物的數(shù) 量和多路程度。
在一些實施方式中，各種芯片可包括鉆出的通路孔，這些通路孔形成的閥 室就是可用于(例如)RT-PCR的反應(yīng)室(圖29)。采用厚3 mm的鉆孔晶片和300 pm直徑的鉆孔機，可產(chǎn)生212nL小室，沿長軸(而非橫穿通道)的檢測路徑長 度為3mm。在一些實施方式中，這些小室可具有出色的表面積體積比。在一 些實施方式中，較大體積可具有較好的表面積體積比和較長的路徑長度。通常， 可以橫穿通道在芯片上進行檢測，其通路長度等于通道深度，約為30jiim;相 似地，在毛細管系統(tǒng)中，通路長度約為50-200pm。通過這種簡單設(shè)計，出色 的體積表面積比和約長100倍的通路長度分別有利于樣品制備生物化學(xué)(通過 較高的體積表面積比)和熒光檢測。相同的檢測設(shè)計可用于檢測毒素。
在一些實施方式中，各種芯片可采用MOV路由選擇器并加入試劑如含有 內(nèi)標的PCR主混合物(master mix)將輸入樣品分為合適數(shù)量的反應(yīng)(取決于所實 現(xiàn)的多路程度)。如圖33所示，可用輸入MOV路由選擇器將法醫(yī)儲存和再測 試樣品分成等份，然后可選擇來自陽性實時PCR反應(yīng)的樣品進行pCAE。圖 33說明在一些實施方式中，各生物處理器單元或反應(yīng)中不需要pCAE通道。在 一些實施方式中，整個6"微芯片上可采用2-4條)iCAE通道，因為它們可用于 驗證并可深度嵌套以連接幾十個實時PCR小室和其它類型的試驗小室(如毒素 試驗小室)。
圖25說明用于生物防衛(wèi)應(yīng)用的微芯片的例子，它設(shè)計為一次性筒和操作 該微芯片進行病原體的樣品制備的平臺。該芯片包括MOV閥、泵和反應(yīng)室， 注射試劑的樣品端口，以及與上游濃縮模塊和下游分析模塊接口相連的進口和 出口。圖17說明采用圓形基材的微芯片，該圓形基材上輻射狀布置了 12個生 物處理器單元。在一些實施方式中， 一次可使用一個單元，在各次使用之間可旋轉(zhuǎn)該微芯片。或者，可采用基材幾何形狀不同并且流體設(shè)計不同的實施方式。
含有流體系統(tǒng)的生物處理器模塊(在本實施例中在微芯片上)可接受上游 SCPM的樣品，產(chǎn)生用于儲存和再測試的等份，在芯片上裂解樣品，制備和標
記樣品，以及將它們輸出至檢測器進行分析。在本實施例中，BPM包括含有 流體系統(tǒng)的微芯片筒和操作筒的設(shè)備。該筒可以是"CD"形式，每個筒的扇 區(qū)中具有12個生物處理器單元，各單元用于一種樣品或多種樣品(圖17)。例 如，該筒可加工一種樣品，然后旋轉(zhuǎn)以接受下一個樣品。該筒可適合于不同取 樣方案并按需改變。在一些實施方式中，可將筒組儲存于類似于CD交換器的 小圓盤傳送帶中。該設(shè)備可提供某些機構(gòu)來儲存、加載試劑、運行和換筒，以 及控制該過程。
在一些實施方式中，可采用納米生物處理器筒，設(shè)計該筒的目的是用筒上 裝配的MOV閥和泵作為控制元件的納米流體系統(tǒng)加工樣品。MOV閥通常是 關(guān)閉的、高低不平的(rugged)、容易制造的、可在密集陣列中操作的并具有 低死體積。可按照Grover等(2003)' Sensors and Actuators B89: 315-323的設(shè) 計，通過組合玻璃層與作為可變形膜的聚二甲基硅垸(PDMS)層來制備閥。
在一些實施方式中，可通過組合圖9所示閥中的三種閥制備自吸泵(圖10)。 中央隔膜閥可大于用于控制流向的側(cè)閥。此外，中央閥可用作反應(yīng)室或混合器 PDMS的變形可高達2mm，產(chǎn)生可容納多至幾百微升或少至幾十納升的反應(yīng)室 (Grover等(2003)， Sensors and Actuators B89: 315-323)。這些小室可動態(tài)擴展 和收縮。
在本發(fā)明中，MOV閥和泵可組合為處理器，以制備和加工微升和納升級 的樣品。
在本發(fā)明中，可改變通路孔大小，以在通路孔中產(chǎn)生反應(yīng)室。通過組合通 路孔寬度和通路孔通過的晶片厚度的變化，可形成各種范圍的小室。除了用作 反應(yīng)室以外，通路孔也可用于增加用于光學(xué)檢測和其它檢測的路徑長度。例如， 圖29顯示了微芯片230，其中通路孔231用于進行實時PCR并用作檢測室。 也可用內(nèi)反射物質(zhì)涂覆通路孔或晶片基材以增強檢測。
6.應(yīng)用、設(shè)備和軟件在一些實施方式中，微芯片可裝在真空吸盤的固定位置中。微芯片接口裝 置可連接于微芯片，以提供外部控制元件，包括外部氣動元件、熱循環(huán)溫度控 制元件、溫度控制裝置和試劑引入線。
圖16顯示了設(shè)計用外部操縱的MOV閥和泵控制流動的微芯片筒的實施 方式，其中較大的中央隔膜閥也用作反應(yīng)室。該筒含有三條進行生物處理的主
通道160-162、儲存區(qū)170和儲存庫180。這些通道之一可用于加工基于DNA 的分析所用的樣品，第二條和第三條通道分別用于加工免疫測定分析所用的毒 素和顆粒。圖16所示設(shè)計是許多可能設(shè)計之一，該設(shè)計與用于生物防衛(wèi)應(yīng)用 的下游單分子檢測器接口相連。
在一些實施方式中，該筒可如下所述地運行。加入內(nèi)標后，芯片外樣品濃 縮器將100W樣品遞送至筒上的輸入儲存庫190。用標為"A"的路由選擇器 200將7份未處理的lOpl等份從儲存庫泵入筒上的儲存庫(保持4°C)。這些等 份中三份用于再測試180，如果分析樣品測試為陽性，可進行驗證；如果再測 試確認了初始陽性檢測結(jié)果，那么將另外4等份170用于進行后續(xù)補救(retrieval) 和法醫(yī)學(xué)分析。通過外部冷卻器如TEC Peltier冷卻器將所有等份冷卻儲存在筒 上；如果需要，可干燥儲存于這些儲存庫中。筒使用后，將使用過的筒儲存于 冷藏的小圓盤傳送帶中。
然后，形成和加工立即加工的等份。通過路由選擇器A200將10pL試驗 等份移動到生物處理通道2 161-室D163，進行免疫標記以檢測毒素，如下所 述。通過路由選擇器A 120將第二個lOpL試驗等份移動到生物處理通道3 160-室E164，進行免疫標記以檢測完整的細菌或病毒顆粒，如下所述。然后，從 上面蓋上輸入儲存庫，用通過筒底部偶聯(lián)的外部超聲處理器桿超聲處理其余樣 品。產(chǎn)生的超聲波能破壞植物細胞、芽孢和病毒，并剪切DNA，從而降低粘 度以改進雜交動力學(xué)和流動特性。通過路由選擇器A200將裂解的樣品移動到 生物處理通道1 162-室C165，與標記探針雜交以進行DNA分析。
三條通道的生物處理可同時進行。可能需要能降解RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì) 的樣品消化步驟來降低基于DNA的單分子檢測樣品的背景，并降低下游檢測 器的需要。如果進行這種加工(如單分子檢測中)，那么在DNA分析樣品中可 加入緩沖液配制的RNA酶、蛋白酶和脂酶的混合物，以降解非DNA物質(zhì)?？赏ㄟ^將儲存庫B的物質(zhì)泵入含有樣品的小室C實現(xiàn)加入。如果需要，可將樣 品和消化試劑在相鄰小室之間來回抽吸以混合。可標記小室C中的等份，以通
過與儲存庫F的DNA探針雜交進行DNA分析?？蓪㈦s交探針或抗體探針冷 藏在試劑筒中，并在使用單個生物處理器單元之前才用外部泵加入筒。可用筒 上的泵將探針泵入小室，以混合試劑。再一次，如果需要，可將樣品和試劑在 探針室和反應(yīng)室C之間來回抽吸以進一步混合。該設(shè)備的小室下面可裝有加熱 元件。在雜交中，可以關(guān)閉側(cè)閥，將小室加熱到95"C以使DNA變性，然后冷 卻到雜交優(yōu)化條件以使DNA探針與存在的任何目標物雜交。這些閥的密封足 以使得能夠在這些小室中進行PCR，因此，可基本上避免蒸發(fā)。
上述BPM可應(yīng)用于任何基于PCR的測定，如單獨或多重PCR、可變數(shù) 量的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)、多基因座VNTR分析(MLVA)或其它測定。可用合適的 PCR引物和外部熱源循環(huán)取代雜交探針。可用限制性消化取代消化步驟，以實 現(xiàn)擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)。在毒素檢測中，小室D中的等份可與儲存庫G 的毒素的抗體探針混合，而在顆粒檢測中，小室E中的等份可與儲存庫H的 微生物表面被膜(coat)的抗體探針混合，樣品維持于37°C。
標記后，可將生物處理過的樣品泵入三個外部儲存庫中，在儲存庫中可通 過吸出獲得這些樣品用于檢測器分析?；蛘撸捎米兓问降奈⑿酒M行毛細 管電泳或光學(xué)檢測。
如果檢測器僅檢測到內(nèi)標，那么可旋轉(zhuǎn)該筒并準備下一個生物處理器單 元。如果樣品測試為陽性，則不旋轉(zhuǎn)生物處理器單元，取而代之的是由再測試 沖洗庫沖洗并加載新鮮試劑?？赏ㄟ^路由選擇器將儲存用于再測試的三種樣品 泵回， 一種直接泵入小室D進行毒性檢測，第二種泵入小室C進行顆粒檢測， 第三種泵入輸入儲存庫進行超聲處理和DNA分析?？扇缟纤黾庸ぴ贉y試樣 品，并輸出至檢測器，作為可能的假定陽性檢測事件進行驗證。
作為外部設(shè)備的微芯片接口裝置可包括操作微芯片的設(shè)備?？砷_發(fā)一種微 芯片，其中微芯片筒裝在真空吸盤頂端，微芯片接口裝置與微芯片連接，其具 有氣動部件、加熱部件和冷卻部件、以及注射器泵以將試劑移動到儲存庫中。 計算機控制的微芯片接口裝置可控制電磁閥，以開放和關(guān)閉外部全尺寸(full scale)閥，這些閥又控制微芯片閥和泵以吸移動微芯片上的樣品。微芯片接口裝置可包括加熱器，例如電阻加熱器，如鎳鉻合金、Peltier加 熱器、基于空氣的加熱器、紅外加熱器或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它實施方式， 還可包括熱電偶或其它溫度測定裝置，以及相連的控制電路和軟件，以控制微 芯片的某個區(qū)域的溫度和加熱及冷卻速率。冷卻可以是輻射冷卻、風扇主動冷 卻、Peltier冷卻、水冷或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法。也可通過加熱真空 吸盤設(shè)定整個芯片的溫度。
可控制注射器泵以將試劑遞送至安裝的微芯片上的儲存庫，或者含有試劑 的加壓室可具有打開以允許試劑流過小管進入微芯片上的儲存庫的閥。在一些 實施方式中，可采用重力流。在一些實施方式中，利用電力移動試劑、利用磁 力遞送附著于珠或顆粒的試劑也屬于本發(fā)明范圍。可用Laboratory Rapid Automation Toolkit軟件或其它軟件控制所有上述硬件和NanoPrep軟件。
Laboratory R叩id Automation Toolkit(LabRATTM)軟件平臺500(圖26)是設(shè) 備軟件開發(fā)包，它能夠快速產(chǎn)生強大的商業(yè)級軟件平臺來驅(qū)動設(shè)備和使工藝自 動化。LabRAT定義了一組通信和控制協(xié)議501-503，它具有標準化的自動化 體系結(jié)構(gòu)和架構(gòu)，它比任何現(xiàn)有的商業(yè)軟件平臺更簡單、更靈活、更有效率。 LabRAT架構(gòu)基于一組可跨越多種操作系統(tǒng)、開發(fā)語言和通信媒介504的核心 技術(shù)。
LabRAT自動化體系結(jié)構(gòu)的心臟是基于XML-RPC(可擴展置標語言-遠程 過程調(diào)用)的設(shè)備通信和控制接口協(xié)議，它是SOAP(簡單對象訪問協(xié)議)標準的 核心。XML-RPC是進程間通信的出色機制它簡單、快速、強大、幾乎在每 一種現(xiàn)有軟件開發(fā)系統(tǒng)中都有廣泛應(yīng)用性、在TCP/IP和HTTP上操作、并且 易于實現(xiàn)。XML-RPC作為非常高水平的"中間機制(meta-mechanism)"操作， 并可將不同部件連接在一起成為緊密排列的設(shè)備系統(tǒng)。除了核心通信和命令協(xié) 議以外，也定義和實現(xiàn)一組適合實驗室設(shè)備的接口，以在部件之間交換"實驗 室服務(wù)"。
已經(jīng)使LabRAT或類似軟件適合控制微芯片接口裝置。一旦單個部件的驅(qū) 動程序被覆蓋(wrapped)，現(xiàn)有的LabRAT軟件為所有層提供功能?？刂凭?部熱循環(huán)的NanoPrep熱循環(huán)儀軟件已經(jīng)合并到LabRAT中。氣動電磁閥、注 射器泵和其它元件(包括檢測器)也可由LabRAT軟件控制。此外，可通過LabRAT腳本命令協(xié)調(diào)不同硬件部件的相互作用。
在一些實施方式中，可控制以下三種硬件裝置l)加熱和熱循環(huán)，2)芯片 上的閥和泵(氣動操作)，和3)用于遞送試劑的注射器泵?？捎弥苯游挥诜磻?yīng)室 下并由現(xiàn)有的NanoPrep軟件和硬件控制的鎳鉻合金加熱線圈實現(xiàn)熱循環(huán)。 MiniPrep Cartesian機器人(Tecan)可用于驅(qū)動"智能I/0"板(Tecan)，以操作控 制芯片上微型機器人控制的闊和泵的多達32ttl的輸出線，以及用于在微芯片 上加載或卸載樣品的全尺寸(full scale)機器人；LabRAT CAN接口也可操作 高精度注射器泵，以將流體分配到芯片中。
智能I/O板可驅(qū)動Crydom固態(tài)繼電器模塊(每條線一個，MODC-5 SSR模 塊(DigiKey存CC1226-ND)和MS-4 4-Pos安裝板(DigiKey #CC1230-ND))，它進 而可操作24VDC電磁閥(ARO， P251SS-024-0)。這些閥是三通的直接驅(qū)動單 元， 一個是通用端口，另外兩個端口一個常開一個常閉(分別連接于真空和加 壓空氣線)。該電磁閥控制8條全尺寸(full-scale)真空和壓力線，它們將通過 8條多支管(微芯片上的Ml-M8)進行操作。控制軟件可連續(xù)操作這些電磁閥， 以產(chǎn)生驅(qū)動芯片上通道內(nèi)的流體的泵吸作用。機器人控制軟件可以是LabRAT 軟件控制下的Express腳本引擎(Tecan)執(zhí)行的ASCII編碼腳本形式?，F(xiàn)有 LabRAT軟件提供了用先進的基于XML-RPC的架構(gòu)操作設(shè)備的完整功能。
可將操作微芯片的硬件開發(fā)為獨立的設(shè)備或與現(xiàn)有設(shè)備組合。例如，可用 Tecan MiniPrep設(shè)備按需在芯片上或芯片外吸取溶液，用Tecan智能I/O卡控 制硬件，進而控制MOV閥和泵。
圖27顯示了將MiniPrep機器人和微芯片聯(lián)用的系統(tǒng)的正視圖。該平臺的 前景(foreground)(右)是鋁合金真空吸盤。該吸盤具有電阻加熱元件，它嵌入能 夠全局加熱該芯片的"三明治型"結(jié)構(gòu)中。在最左端黑色圖片的頂部可見溫度 控制器。從該吸盤的左側(cè)，驅(qū)動芯片上的閥和泵的8條真空線通過管道連接于 安裝在Tecan面板之一的背面的真空支管(此照片中不可見)。該平臺的左側(cè)是 用于將"儲存庫"試劑分配到芯片上的注射器泵(連接有注射器)。
圖28顯示了含有許多安裝部件的MiniPrep的內(nèi)側(cè)(去除背面板之后)，所 述安裝部件包括溫度控制器、8個24V DC電磁閥和繼電器。空氣泵和智能I/0 板也安裝在MiniPrep內(nèi)側(cè)，但不可見?？稍O(shè)計本文所述生物處理器筒使其用微流體筒上閥和泵作為控制元件加 工樣品?？稍O(shè)計該筒，以用這些外部驅(qū)動的閥和泵控制流動，較大的中央隔膜 閥也用作反應(yīng)室。圖15顯示了筒上12個相同的生物處理器單元200中的一個。
各單元輸入樣品并制備三種經(jīng)生物處理的輸出樣品201-203: l)用DNA雜交標 記進行DNA分析，2)用免疫標記進行毒素分析，和3)用免疫標記進行顆粒分 析。此外，各單元可具有用于試劑加入204、混合和反應(yīng)205以及儲存再測試 樣品206的區(qū)域。
在一些實施方式中，加入內(nèi)標后，可用空氣取樣器將lmL樣品遞送入筒 上的輸入儲存庫207。輸入儲存庫可帶有粗濾器，加入它的目的是去除可能阻 塞通道的"大顆粒"?？蓪⑽刺幚淼?00 等份從輸入儲存庫泵入標為"A"的小 室208中，然后進入維持在4"C的筒上儲存庫206。儲存樣品可用于l)再測 試，以及如果分析樣品測試為陽性，可能用于驗證；和2)如果再測試確認了初 始陽性檢測結(jié)果，則用于后續(xù)補救和法醫(yī)學(xué)分析?？捎猛獠坷鋮s器如TEC Peltier冷卻器冷藏筒上的儲存樣品；如果需要，可將穩(wěn)定試劑干燥儲存于這些 儲存庫中。筒使用后，將使用過的筒儲存于冷藏的小圓盤傳送帶中。
在一些實施方式中，可形成和加工用于立即加工的3等份DNA、毒素和 顆粒。首先，可將用于毒素標記的100pL試驗等份泵入小室A208，并可泵入 用于免疫標記和檢測毒素的試劑。如果需要，可將樣品來回泵吸至小室B 209 以混合樣品和試劑?？蓪悠繁萌胼敵鰞Υ鎺?01-203，進行孵育并轉(zhuǎn)移至檢 測器?？蓪⒌诙€lOOiaL試驗等份移入小室A208，進行免疫標記以檢測完整 的細菌或病毒顆粒。可將微生物或病毒表面被膜的抗體探針泵入小室A 208， 可將樣品維持在37。C。抗體探針可以是隨后可用檢測器區(qū)分的抗體的復(fù)雜混合 物。標記后，可將生物處理的顆粒樣品泵入儲存庫，以通過吸引將樣品引入毛 細管進行檢測器分析。
在DNA樣品制備中，為毒素和顆粒檢測加工這些等份和樣品后，可從上 面蓋上輸入儲存庫，用通過筒底部偶聯(lián)的外部超聲處理器桿超聲處理其余樣 品。產(chǎn)生的超聲波能破壞植物細胞、芽孢和病毒，并剪切DNA，從而降低粘 度以改進雜交動力學(xué)和流動特性?？蓪⒘呀鈽悠窂脑噭┹斎?04移動到小室A 208中與標記探針雜交，以進行DNA分析。為了雜交，該設(shè)備的小室A208下面可裝有加熱元件?？申P(guān)閉側(cè)閥，將小室加熱到95"C以變性DNA，然后冷 卻到最優(yōu)溫度以使DNA探針與存在的任何目標物雜交。這些閥的密封足以使 得能夠在這些小室中進行PCR，因此，可基本上避免蒸發(fā)。
可能需要降解RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的樣品消化步驟來降低基于DNA的檢 測樣品的背景和降低下游檢測器的需要。如果需要這種加工，那么從試劑輸入 208加入的DNA分析樣品的緩沖液中可含有RNA酶、蛋白酶和脂酶的混合物， 以降解非DNA物質(zhì)?？赏ㄟ^將材料泵入含有樣品的小室A 208實現(xiàn)加入。如 果需要，可將樣品和消化試劑在相鄰小室A 208和B 209之間來回抽吸以混合。 如果需要消化，可標記小室A 208中消化的等份通過以與本文所述DNA探針 雜交進行DNA分析。
雜交探針或抗體探針可冷藏于試劑筒中，并在單個生物處理器單元臨用前 用外部泵加入筒中?？捎猛采系谋脤⒃撎结槺萌胄∈乙耘c試劑混合。再一次， 如果需要，可將樣品和試劑在小室A和B之間來回抽吸以進一步混合。未來 的設(shè)備可含有預(yù)加載到生物處理器筒中的試劑。
在一些實施方式中，如果檢測器僅檢測到加入的內(nèi)標，那么可旋轉(zhuǎn)該筒并 準備下一個生物處理器單元。如果樣品測試為陽性，則不旋轉(zhuǎn)該生物處理器單 元，取而代之的是用來自試劑輸入(裝置)的緩沖液沖洗?？蓪?00 ^L儲存 樣品泵回到小室A中從測試陽性的方法開始進行再測試?？扇缟纤黾庸ぴ贉y 試樣品，并輸出至檢測器作為可能的假定陽性檢測事件進行驗證。LabRATTM 軟件可用于控制注射器泵、小室A的熱循環(huán)加熱元件和用于操作芯片上閥的全 尺寸(full scale)電磁閥。
可根據(jù)全體積或宏觀體積結(jié)果單獨優(yōu)化雜交和抗體結(jié)合的化學(xué)。根據(jù)筒形 式和在采用摻入(spiked)空氣樣品的重組實驗中測試的一系列輸入微生物的影 響再優(yōu)化反應(yīng)物濃度、反應(yīng)事件和溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定試劑的貯存 條件。所有試劑可儲存于4t:的試劑筒中；可加入其它穩(wěn)定劑如滲透壓保護劑 (osmoprotectant)(海藻糖、甘氨酸甜菜堿)或其它物質(zhì)以延長保存期限。
在一些實施方式中，進行混合的方案可以是，布置兩條液流使其在通道中 混合，其中薄層蝕刻面上， 一條在另一條的上方。液流之間的短路徑增強了混 合。另選的混合方案可利用珠(如磁珠)存在于反應(yīng)室或加入它們以通過磁性操作該珠破壞層流。在一些實施方式中，這可將一條液流中的耙分析物壓入"另 一"液流，可用于啟動處理或分析反應(yīng)。在一些實施方式中，如果需要可用閘 板捕獲珠。在一些實施方式中，在使用后可沖洗出珠使其進入廢液。
試劑穩(wěn)定可能是所述系統(tǒng)的各種實施方式如野外裝置的主要問題。因此，
在一些實施方式中，試劑儲存庫可用Peltiers冷卻至4。C進行溫度控制。在一些 實施方式中，可用Ready-To-GoTM化學(xué)方法或采用滲透壓保護劑如海藻糖或甘
氨酸甜菜堿的其它凍干方法穩(wěn)定試劑，然后在用前再水化。再水化構(gòu)思可以是 每天或每周取出密封可破壞的安瓿中穩(wěn)定試劑的等份?？蓪⑺蚓彌_液泵入該 設(shè)備中的安瓿以將穩(wěn)定的試劑水化提供每天或每周的工作母液?？蓪⒐ぷ髂敢?移動入注射器泵或直接加載到生物處理器中，這取決于穩(wěn)定性。
a)微珠集成DNA測序(MINDS)系統(tǒng)。
在一些實施方式中，MINDS系統(tǒng)可通過自動化、無人操作地制備和分析 Sanger樣品而超低成本制備和分析測序樣品?？稍谥樯蠌募羟械娜旧w或BAC DNA開始用大量乳劑PCR反應(yīng)制備測序模板，各珠攜帶衍生自一種DNA片 段的DNA。分選去除無片段的珠后，可將單個珠遞送至整合到帶凈化和pCAE 分析的400通道微芯片上的小體積(如25 nL)循環(huán)測序反應(yīng)室中。在一些實施方 式中，可通過閘板捕獲珠，可進行正向和逆向成對末端閱讀的循環(huán)測序，將產(chǎn) 物電泳入雙樣品凈化室，其中含有親和凝膠捕獲基質(zhì)以進行正向或反向閱讀。 可洗滌親和凝膠以去除離子和未結(jié)合的核苷酸?？赏ㄟ^提高溫度來洗脫親和基 質(zhì)中純化的循環(huán)測序片段，然后注射入折疊的CE通道進行電泳分析。此方法 可使試劑體積和成本降低幾個數(shù)量級，部分因為它可以接近分子數(shù)量的基本限 制的規(guī)模進行測序。
在一些實施方式中，集成的MINDS系統(tǒng)可使鳥槍測序、定向測序和再測 序的所有過程自動化和小型化。MINDS系統(tǒng)可產(chǎn)生基于微珠的熒光DNA HCAE測序儀，其運行成本比維持現(xiàn)有測序設(shè)備的成本低100倍或更多。各系 統(tǒng)可進行無人操作的完全自動化的測序長達一周，用小型機器人控制的微流體 裝置取代大型(full-scale)機器人。MINDS系統(tǒng)可以分模塊執(zhí)行，然后集成在一起。在一些實施方式中，可 采用基于200 nL循環(huán)測序微芯片的模塊。將基于先進的旋轉(zhuǎn)LIF掃描器的DNA 分析模塊構(gòu)建為用于MINDS系統(tǒng)的平臺模塊，其中裝有pCAE微芯片，該芯 片可在注射入釆用先進基質(zhì)的電泳通道對之前用雙親和捕獲室凈化成對末端 閱讀樣品?？赏ㄟ^MOV閥和泵操作這5層微芯片，"實現(xiàn)"(servicing)微流體操 作。循環(huán)測序模塊可組合在芯片上，產(chǎn)生整合100 nL循環(huán)測序、樣品凈化和 分離的核心MINDS芯片。在一些實施方式中，制備25 nL樣品的完整MINDS 芯片可輸入微珠庫，并獲得輸出序列信息。
b)循環(huán)測序模塊
微流體循環(huán)測序模塊(CSM)可用作MINDS系統(tǒng)中的獨立功能，也可用作 基于微芯片的樣品制備的模塊。CSM可包括l)含有樣品制備微流體裝置的微 芯片，芯片上裝有閥和泵以控制流動，和2)外部接口，以通過芯片上的閥和泵 操作微芯片。樣品制備CSM可以是循環(huán)測序體積為200 nL的16條通道的規(guī) 模，用毛細管(CAE)和微芯片OiCAE)進行芯片外分析。在一些實施方式中，可 將具有外部流體接口、加熱和氣動裝置的微芯片接口裝置(MID)的規(guī)模改變到 400條或更多條通道。
在一些實施方式中，可采用芯片上裝有閥和泵的16通道的200nL循環(huán)測 序樣品制備微芯片裝置。圖14中示意性地顯示了簡化的微芯片筒的兩條通道。 標為"輸入"260和"輸出"261的儲存庫主要是可連接于微流體通道的微芯片262 的上層中的孔洞。該裝置可接納微量滴定板上的輸入DNA樣品(PCR、質(zhì)?；?其它模板)，以200 nL體積進行循環(huán)測序，并將熒光標記的循環(huán)測序產(chǎn)物輸出 到準備用于樣品凈化和注射到CAE設(shè)備或pCAE分析的微量滴定板中?？赏?過微芯片接口裝置操作微芯片，該接口裝置是由LabRATTM軟件驅(qū)動的。CSM 微芯片接口裝置可為以下過程提供機械力l)開放和關(guān)閉芯片上的閥，2)操作 芯片上的泵，3)測定從儲存(裝置轉(zhuǎn)移)到微芯片上的循環(huán)測序試劑，4)控制 加熱和冷卻以進行循環(huán)測序，和5)用緩沖液和洗滌溶液再生芯片。微芯片和 MID可安裝在可進行流體轉(zhuǎn)移的Tecan MiniPrep流體處理機器人的平板上。在一些實施方式中，可如下操作200 nL CSM微芯片?？捎肨ecan MiniPrep機器人將樣品從微量滴定板加載到輸入260儲存庫的孔中。通過驅(qū)動 芯片上泵的真空/壓力線的外部致動控制泵吸，從而將MOV芯片上的泵264可 將等份移動到反應(yīng)室中，如圖9-10所述?？赏ㄟ^芯片上的泵泵吸循環(huán)測序混 合物265(CS混合物，圖14)，以將染料終止物循環(huán)測序主混合物分配到反應(yīng)室 263中。在計算機控制下，MID密封了環(huán)繞各反應(yīng)室263的三個閥，并對反應(yīng) 混合物進行熱循環(huán)。完成后，可通過筒上的泵將200 nL樣品泵入含有5 hL水 的輸出儲存庫261。可用Tecan將稀釋的樣品移動到微量滴定板中的35 pL醇 中，以進行隨后的芯片外后處理和分析。在一些實施方式中，可將樣品移動到 雙親和捕獲室進行凈化和分析?？捎镁彌_液沖洗CSM筒，以去除殘留的DNA 模板，再加載新樣品，再次開始該過程。循環(huán)測序可耐受的來自前一反應(yīng)的模 板的大于5%的污染因此沖洗該反應(yīng)室可再生微芯片。在一些實施方式中， 各微芯片可重復(fù)用于幾百個反應(yīng)。
c)CSM設(shè)備
操作CSM的設(shè)備的特征可包括l)使芯片上的微型機器人的外部致動的
自動化，該機器人能控制基于CSM微芯片的筒中的液體移動，2)控制外部加 熱和冷卻以進行熱循環(huán)，3)驅(qū)動注射器泵以將循環(huán)測序試劑遞送至芯片和4)控 制Tecan MiniPrep機器人以將樣品從微量滴定板移動到輸入儲存庫中，并從微 芯片輸出儲存庫取出制備的循環(huán)測序樣品放入微量滴定板中。可通過LabRAT 軟件控制所有這四個元件。
熱循環(huán)可采用外部來源進行加熱和冷卻以簡化微芯片制造，并降低操作成 本。 一些實施方式采用一組電阻加熱線圈，并用風扇冷卻。在一些實施方式中， 例如采用置于微芯片頂端的裝有熱電偶傳感器的鎳鉻合金加熱器，其加熱速率 可達到30。C/秒以上。在一些實施方式中，可在400條通道的水平可重復(fù)和可 靠地操作加熱器，無需監(jiān)測每條通道。在一些實施方式中，當將樣品制備和分 析集成在一起時，可封閉冷卻空氣以防止其改變微芯片其它部分的溫度。在一 些實施方式中，可使用條狀高效Peltier效果熱泵以快速循環(huán)反應(yīng)室的溫度。這 些各種方法可采用LabRATTM控制下的現(xiàn)有NanoPrep熱循環(huán)軟件。由Peltier熱泵保持冷卻的注射器泵可用于將循環(huán)測序試劑遞送至微芯片 上的CS儲存庫通道，用芯片上的泵分配試劑來補充該儲存庫。類似地，可遞 送和控制水或緩沖液以再生微芯片。在一些實施方式中，注射器泵的全步(full step)長可以是l nL，它可由LabRATTM軟件控制。在一些實施方式中，可能 采用根據(jù)簡單重力流動的溶液來補充儲存庫；在軟件控制下的小閥可調(diào)節(jié)流 動。
在一些實施方式中，可以在Tecan MiniPrep的平板上實施CSM。 Tecan 可將樣品從微量滴定板移動到輸入儲存庫中，并從輸出儲存庫獲得最終樣品， 并將它們移動到微量滴定板。Tecan能夠操作單個注射器泵，其尖頭安裝在機 器人上，X-Y-Z運動在CAN控制下。如上所述，LabRAT軟件可用Microsoft WSH控制器控制CAN裝置。將液體移動到微量滴定板或從微量滴定板移動液 體的腳本很簡單。采用Tecan代替手工移液能夠允許CSM以完全自動化的模 式操作。
在一些實施方式中，CSM可包括芯片上的取樣循環(huán)順序以及芯片外 MegaBACE CAE和pCAE微芯片系統(tǒng)的分析?？苫景凑丈a(chǎn)商的詳細說明 書用DYEnamicTM ET終止物測序試劑盒(Amersham)進行染料-終止物測序反 應(yīng)。在一些實施方式中，可對試劑進行30個下述循環(huán)95°C 25秒，5(TC 10 秒和6(TC2分鐘。熱循環(huán)后，可將樣品移動到微芯片輸出儲存庫中，并用氣壓 轉(zhuǎn)移到微量滴定板中40pL80。/。乙醇(室溫)中。在乙醇后處理中，可以約2,800 RCF離心樣品45分鐘，通過以50RCF反向離心30秒去除醇。可將樣品懸浮 于10pL雙蒸水。
對照可包括在微量滴定板中制備的全體積樣品以及在毛細管中制備的 500 nL和200 nL NanoPrep樣品。可用10 kV、 15秒注射將樣品注射入96-毛細 管MegaBACE設(shè)備，用120 V/cm電場強度分離。可用序列分析儀堿基調(diào)用 (base-calling)軟件包處理四色電泳圖譜，該軟件包中含有Cimarron 3.12堿基 調(diào)用程序(Amersham Biosciences)和Phred堿基調(diào)用和所述質(zhì)量評分產(chǎn)生應(yīng)用。 可將所有閱讀長度報道為Phred20窗口 ，它的準確率為99%。
如果需要，可單獨優(yōu)化擴增循環(huán)數(shù)、反應(yīng)時間、循環(huán)特征以及不同反應(yīng)物， 即引物、聚合酶、dNTP、 ddNTP等的濃度，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。例如，可測定耐受的DNA濃度范圍，并測定一系列DNA-與-引物濃度的 效能矩陣。起初，樣品可以是純化的PCR產(chǎn)物。為PCR產(chǎn)物優(yōu)化CSM時， 可測試代表非刺激和刺激序列的一系列實際樣品(CAE和pCAE分析)，并與具 有CAE分析結(jié)果的全體積樣品制備相比較。接受標準可以是與全體積樣品制 備結(jié)果相比的等價數(shù)據(jù)質(zhì)量、閱讀長度和成功率。對照包括全體積反應(yīng)和 NanoPrep (500 nL和200 nL體積)反應(yīng)。
可通過加熱器和冷卻器設(shè)計以及通過改變微芯片設(shè)計實現(xiàn)一致結(jié)構(gòu)。可通 過添加劑如BSA或PVA抑制表面相互作用。可用改性的LPA、 PEG或其它涂 層抑制反應(yīng)室的表面化學(xué)。對玻璃而言，另選方法可以是將聚合物如聚醚和氧 化多糖與許多表面位點同時多點共價連接，從而延長表面固定的壽命，因為必 須水解許多位點來釋放聚合物。
d)集成的MINDS系統(tǒng)
在一些實施方式中，完整的MINDS系統(tǒng)可包括三個模塊—珠文庫模塊、 循環(huán)測序模塊和DNA分析模塊。在一些實施方式中，完整的MINDS系統(tǒng)可 分析400條通道MINDS微芯片上的基于珠的文庫，該微芯片在具有超轉(zhuǎn)角 (hyperturn)的折疊微通道上集成了 25 nL成對閱讀循環(huán)測序、成對親和捕獲凈 化和jiCAE分離。MINDS系統(tǒng)可以是用于鳥槍測序或再測序的完全自動化的 系統(tǒng)，這取決于珠文庫構(gòu)建。在一些實施方式中，可集成循環(huán)測序模塊和DNA 分析模塊，制備的樣品如PCR或純化的質(zhì)粒可用作輸入樣品。在一些實施方 式中，可在微芯片上進行PCR或其它擴增。
DNA分析模塊可包括旋轉(zhuǎn)掃描器(圖30)，并可在微芯片上進行成對末端 閱讀樣品凈化，然后將樣品注射到兩條單獨的^CAE通道中分離和檢測正反向 測序反應(yīng)。檢測器可以是能夠進行488 nm激發(fā)和四色檢測的旋轉(zhuǎn)LIF掃描器。 為了產(chǎn)生核心MINDS系統(tǒng)，可將循環(huán)測序模塊與DNA分析模塊設(shè)備集成。 這種核心系統(tǒng)可集成100 nL循環(huán)測序、成對親和捕獲凈化和相同微芯片上的 分離?？蓪⒑杏蒄ACS設(shè)備分選的PCR片段的珠遞送到微芯片中，可將單 個珠導(dǎo)入25nL循環(huán)測序室。i)DNA分析模塊
DNA分析模塊可進行成對末端閱讀的樣品凈化和pCAE以分離和檢測各 成對末端閱讀中的標記DNA片段。循環(huán)測序可采用各自含有獨特的親和捕獲 序列的正向和反向引物，插入載體?？蓪碜匀w積、納米級制備或CSM的 成對循環(huán)測序樣品加載到輻射狀設(shè)計的分析微芯片的儲存庫中?？赏ㄟ^電動學(xué) 方法將樣品移動到兩個樣品凈化室中，其中含有用于正向或反向閱讀的親和捕 獲寡核苷酸?？蓪⒀h(huán)測序樣品濃縮到約20nL的體積，離子、未摻入的染料、 模板、核苷酸和酶通過后進入廢液?？赏ㄟ^提高溫度釋放濃縮和清潔的樣品， 并將其注射入雙T注射器，以在充滿分離基質(zhì)的微通道中分離。輻射通道會聚 在圓形檢測區(qū)域上，可在該區(qū)域掃描和檢測微通道。
模塊硬件部件包括l)LIF旋轉(zhuǎn)掃描器，它可容納許多不同的微芯片尺寸 和設(shè)計，2)微芯片，3)電泳控制，4)溫度控制，和5)微芯片再生。DNA分析模 塊可能是完全集成和自動化的MINDS系統(tǒng)的一部分。
一些實施方式產(chǎn)生了極其靈敏的掃描系統(tǒng)，與現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)掃描器相比，其檢 測性能提高了多達10倍。可通過掃描器、微芯片設(shè)計和染料化學(xué)的小幅提高 (1.5-3倍湘乘，獲得此10倍提高。對掃描器而言，最佳質(zhì)量PMT、 二向色元 件和鏡可提高光效率，并可與裝有高數(shù)值孔鏡的大功率(200 mW)小型激光器偶 聯(lián)?？捎貌捎没ㄇ喙w的較亮的染料提高染料化學(xué)。微芯片的檢測區(qū)可具有非 常深的蝕刻，以用額外通路長度來改善檢測和通過銳化條帶來提高分辨率。微 芯片夾心結(jié)構(gòu)和微型光學(xué)元件的反射表面可增強光收集。最后下述直接注射法 能夠?qū)⑷垦h(huán)測序樣品加載到分離的通道中。通過仔細優(yōu)化各元件，與現(xiàn)有 研究方法相比可顯著提高檢測限值，因為同時降低了強大測序所需的標記片段 的用量。
旋轉(zhuǎn)掃描器和設(shè)備。在一些實施方式中，可采用倒置(up-looking)旋轉(zhuǎn)共聚 焦激光誘導(dǎo)的熒光掃描器來檢測(interrogate)輻射狀pCAE裝置。旋轉(zhuǎn)掃描 器包括旋轉(zhuǎn)物鏡頭，該鏡頭偶聯(lián)于四色共聚焦檢測單元。旋轉(zhuǎn)掃描的基本優(yōu)點 是提供了高掃描速率，以及高位置準確性和速度一致性。旋轉(zhuǎn)掃描可能與具有 少至1條-384條以上通道的10-、 30-cm或更大直徑的晶片上的任何輻射狀晶片裝置相容。因此，可使芯片設(shè)計適合各種應(yīng)用，如從頭測序中的長通道和再 測序中的短通道。
旋轉(zhuǎn)掃描器的一個例子的示意圖見圖30。用雙色分束器和鏡通過步進電
動機的空心軸反射200 mW、 488 nm激光(SapphireTM OPSL， Coherent, Santa Clara)。在空心軸上方，菱形棱鏡將光束從旋轉(zhuǎn)軸處移開1 cm，高數(shù)值孔(>0.7)
物鏡使其通過微芯片的底層聚焦于通道。通過物鏡收集熒光，并通過光學(xué)系統(tǒng) 將熒光傳回，經(jīng)光譜和空間過濾后，用模塊化共聚焦四PMT單元檢測，其中 MicrostarIDSC板裝有8條DA通道。步進電動機以5Hz運轉(zhuǎn)，每旋轉(zhuǎn)一圈產(chǎn) 生5120個數(shù)據(jù)點，空間分辨率為12微米， 一般是100微米通道上8個數(shù)據(jù)點。 第五條通道由光電二極管供料，該光電二極管由連接于掃描器軸的盤片上的槽 觸發(fā)；在另外四條通道中開始數(shù)據(jù)獲取參照第五條通道中產(chǎn)生的電壓。掃描率 一般為5 Hz時，此設(shè)計對幾pM的熒光素檢測限敏感。在一些實施方式中， 可用市售堿基調(diào)用程序預(yù)先處理和分析這些數(shù)據(jù)。
在一些實施方式中，DNA分析模塊設(shè)備也可具有微芯片接口裝置，以控 制電泳和微芯片再生。用校準工具定位后，可用加熱的真空吸盤將微芯片保持 在位置上。在一些實施方式中，微芯片可具有約600輪壽命。該吸盤可具有三 點以調(diào)節(jié)芯片的提升，相對于共聚焦檢測器平面保持平面。在微芯片周長上電 極環(huán)可匹配儲存庫；可通過四個高電壓電源(Stanford Research Systems, 3101 型)控制電極。可用中央定位的"臍帶"原位進行下述微芯片再生，以沖洗用過的 基質(zhì)并進行再填充，而儲存庫清潔和補充可來自管中管設(shè)計，內(nèi)管去除材料而 外管流動緩沖液或其它溶液。
微芯片和操作。在一些實施方式中，微芯片可在四層裝置中整合親和樣品 凈化和分離通道。用寡核苷酸捕獲序列進行親和捕獲凈化可能是樣品凈化和濃 縮的強大解決方案。與可在注射時濃縮稀釋的樣品的電動學(xué)注射相反，沒有芯 片上的濃縮步驟，雙T注射器在加載時進行預(yù)分離，然后進行"心臟切開"注射， 這些方法都針對稀釋樣品的檢測。在分離微芯片上包括親和捕獲可使200 nL CSM樣品在加載前稀釋到微升體積，因為親和捕獲可再濃縮稀釋的樣品，同時去除未摻入的終止物、離子和模板。因此，可分別設(shè)計CSM和DNA分析模
塊，然后集成。
在一些實施方式中，MINDS系統(tǒng)可采用具有輻射狀設(shè)計2卯(圖34)、超 轉(zhuǎn)角和中心來源291的12"晶片。在一些實施方式中，可采用8"晶片292的部 分輻射狀設(shè)計，它們與可具有400條通道且分離長度長達45 cm的12"設(shè)計的 通道密度和長度相同(通過折疊通道實現(xiàn))，這取決于應(yīng)用。8"晶片可具有約 108個分離通道293。
圖21說明了8"晶片的一個實施方式。在各種示范性實施方式中，此8"晶 片可具有用于短閱讀的筆直14 cm分離通道或用于長閱讀的長達約45 cm的折 疊通道?？蓪悠肺脒B接于兩個親和捕獲室的單個加載儲存庫，進而各自注 入分離通道。加載樣品后，可降低具有電極的電極環(huán)，將各循環(huán)測序樣品電泳 到兩個親和捕獲樣品凈化室上，各自具有基質(zhì)以捕獲和濃縮正向或反向閱讀， 同時去除循環(huán)測序反應(yīng)混合物的不良組分?？赏ㄟ^將小室加熱到〉65'C釋放正 向或反向閱讀，將各閱讀分別電泳到雙T注射器中進行分析。因此，各加載儲 存庫服務(wù)于兩條分離通道。分離后，可替換分離基質(zhì)?？赏ㄟ^中心"臍帶"將基 質(zhì)泵入，所述"臍帶"含有基質(zhì)管道和沖洗溶液，以及用于中心共用陽極緩沖液 儲存庫的電連接。許多幾何形狀和設(shè)計均可用于400條通道的MINDS微芯片。 可在許多CAE基質(zhì)中進行分離。
在一些實施方式中，可將微芯片安置在Peltier加熱器的真空吸盤上，以按 需控制最優(yōu)分離條件和基質(zhì)操作的溫度。分離后，可通過臍帶用緩沖液沖洗， 以替代用過的基質(zhì)。微芯片接口裝置中的手動管中管真空吸引單元可去除儲存 庫中用過的緩沖液和基質(zhì)。可通過中央室加入新鮮基質(zhì)；可加入基質(zhì)感受器來 提供反饋信號以最大程度降低基質(zhì)浪費。在一些實施方式中，可用精確泵吸控 制基質(zhì)的替換，使其僅替換稍多于柱長度的基質(zhì)。這兩種方法都能使基質(zhì)用量 降低高達10倍?？赏ㄟ^管中管的外管將緩沖液補充到儲存庫中，通過內(nèi)管吸 除基質(zhì)。也可用工作線按需替換親和樣品凈化基質(zhì)，如本文所述。
在一些實施方式中，對潔凈的樣品來說，微芯片可持續(xù)600個循環(huán)?？赏?過軟件監(jiān)測微芯片性能，并由LabRAT通過e-mail、尋呼或屏顯警告操作者性 能降低。操作者可手工更換微芯片。在一些實施方式中，去除用過的微芯片可能需要拔掉芯片上閥和泵的臍帶、電極環(huán)和致動束，然后釋放微芯片。可用校 準工具幫助安裝新的微芯片，以使微芯片合適地定位。可通過用軟件輔助以手 動方式或完全自動化地檢測校準標記并使光學(xué)元件聚焦來驗證校準。
微芯片制造。在各種示范性實施方式中，顯微制造方法如下所述Liu
等，2000.尸rac. Ato/. A "d OS^ 97(10):5369-5374和Anderson箏'2000， A^c/e/c ^c/^ W仏28:e60。通常，可用濃HF預(yù)蝕刻硼浮法(Borofloat)玻璃晶片 (Schott，紐約州揚克斯)，然后通過CVD或濺射法沉積(一層)非晶硅掩模。在 一些實施方式中，鉻-金可用于替換非晶硅?？蓪MDS粘附層涂覆在非晶硅 上，用一薄層光致抗蝕劑(Shipley，加利福尼亞州圣克拉拉)旋涂晶片，并進行 軟烘培(soft-bake)。可用穿過具有所需通道圖案的掩模的紫外線使光致抗蝕劑 圖案化。光致抗蝕劑顯影后，可去除暴露的非晶硅，用濃氫氟酸將通道圖案化 學(xué)蝕刻到玻璃內(nèi)，流體晶片上的通道深度約為40)am，多支管晶片上的深度約 為70nm。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定各種部件的深度?？蓜冸x掉殘留的 光致抗蝕劑和非晶硅。用裝有金剛石鉆頭的CNC-小型磨機在硼浮法通路晶片 上鉆出250pm或更小的入孔。在一些實施方式中，可用定制激光器鉆出更小
的孔。對生產(chǎn)而言，超聲鉆法可同時鉆所有孔。最后用H2S(VH202清潔后，
可將流體晶片和通路晶片對齊，以使通路孔與通道缺口處于合適位置，在真空 電爐中用約57(TC與通路晶片進行熱粘結(jié)，產(chǎn)生雙層(iCAE芯片。對5層微芯 片而言，首先可對齊并組裝這三個玻璃晶片；其中兩個玻璃層可以是薄晶片。 可用UV臭氧清潔器清潔多支管晶片和254 pm厚PDMS膜(Bisco Silicones,伊 利諾斯州Elk Grove)，組裝這四層或五層微芯片。UV臭氧處理可產(chǎn)生不可逆 的玻璃-PDMS粘結(jié)。最終可將微芯片切成單個CSM微芯片產(chǎn)品或整個用于 MINDS微芯片。
在一些實施方式中，可用塑料和其它材料制造微芯片以重現(xiàn)設(shè)計，所用方 法如注射成型、熱壓凸、層壓和其它熟知方法。應(yīng)用這些制造方法來制備微芯 片屬于本公開范圍。DNA分析模塊的表征。在采用旋轉(zhuǎn)掃描器的實施方式中，可用流動染料
溶液和作為內(nèi)標的水拉曼峰(來自577.6 nm和589.4 nm的兩個峰)測定檢測限 值。進行標準的全體積PCR反應(yīng)然后對標準PCR產(chǎn)物進行連續(xù)稀釋，從而表 征裝有DNA分析模塊的樣品凈化和分離微芯片?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 方法優(yōu)化樣品凈化的參數(shù)(如加載、洗滌和洗脫條件)以及注射和分離的參數(shù)(時 間、電壓、分離溫度、緩沖液濃度等)?？蓽y定質(zhì)量值、成功率和閱讀長度， 并與測試和真實樣品進行比較。在一些實施方式中，閱讀長度可約為600個堿
基或更長。在一些實施方式中，可測試親和捕獲的再生，并可測定性能下降之 前的輪次數(shù)。用DMSO部分替代分離基質(zhì)中的脲可降低輪次次數(shù)和在毛細管 中產(chǎn)生長閱讀長度。在一些實施方式中，可用標準樣品重復(fù)運行微芯片以測定 具有不同基質(zhì)或涂層的微芯片的壽命。例如，為了對8xBAC文庫進行鳥槍測 序，100條通道的DNA分析模塊微芯片可進行約22輪(測定)。
ii)裝有DNA分析模塊的集成循環(huán)測序模塊
結(jié)合CSM與DNA分析模塊的特征，可產(chǎn)生核心MINDS系統(tǒng)。上述和圖 14中的CSM微芯片的基本單元設(shè)計可與8"DNA分析模塊微芯片端口相連。 這可產(chǎn)生具有50個用于成對末端閱讀的100-nL循環(huán)測序樣品制備室的微芯 片，所述制備室是與100個成對末端閱讀親和樣品凈化室和分離微通道集成的。 該系統(tǒng)的運行可采用微流體功能和微型機器人操作的芯片上功能來操作和再 生微芯片。在包括外部自動化加樣設(shè)備的實施方式中，核心MINDS系統(tǒng)每天 可產(chǎn)生7M堿基的高質(zhì)量序列，與現(xiàn)有方法相比成本大大降低。
設(shè)備。核心MINDS系統(tǒng)設(shè)備的基礎(chǔ)可以是DNA分析模塊設(shè)備。可采用 未經(jīng)改動的掃描器。可直接對上述CSM微芯片接口裝置進行微小的改裝，以 l)使芯片上控制基于CSM微芯片的筒中液體移動的微型機器人的外部致動自 動化，2)控制外部加熱和冷卻，以進行熱循環(huán)，和3)驅(qū)動注射器泵以將循環(huán)測 序試劑遞送給芯片。在一些實施方式中，不需要Tecan機器人。對于l)而言， 外部致動芯片上的閥，不需要改裝裝備，因為各致動通道可服務(wù)于所有通道的 所有特定閥，不管有2個或是400個。對于2)而言，加熱和冷卻可以在微芯片以外進行，可以是電阻加熱器的陣列或Peltiers條帶?？赏ㄟ^包括加熱器的額 外長度和數(shù)量的結(jié)構(gòu)設(shè)計實現(xiàn)改裝。加熱管理是本系統(tǒng)的重要考慮因素。對3) 而言，不需要除注射器泵之外的附加泵。如下所述加入工作通道應(yīng)能夠使一個 注射器泵服務(wù)于所有通道。因此，裝備改動可以將CSM微芯片接口裝置的部 件與DNA分析模塊微芯片接口裝置組合。
在一些實施方式中，可設(shè)計微芯片接口裝置和微芯片的細節(jié)，以消除任何 空間或溫度抵觸。可改裝真空吸盤，使其具有用于樣品制備和凈化室的較低溫 度的環(huán)。用下述芯片上微型機器人操作(service)微芯片的構(gòu)思可大大簡化組合 CSM和DNA分析模塊微芯片接口裝置的設(shè)計。
微芯片和操作。核心MINDS微芯片可直接將CSM微芯片功能和設(shè)計與 DNA分析模塊的樣品凈化和分離集成。圖22顯示了一種示范性設(shè)計的一對通 道。需要注意，閥和泵的致動線314會在微芯片上的圓環(huán)中-在圖22中它們表 現(xiàn)為水平線。
可將樣品-PCR產(chǎn)物或帶有PCR產(chǎn)物的珠-加載到輸入儲存庫中。基本 CSM重復(fù)單元(可重復(fù)約200次)可將樣品泵入含有循環(huán)測序混合物的100 nL 循環(huán)測序反應(yīng)室316，四個環(huán)繞閥關(guān)閉，進行循環(huán)測序。循環(huán)測序后，就像在 CSM中那樣，可將循環(huán)測序產(chǎn)物和反應(yīng)物泵入含有水的儲存庫中，不同的是 此時它具有電極連接。可將樣品電泳到兩個成對閱讀的親和捕獲室317-318中。 可去除污染物，并可通過雙T注射器將純化的熒光標記的循環(huán)測序片段注射到 兩條分離通道中；此單元可重復(fù)(例如)約200次，以產(chǎn)生400條分離通道。可 在高效納米凝膠或其它基質(zhì)中分離片段，并通過旋轉(zhuǎn)掃描器在中心附近進行檢 測。在一些實施方式中，具有約IOO條分離通道的8"晶片可用于模擬可具有約 400條分離通道的12"晶片的四分之一扇區(qū)。
微芯片可提供45分鐘的分離循環(huán)時間，以及45分鐘的循環(huán)測序和凈化循 環(huán)時間， 一個成對閱讀循環(huán)測序反應(yīng)室可提供兩條分離通道。這簡化了設(shè)計， 減少了需要的閥、電極和通道的數(shù)量。分離可以是幾乎連續(xù)的，僅微芯片再生 和預(yù)運行與分離共享了循環(huán)時間。在35分鐘分離期間，可從樣品加載到輸入 儲存庫中再次開始樣品制備循環(huán)。在一些實施方式中，可制備好樣品并在分離通道準備好接受注射時準備分離。在一些實施方式中，可采用按需提供單分離 通道的多循環(huán)測序或基因型分析室。除了具有共同的中心陽極以外，微芯片還 可具有共同的圓形開放陰極通道，它環(huán)繞著具有大緩沖容量的微芯片圓周。此 通道可具有額外的緩沖容量，以防止離子耗盡而減少分離，簡化電極數(shù)量和安 置，并可允許不去除緩沖液和過量基質(zhì)的情況下重復(fù)加載基質(zhì)。微芯片也可采 用三維結(jié)構(gòu)使工作通道(即循環(huán)測序混合物、廢液、親和凝膠聚合物、水)跨越 其它通道，以大大簡化設(shè)計和操作。
在一些實施方式中，組合的CSM和DNA分析模塊微芯片接口裝置可依
賴采用中心晶片雙面蝕刻的三維微芯片設(shè)計使芯片上的微型機器人操作微芯 片。該工作通道建立在閥連接多層設(shè)計中不同層的能力的基礎(chǔ)上。
圖12說明工作通道320的連接的實施方式，它向樣品凈化室321提供新 鮮的親和捕獲基質(zhì)。在所示設(shè)計中，工作通道流徑從蝕刻晶片322上方的左側(cè) 進入，跨過分離通道，上行至PDMS層的閥323的一個孔，跨過，然后下行至 該閥的第二個孔，進入雙蝕刻的晶片的下層，在這里蝕刻了樣品制備、凈化和 分離通道321、 324。然后，工作通道流徑通過親和捕獲樣品凈化室(它垂直于 該圖的平面)和通過一個閥再結(jié)合于蝕刻微芯片上方。這允許微芯片上側(cè)的工 作通道穿過樣品分離和其它通道，從它們的上方穿過而不干擾它們?？蓪⒋讼?同原理應(yīng)用于樣品制備通道，但不可應(yīng)用于分析通道。單個工作通道可以是寬 而深的，它將遞送循環(huán)測序混合物、用兩種親和捕獲基質(zhì)再填充兩個樣品凈化 室、提供洗滌以恢復(fù)樣品制備室以及收集所有樣品制備、樣品凈化和分離通道 的廢液。這六個工作通道將各自在微芯片上形成同心環(huán)。它們將連接于注射器 泵、大規(guī)模流體裝置或真空線。雙蝕刻的晶片和PDMS之間的"額外"晶片層將 僅含通孔。由于蝕刻通道位于蝕刻晶片的兩側(cè)；通孔可相對較大，除了循環(huán)測 序混合物。
可如下所述進行微芯片的再生。分離后，中央臍帶可將新基質(zhì)推入通道， 僅僅充滿分離通道。側(cè)通道上不同的通道寬度可引導(dǎo)基質(zhì)向陰極流動。在一些 實施方式中，可用兩條工作通道再生兩個樣品凈化室。通常，由閥關(guān)閉工作通 道。例如，為了取代親和基質(zhì)，可打開閥，起動通道的注射器泵，將新親和基 質(zhì)泵入所有正向室(每次加載親和基質(zhì)都可能進行多輪)。在其它親和室中進行了相似順序的步驟。簡單地，可通過將洗滌溶液從洗滌工作線泵送過小室、然 后進入廢液儲存庫來類似地清潔循環(huán)測序反應(yīng)室。緩沖液儲存庫可連接于最上 方晶片上方的共用大儲存庫。大體積可最大程度降低蒸發(fā)和緩沖液耗盡的影 響，并簡化緩沖液填充和沖洗。
可根據(jù)以下實施例進一步理解本發(fā)明的各個方面，不應(yīng)認為這些實施例以 任何方式限制了本發(fā)明范圍。
G.實施例
1.基于珠的大腸桿菌(E o /i)捕獲
用偶聯(lián)于磁珠的單克隆或多克隆抗體捕獲稀釋溶液中的模式靶生物可用 于提供濃縮、純化的物質(zhì)，以用于引入BPM微裝置。本文中，我們描述了偶 聯(lián)有抗大腸桿菌菌株0157抗體的DYNAL⑧珠的應(yīng)用。我們進行了三個系列的 實驗(l)捕獲稀釋母液中的大腸桿菌，(2)在芽孢桿菌(^7"7/^)大量過量的情況 下捕獲大腸桿菌，和(3)捕獲獲自Baltimore空氣取樣器的氣溶膠樣品中的大腸 桿菌。
我們首先比較了 DYNAL⑧"藥簽方案"，該方案用于檢測食物樣品中的大 腸桿菌0157，其中將珠直接接種到合適的生長培養(yǎng)基上。我們發(fā)現(xiàn)，將非病 原性菌株0157和大腸桿菌ATCC菌株700728直接接種到胰酶解酪蛋白大豆 瓊脂(TSA)上產(chǎn)生的集落約多5倍，因此能比藥簽法更好地估計捕獲生物體的 數(shù)量。因此，我們在所有后續(xù)實驗中都采用直接接種。
我們測定了在10SCFU/mL-10、FU/mL的細胞效價范圍(在PBS/吐溫緩沖 液中)上DYNAL⑧珠結(jié)合大腸桿菌的能力。在這些和后續(xù)免疫磁性分離(IMS) 實驗中，方案是將5 ^LDYNAL⑧珠懸液加入大腸桿菌的250 ^LPBS/吐溫適當 稀釋液中。在搖床上在有帽塑料小離心管中混合細胞和加入的珠10分鐘。然 后在試管側(cè)面用強磁體捕獲珠，去除上清(但保存用于接種)，用PBS/吐溫緩沖 液洗滌珠三次。重懸珠，接種珠的稀釋液。在幾個實驗中，我們也將洗液接種。 通常，洗液含有少量靶生物；靶細胞或者被珠捕獲，或者未結(jié)合并可在初級上 清液中回收。圖35顯示出捕獲稀釋在PBS/吐溫中的大腸桿菌0157的結(jié)果， 一式三份 地進行捕獲，細菌起始濃度為2X105、 104、 103、 102、 20和2個細胞/mL。在 105-10個細胞/mL的范圍內(nèi)，捕獲細胞的觀察數(shù)量為線性(R2^0.995)，在105-103 個細胞/mL的范圍內(nèi)捕獲效率約超過95%，在100個細胞/mL時降低到87%， 在20個細胞/mL時降低到69y。。在大腸桿菌濃度為103-105時，其它實驗(數(shù)據(jù) 未顯示)中從PBS/吐溫中回收的回收率通常大于85%。
2. 用單克隆抗體捕獲大腸桿菌的動態(tài)范圍
首先在試管中的250pL體積中研究捕獲化學(xué)，用分散于緩沖液的模式生 物優(yōu)化捕獲和洗滌。圖36顯示出用偶聯(lián)于DYNAL⑧珠的單克隆抗體代表性捕 獲大腸桿菌。將大腸桿菌0157以各種濃度加入與抗大腸桿菌0157抗體偶聯(lián) 的5pL珠的25(^LPBS/吐溫溶液中。在旋轉(zhuǎn)混合器上混合該混合物IO分鐘。 用強磁體將珠拉到試管一側(cè)，去除上清。用250 pL PBS/吐溫(PBST)洗滌珠三 次。將洗滌過的珠重懸于250 pLPBST，在TSA上計數(shù)捕獲的大腸桿菌。
圖36所示結(jié)果證明，發(fā)現(xiàn)在珠的用量和其捕獲大腸桿菌的能力之間有劑 量反應(yīng)關(guān)系。圖36顯示出，在高達約10S個細胞/mL時捕獲呈線性，在最大約 4xlO"個細胞/mL時達到飽和。1()S個細胞/mL以上時，在上清中回收到的細胞 百分數(shù)逐漸增加。用大腸桿菌飽和的DYNAL⑧珠的直接顯微鏡檢揭示出，約5 個細胞/珠。此捕獲方法證明，在15分鐘內(nèi)能夠從250 ^L(低至10 ^以下體積) 中純化和濃縮的耙細胞平均超過90%。
3. 用單克隆抗體特異性捕獲大腸桿菌
為了測定基于珠的捕獲的特異性，我們測試了在標準試驗條件下加入蠟樣 芽孢桿菌(Sac///^ ceww》(ATCC 11778)細胞對大腸桿菌與抗體-包被的珠的結(jié) 合的影響。將約1(^個大腸桿菌/mL的懸液與不同效價的蠟樣芽孢桿菌混合， 如上所述進行IMS，除了回收所用的TSA培養(yǎng)基中加入了四唑鹽，加入的水 平能選擇性抑制蠟樣芽孢桿菌。這允許直接接種細胞混合物，但僅大腸桿菌可 復(fù)制，從而可定量為菌落形成單位(CFU)。如圖37所示，當存在的兩種微生物的比率為1/1時，蠟樣芽孢桿菌的加
入將結(jié)合于珠的大腸桿菌數(shù)量降低了約20%，但芽孢桿菌過量100,000倍僅能 將大腸桿菌結(jié)合降低至對照的56%。這說明，對于這種抗體-細胞結(jié)合， DYNAL⑧珠可產(chǎn)生出色的特異性。
4.用單克隆抗體捕獲氣溶膠樣品中的大腸桿菌
已經(jīng)證明，我們可有效捕獲、純化和回收細菌細胞，我們想要將其擴展至 回收溶液中的大腸桿菌0157，該溶液含有90y。(v/v)來自Baltimore空氣取樣器 的液體(BASL)樣品(Spectorlndustries)。 BASL含有極多種類的競爭微生物、花 粉以及其它化學(xué)和生物物質(zhì)，它們可能干擾抗體介導(dǎo)的結(jié)合和回收。
為了測試我們濃縮和回收BASL溶液中的大腸桿菌0157的能力，我們在 純培養(yǎng)物中培養(yǎng)了菌株，并用90% BASL制備成102、 103和10tFU/mL的效 價，用PBST作對照。將5 DYNAL⑧珠懸液(含有抗-0157抗體)加入含有90% BASL或PBST中的大腸桿菌的250 ^L樣品中，在搖床孵育10分鐘，然后進 行珠捕獲。去除上清，用PBST洗滌珠三次，將珠重懸于PBST。將原始上清 和珠接種，以測定CFU數(shù)量。用加入Cefixime和Tellurite的MacConkey-山梨 糖醇瓊脂(CT-SMAC)確定所有板計數(shù)。CT-SMAC是大腸桿菌0157的半選擇 性培養(yǎng)基，它用于降低BASL中所含大量生物體中非大腸桿菌CFU的總數(shù)， 并通過發(fā)酵山梨糖醇提供0157的比色指征。
用我們的標準IMS方案出色地結(jié)合和回收了含90% BASL的溶液中的大 腸桿菌0157(圖38)。通常，大于90。/。的細胞結(jié)合于IMS珠并被回收，無論細 胞是分散于PBST或90。/。BASL中。在由104、 103和102CFU/ml測試的細胞濃 度范圍內(nèi)，情況都是這樣。
圖39顯示了特別針對104 CFR/ml效價的數(shù)據(jù)組。第一個柱和第三個柱顯 示了對照的效價。第二個柱顯示了僅用PBST中的樣品作對照時，珠組分和上 清組分中回收的細胞比例。第四個柱顯示了僅用90。/。BASL進行實驗時，珠組 分和上清組分中回收的細胞比例。本實驗說明，BASL中的組分不千擾結(jié)合和 回收，至少對這種抗體和其表位如此。5. 固相提取(SPE)
我們評價了可處理多達一升樣品體積、使分析物結(jié)合到小表面上而允許干 擾化合物流過的芯片外一次性流過式裝置的SPE。最后，可回收濃縮形式的靶 分析物，以用基于微芯片的生物處理器進行下游處理，或者SPE材料本身可以 是該微芯片的給料。
我們評價了大腸桿菌的二氧化硅基質(zhì)SPE捕獲。基本方案是使不同效 價的細菌通過固相、通過小體積的反向沖冼洗脫，然后分析上清和洗脫液中的 細菌含量。在下述實驗中，用PBS/吐溫(PBST)制備10、1(^個細胞/mL稀釋度 的大腸桿菌菌株DH5a(Invitrogen Technologies)。將具有100 mg固相床的裸露 的二氧化硅提取物-清潔SPE筒(Alltech Associates)用于所有實驗。
對各筒而言(l)將18mL細菌/酶混合物通過SPE床，流速約為5mL/分 鐘；(2)收集上清并分析細菌效價；(3)用2mL緩沖液反向沖洗該筒，測定洗脫 液中的細菌數(shù)量。如上所述用TSA在37'C培養(yǎng)細菌進行分析，以測定細菌的 相對捕獲和回收。
6. 在流過模式中SPE介質(zhì)對細菌的保留
圖40顯示了細菌試驗結(jié)果，表明在加載樣品中、以及細菌濃度相對高 (25,000或45,000 CFU/mL)的樣品的SPE后上清液(未結(jié)合)和洗脫液中的細菌 濃度。在此范圍內(nèi)，80-卯％大腸桿菌保留在SPE基質(zhì)上(圖41)，而少量細菌 通過，非常少量(1%)通過反向洗滌回收。因此，在二氧化硅上產(chǎn)生強烈結(jié)合， 活細胞被洗脫的很少。在效價非常低(125和250 CFU/mL)時，成比例地更多的 細胞通過該柱，僅約20。/。的細胞被保留(數(shù)據(jù)未顯示)。
7. 在流過模式中通過SPE和瓊脂糖"大珠"介質(zhì)保留蛋白質(zhì)(P-半乳糖苷
酶)
一些實施方式采用基于瓊脂糖的"大珠"來捕獲或純化生物物質(zhì)。將市售P-半乳糖苷酶(Sigma)溶解于O.l M磷酸鹽緩沖液，pH 7.5， lmMMgCl2中，濃 度為100和10 ng/ml。將這兩種溶液通過含有100 mg 50 pm 二氧化硅顆粒(孔 徑50A)的"提取物清潔"SPE筒(Alltech)，或5 ml含有500 pm硬化瓊脂糖珠的"大珠"柱。對瓊脂糖和二氧化硅衍生的介質(zhì)而言，將酶溶液(20ml)通過其各自 的SPE床，流速約為5 mL/分鐘，收集上清，用2 mL緩沖液以約為1 ml/秒的 流速反向沖洗該筒。用o-硝基苯基-(3-半乳糖苷(ONPG)作底物分析上清和洗脫
液中的酶活性。
圖42顯示出在10和100 ng/ml酶濃度下兩種基質(zhì)的"上清"、"洗脫液"和"保 留"組分的(3-半乳糖苷酶活性分布圖。通過加載物、流過液和洗脫液之差計算 "保留"。對于基于二氧化硅的SPE介質(zhì)，流過約75。/。的P-半乳糖苷酶，在上清 中回收。在反向沖洗洗脫液中檢測到的酶非常少(1-2%)。因此，約25%&半乳 糖苷酶保留在柱上。對于"大珠"介質(zhì)，85-99%的|3-半乳糖苷酶流過該柱，而在 洗脫液中回收的少于5%(圖42)。這意味著非常少量(約0-10%)保留在基質(zhì)上。 因此，這些介質(zhì)可用于流過模式，以分離靶分析物(如毒素)與保留物質(zhì)。
8. 在流過模式中用瓊脂糖"大珠"作為捕獲介質(zhì)保留大腸桿菌
我們評價了瓊脂糖大珠筒選擇性結(jié)合和濃縮大腸桿菌菌株DH5a的能力。 圖43顯示出獲自以初始細胞濃度2,000或4,700CFU/ml進行的大珠捕獲試驗的 組分中大腸桿菌DH5a的分布。用0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.5， 1 mM MgCl2 進行這些實驗，其中采用104或103 CFU/mL的20 mL細菌懸液。該試驗是在 TSA平板上生長。較低效價(2，000 CFU/ml)時，在流過組分中回收了>70°/。細菌， 在反向沖洗的洗脫物中回收的少于1%。較高效價(4，730 CFU/ml)時，在流過組 分中回收了〉80%細菌，在洗脫物中回收的少于5%。因此，僅25-10%細菌保 持結(jié)合于大珠基質(zhì)。
9. 納米生物處理器微芯片
主要根據(jù)Liu等，2000. iVoc.編.^cfltZ, Sc/. 97(10):5369隱5374所述
顯微制造微流體裝置。簡要說，清潔硼浮法玻璃晶片，沉積非晶硅掩模，然后 沉積HMDS粘附層和光致抗蝕劑層。用穿過掩模的紫外線使光致抗蝕劑圖案 化，用濃HF化學(xué)蝕刻通道圖案，流體晶片上的通道深度一般為40 jam，多支 管晶片上的深度為70pm。剝離掉光致抗蝕劑和非晶硅，用裝有金剛石鉆頭的 CNC-小型磨機鉆出入孔。這些孔可用于四層微芯片，作為反應(yīng)和檢測室?；蛘?，我們采用超聲鉆法同時鉆所有孔。清潔后，將流體晶片和通路晶片對齊， 進行熱粘結(jié)。加入多支管晶片和PDMS膜產(chǎn)生四層微芯片。
設(shè)計和生產(chǎn)兩種納米生物處理器微芯片。第一種微芯片MBI-11 240(圖19) 設(shè)計用于隔離和測試芯片上各種規(guī)模的主要微流體處理部件。它包括以下實施 方式(l)閥設(shè)計，(2)反應(yīng)室設(shè)計，(3)成組(ganging)反應(yīng)和(4)路由選擇器設(shè) 計。各元件的操作由八條通道全尺寸(ftill scale)氣動系統(tǒng)241控制，該系統(tǒng)操 作閥、泵和路由選擇器。我們測試了對3層和4層芯片中的MOV閥、泵和路 由選擇器的操作。經(jīng)設(shè)計，該芯片的各元件與8通道全尺寸氣動總線接口相連， 以有助于閥操作。
開發(fā)了第二種納米生物處理器微芯片MBI-12，以測試循環(huán)測序或PCR所 用珠的樣品制備和測試pCAE(單獨和與樣品制備聯(lián)合)。蝕刻圖20所示掩模設(shè) 計，將其組裝到有功能的四層微芯片中，進行測試。MBI-12具有幾種^CAE 通道設(shè)計以及如何將它們連接于上游樣品制備裝置的設(shè)計。
我們已經(jīng)證明用MOV閥、泵和路由選擇器混合以及用在深室如通路中能 充分發(fā)揮作用的表面聲波(SAW)混合。SAW在微芯片的小室內(nèi)產(chǎn)生脈沖式內(nèi) 壓波并使溶液均勻化以混合。
雖然可能難以混合微升級和/或納升級的體積(一般可能受擴散的限制)，但 本文所述的MOV閥、泵和路由選擇器能增強混合，大大縮短了混合溶液的時 間。在各種示范性實施方式中，可以各種幾何形狀或形式安排本文所述的一個 或多個閥、泵和路由選擇器，以便幫助依次或基本上同時混合兩種或多種液體。 可根據(jù)實施者的判斷選擇混合的速率和程度。在各種示范性實施方式中，可以 進行快速混合和/或基本上完全混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，混合的速率和程 度可取決于流體的數(shù)量和類型、體積和互溶性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇需要 的混合速率和程度，在各種示范性實施方式中，在MOV閥和/或泵用作路由選 擇器或"T"形混合器時進行混合。在一些實施方式中，可通過兩個或多個泵 驅(qū)動的路由選擇器或"T"形結(jié)構(gòu)使流體來回運動，從而混合溶液。
10.進行生物防衛(wèi)樣品制備的納米生物處理器這種生物處理器模塊接受來自上游空氣樣品收集器或其它輸入裝置的樣 品，產(chǎn)生用于儲存或再測試的等份，裂解樣品，制備和標記樣品，并將它們輸 出至單分子熒光相關(guān)檢測器進行分析。生物處理器模塊包括含有流體的一次性 塑料筒和操作該筒的設(shè)備。
在分析之前分級樣品并將其分為等份。自動化的微流體處理器可l)制備 用于測試的核酸；2)制備用于測試的蛋白質(zhì)；3)制備用于檢測的細胞；4)儲存， 以再測試陽性樣品和進行法醫(yī)分析。
該筒是"CD"形式，每個筒的扇區(qū)中具有12個生物處理器單元，各單元用 于單種樣品。該筒加工生物處理器單元中的一種樣品，然后旋轉(zhuǎn)以接受下一個
生物處理器單元中的下一個樣品。在2小時取樣方案中，每天可從小圓盤傳送 帶中儲存的筒組中自動改變該筒，類似于CD交換器。約每兩周進行一次手工
介入，以再供應(yīng)筒和試劑。
該設(shè)備提供了某些機構(gòu)來儲存、加載試劑、運行和換筒。該設(shè)備具有以下
功能l)打開和關(guān)閉電磁閥以輸送壓力或真空來操作閥和泵，2)加熱和冷卻筒 上的區(qū)域，3)從小圓盤傳送帶移出或移入筒，4)超聲破壞微生物，和5)需要的 其它功能。
11.進行生物防衛(wèi)遺傳分析的納米生物處理器
/學(xué)/^^t^^"炎。從宏觀尺度(macroscale)開始，將用靶生物表面表位的抗 體修飾的磁珠加入小室中毫升體積的空氣收集器210流出物(或由其它基質(zhì)產(chǎn) 生的漿液)中(圖8)。珠是用對單個生物、亞型、物種等特異的抗體包被的珠組 的混合物。加入另外的試劑混合物可擴展所研究的生物范圍。珠捕獲靶生物， 而通過洗滌去除污染物-提供了選擇性和特異性的第一維度(dimension)。在 SCPM211中通過磁體收集含有靶生物的珠。
/^^^0^//7i^^f炎?，F(xiàn)在進入微尺度，將這些珠加載到納米生物處理器 (NBP)微芯片213上的含有裂解緩沖液的儲存庫212中，所有進一步操作都在 微流體尺度上進行。經(jīng)設(shè)計，NBP微芯片200(圖18)能處理單個生物處理器單 元中的樣品，其中采用芯片上的微流體閥和泵作為控制元件。從儲存庫221泵 吸珠，直到它們被閘板222捕獲，在閘板處進行超聲處理以破壞芽孢和/或細胞并釋放DNA。將DNA移動到反應(yīng)室223，在此通過芯片上的泵加入含有 pRT-PCR所用探針的特異性引物的PCR試劑，以多重反應(yīng)進行nRT-PCR-提 供選擇性和特異性的第二生化維度。
雖然RT-PCR是有力的分子診斷工具，但因為核酶、非特異性延伸或其它 機制不能淬滅熒光染料，RT-PCR也有背景高且可變的缺點。為了最大程度降 低假陽性結(jié)果，通過快速(<5分鐘)芯片上的微通道毛細管陣列電泳分離224分 離推定陽性的^RT-PCR樣品，以進一步研究選擇性和特異性。生物信息學(xué)引 物設(shè)計產(chǎn)生了不同片段長度的產(chǎn)物，通過微通道電泳分離和熒光發(fā)射區(qū)分開這 些產(chǎn)物-這允許增加PCR反應(yīng)的多重數(shù)，其中通過片段篩分驗證和鑒定真陽性 結(jié)果。至少96個生物處理器單元輻射狀地安置在微芯片225上(圖18)。采用 每小時一個通道時，96通道微芯片工作4天。
12. 在納米生物處理器中進行的EXPAR反應(yīng)
EXPAR是用寡核苷酸序列、熱穩(wěn)定聚合酶和切口酶(nicking enzyme)在 6(TC特異性擴增DNA短節(jié)段的快速等溫法。通過熒光或MS檢測產(chǎn)物。可在 納米生物處理器中進行EXPAR反應(yīng)，以進行遺傳測試、基因表達測定、分子
診斷、生物防衛(wèi)和其它應(yīng)用。
在單個步驟中將反應(yīng)混合物加入樣品，熱穩(wěn)定聚合酶和切口酶的作用方式
與微通道中的大多數(shù)其它蛋白質(zhì)相似。在稍許改裝的圖15或20所示微芯片中 或在圖13所示微芯片中進行EXPAR。將核酸(DNA或RNA)移動到微通道如 標有IMS輸入250的微通道中，用MOV泵251泵入小室，然后從試劑通道之 一 252加入單個反應(yīng)混合物。流體線路用于將多種反應(yīng)物之一加入反應(yīng)室253。 任選地控制反應(yīng)室的溫度。反應(yīng)后，用MOV泵將處理的樣品泵入儲存庫或管 254中，以進行芯片外MS分析或微芯片上的熒光、化學(xué)發(fā)光或其它檢測方法 的分析。除了用于分析的單個通道以外，可用MOV路由選擇器將樣品分到許 多通道中，然后進行多重-EXPAR。
13. 在納米生物處理器中進行的RiboMaker反應(yīng)RiboMaker檢測系統(tǒng)基于采用人造啟動子復(fù)合物(APC)和稱為RiboLogs 的核苷酸類似物的RNA聚合酶(RNAP)轉(zhuǎn)錄起始中斷(稱為abscription )。 APC提供了 RNAP聚合酶的起始位點，以產(chǎn)生50-450個三核苷酸中斷產(chǎn)物/ 分鐘/位點。檢測可以是MS分析、熒光、化學(xué)發(fā)光或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 它方法。對于DNA或RNA分析，APC可具有提供靶位點探針特異性的側(cè)接 序列。具有不同質(zhì)量單位的RiboLog可鑒定結(jié)合的是哪個位點。通過多重APC 與待研究序列的不同部分的結(jié)合，RiboLog指紋可為生物防衛(wèi)提供額外的特異 性信息，這可幫助消除假陽性和假警報。對蛋白質(zhì)而言，APC單元可連接于抗 體。RiboMaker檢測聲稱能快速、線性地檢測，并且對抑制的敏感性低于PCR。
在納米生物處理器微芯片如圖13所示芯片上完成RiboMaker反應(yīng)。加入 單種APC試劑，然后加入單種反應(yīng)混合物，需要兩個混合步驟。如果在珠上 捕獲了 RiboMaker樣品，該珠通過"IMS輸入"(圖13)進入反應(yīng)室，該反應(yīng)室 任選地裝有閘板或具有磁性以捕獲珠。用試劑通道之一加入APC。從第二個試 劑通道加入RiboLog。如果需要，使該反應(yīng)在泵A和B之間來回移動。
14. 微芯片CMS陣列設(shè)計
16通道微芯片270的實施方式見圖23。閥和泵的致動線271互相垂直并 終止于微芯片底部的通路上，外部致動線可連接于此。通過注射器泵將循環(huán)測 序混合物供應(yīng)到左側(cè)通道272中，將用于再生微芯片的水或緩沖液供應(yīng)到右側(cè) 通道273中。復(fù)合這兩個"工作"通道，以注入所有16條通道，并使芯片上的 泵或閥274分別控制流動。為來自玻璃晶片和PDMS膜的四層裝置構(gòu)造此微芯 片。
15. 完整的MINDS系統(tǒng)
為了產(chǎn)生完整的MINDS系統(tǒng)，改裝來自核心MINDS系統(tǒng)的設(shè)備l)加 入珠工作通道，并與珠分選法接口相連，以遞送單個珠；2)微芯片接口裝置上 的電阻加熱器設(shè)計和電極環(huán)更換到微芯片；3)通過微芯片改裝保證重復(fù)地加載 和卸載單個珠。MINDS微芯片設(shè)計見圖24。該微芯片類似于圖22所示核心MINDS微芯 片，除了珠工作通道導(dǎo)聯(lián)330至輸入線，將樣品體積減少四倍，至25nL，在 循環(huán)測序室中形成閘板以捕獲珠。通過輸入通道輸入單個珠。將閘板蝕刻到僅 2pm，這需要額外的掩模和制造步驟。
將單個珠泵入循環(huán)測序室，該小室具有導(dǎo)向電極和流向親和捕獲室的通 道。閘板阻止了珠的移動。 一旦加載珠后，通過芯片上的泵將含有正向和反向 成對末端閱讀引物的25 nL循環(huán)測序混合物泵入反應(yīng)室。關(guān)閉與小室相鄰的閥， 循環(huán)溫度。循環(huán)后，將循環(huán)測序混合物中的循環(huán)測序產(chǎn)物泵入電極儲存庫6中， 電泳至兩個樣品凈化室中，基本如上所述進行處理，各成對末端閱讀注射入分 離的分離通道。打開導(dǎo)向廢液的閥，通過洗滌線將珠沖洗到廢液通道中。如上 所述進行分離再生。
通過以下方法將單個珠注入各通道l)操作充分分離的微流體珠串，并將 它們連續(xù)或平行移動到各通道中，2)從珠'箱"注入各通道，并將它們分配到循 環(huán)測序反應(yīng)器中， 一次一個，或3)磁性操作單個珠或收集到毛細管末端進行"收 集-和-放置"操作。對于珠串方法，在空間上一個珠與下一個珠通過一團(bolus) 液體充分分離，所述液體可能是不混溶的如Fluorlnert (3M)。我們以前成功地 將Fluorlnert團用于循環(huán)測序和PCR反應(yīng)。將珠串一起移動到粗糙位置上。然 后關(guān)閉循環(huán)珠工作通道上的閥，使流動轉(zhuǎn)向通過單獨的循環(huán)測序室，其長度足 以將珠移動到加載通道中。關(guān)閉加載通道上的閥，打開珠工作通道上的閥，將 下一個珠放入下一通道。也可能有平行變化，平行變化可能最大程度降低加載 時間。光學(xué)珠感受器也可有助于調(diào)節(jié)時間和給料流。
MINDS系統(tǒng)采用激光鉆出50pm測試孔的閥和泵，以使泵體積降低幾納 升。或者，在各循環(huán)上完成部分"行程"以部分打開具有25(Him孔的閥。脈沖小 室周圍的閥，以移動小室中的珠，或者施用外部超聲混合。通過添加劑改善表 面相互作用，按需進行表面修飾。
對直接注射而言，樣品凈化基質(zhì)位于分離通道的連線中。如圖44所示， 此設(shè)計具有用于珠和樣品凈化的循環(huán)測序室的常見元件，除了樣品凈化室被 移動到分離通道的陰極側(cè)。在樣品凈化基質(zhì)上電泳循環(huán)測序樣品，污染物移 動到陰極室中，如果需要可沖洗陰極室。清潔樣品是樣品凈化基質(zhì)上的銳條帶，通過加熱該小室釋放清潔樣品，開始分離。這依體積將銳條帶注射到分 離通道上。因此，分析了各樣品凈化基質(zhì)上收集的所有樣品，這與典型雙T 注射中發(fā)現(xiàn)的"心臟切開"相反，在雙T注射中雙T的加載僅能分析一部分樣
口
16.用芯片上的MOV裝置混合
利用四層微芯片示范用芯片上的MOV裝置混合。該混合示例采用我們在 MBI-13微芯片上制作的三種不同混合器設(shè)計一團混合、路由選擇器混合和"T" 形混合。將水和亮紅染料溶液混合。
這些設(shè)計采用(l)兩個反向的MOV泵(圖45)， (2)兩個反向的MOV泵和第 三個泵，以產(chǎn)生空氣隔開的團，和(3)使用路由選擇器混合兩股液流。所有芯片 混合設(shè)計均顯示出充分地混合澄清的水和紅色染料溶液。在一系列泵送過程 中，我們觀察到流出末端閥的液體部分的來回移動。末端閥由通道中吸取一定 體積的液體，因為該通道是打開的。這種移動使得在該閥內(nèi)充分混合。
利用圖46所示結(jié)構(gòu)產(chǎn)生團。由五閥泵組成的MOV路由選擇器將來自兩 個孔(標為1和3)的試劑和來自孔2的空氣泵入藍色反應(yīng)室，形成空氣隔開的 團。許多文獻證明在團內(nèi)能夠充分地混合，這種混合是由壁剪切力驅(qū)動而在團 內(nèi)實現(xiàn)的，因為接觸壁的物質(zhì)的運動速度被減慢。在我們所研究的情況下，在 多個泵送步驟中通過將兩種試劑來回移動入空氣通道來輔助混合。使用兩種溶 液， 一種含有染料而另一種僅含水的情況下，在該團達到反應(yīng)室時沒有觀察到 顏色變化。
圖45顯示團和路由選擇器混合的示范性芯片設(shè)計。由端口l泵送水、由 端口2泵送空氣、由端口3泵送紅色染料，從而產(chǎn)生混合的液體/空氣團。在反 應(yīng)室中沒有觀察到顏色差異。通過保持端口 2關(guān)閉研究了路由選擇器中試劑1 和3的混合。在各泵送循環(huán)中，水和染料以層流模式進入路由選擇器(路由選 擇器看上去半白半紅)，混合開始于出口閥、通道起點處。下一個泵送循環(huán)在 出口陶打開時由通道吸回液體，其體積等于出口閥體積。在出口閥中的這種來 回移動能實現(xiàn)非常有效的混合。在反應(yīng)室中仍未觀察到顏色差異一與均一混合 (至少在顯微鏡下)相一致。圖47顯示"T"形混合的示范性芯片設(shè)計。由于在泵出口閥內(nèi)"來回"移 動，觀察到距離"T"形接頭數(shù)毫米處發(fā)生充分混合。在2 mm反應(yīng)室中沒有 觀察到顏色差異。為了更好的理解這種特殊的"T"形混合，提供了電影畫面(圖 48)來說明這一過程。在步驟1中入口閥打開出口閥關(guān)閉(將混合溶液推入主通 道)。在步驟2中泵閥打開(可以觀察到更多的紅色染料擴散到水中)。在步驟4 中入口閥關(guān)閉而出口閥打開(將半混合溶液部分(plug)由主通道吸回)。在步 驟4中泵閥關(guān)閉(新溶液部分(slug)被推動，可以在主通道中觀察到層流)。
步驟3中混合液體的反流(由于出口閥打開)幫助實現(xiàn)充分混合。圖49顯 示"T"形接頭下游數(shù)毫米處均一溶液顏色的特寫照片。
由于此類泵送系統(tǒng)誘發(fā)的流體"來回"移動，所檢測的所有三種MOV混 合方案都能實現(xiàn)充分混合。團混合在反應(yīng)室中產(chǎn)生氣泡，這可能不利于實現(xiàn)良 好反應(yīng)。距150pm通道僅數(shù)毫米處(接頭下游)就足以實現(xiàn)充分混合。在GenII 設(shè)計中，我們決定將MOV混合與新型愛奧尼亞(Ionian)NEA試驗一起使用， 用MOV混合在芯片上混合試劑和樣品、進行反應(yīng)和終止反應(yīng)。
權(quán)利要求
1. 一種模塊化系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括第一模塊，所述第一模塊包括捕獲和純化靶分析物的器件以及將所述靶分析物引入微流體裝置的器件，和第二模塊，所述第二模塊包括所述微流體裝置，其中所述微流體裝置適用于檢測或分析所述靶分析物。
2. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng) 毒、芽孢、真核細胞或核酸。
3. 如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)
4. 如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)
5. 如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)
6. 如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)
7. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，
8. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，
9. 如權(quán)利要求l所述的系統(tǒng) 32所述的微流體裝置。
10. —種磁行波流過式裝置， 旋轉(zhuǎn)極片； 流過管；和 磁性固定片，其中所述旋轉(zhuǎn)極片、所述管和所述固定極片以某種方式布置，并包含適合 在旋轉(zhuǎn)所述極片時在所述流過管中產(chǎn)生磁行波的材料。
11. 如權(quán)利要求IO所述的裝置，其特征在于，所述極片以至少約100Hz 旋轉(zhuǎn)。
12. 如權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，還包括位于所述管腔內(nèi)的珠。
13. 如權(quán)利要求IO所述的裝置，其特征在于，所述珠是磁珠。
14. 如權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，靶分析物附著于所述磁珠。，其特征在于，所述耙分析物選自細菌、病，其特征在于，所述細菌是炭疽桿菌。 ，其特征在于，所述芽孢是炭疽桿菌芽孢。 ，其特征在于，所述細胞是癌細胞。 ，其特征在于，所述核酸是DNA。 其特征在于，所述分析包括測序所述DNA。 其特征在于，所述分析包括擴增所述DNA。 ，其特征在于，所述微流體裝置是權(quán)利要求所述裝置包括
15. 如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于，所述靶分析物被所述磁珠 親和捕獲。
16. 如權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、芽孢、病毒、真核細胞或核酸。
17. 如權(quán)利要求IO所述的裝置，其特征在于，所述流過管注入微流體裝置。
18. —種裂解或破壞靶分析物的方法，所述方法包括a) 將耙分析物和磁珠引入權(quán)利要求IO所述的磁行波裝置的流過管中；和b) 旋轉(zhuǎn)所述裝置的極片，旋轉(zhuǎn)頻率適于在一個或多個方向上加速所述管中的所述磁珠；其中所述珠裂解或破壞所述革巴分析物。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、 芽孢、病毒、真核細胞或核酸。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，以至少約100Hz進行所述 旋轉(zhuǎn)。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述靶分析物附著于所述 磁珠。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶分析物被所述磁珠 親和捕獲。
23. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述流過管與微流體裝置 流體相連。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分析物是核酸，所 述微流體裝置適用于擴增所述核酸的序列。
25. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分析物是核酸，所 述微流體裝置適用于測序所述核酸。
26. —種流過式超聲器，所述超聲器包括 適合包含氣溶膠的小室；和 超聲器探頭，其中所述小室包括樣品入口和樣品出口，所述探頭位于所述小室中的方式使探頭適合超聲處理位于所述樣品入口和樣品出口之間的樣品。
27. 如權(quán)利要求26所述的超聲器，其特征在于，還包括 流體樣品，其中所述樣品流過所述小室。
28. 如權(quán)利要求26所述的超聲器，其特征在于，所述樣品出口與微流體 裝置流體相連。
29. —種裂解或破壞耙分析物的方法，所述方法包括-當所述超聲器的小室中存在包含靶分析物的樣品時，起動權(quán)利要求27所述的流過式超聲器的探頭，從而，超聲處理所述靶分析物。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、 芽孢、病毒、真核細胞或核酸。
31. —種微流體裝置，所述裝置包括與兩個親和捕獲室流體相連的加載儲存庫，其中所述捕獲室各自與分離通 道流體相連，適合將包含正向和反向核酸測序產(chǎn)物的樣品由所述儲存庫向所述親和捕 獲室電泳的電極，其中所述捕獲室包含適合捕獲所述正向或反向測序產(chǎn)物的親 和捕獲基質(zhì)；和對所述親和捕獲室進行溫度控制的器件。
32. —種混合微升級或納升級溶液的方法，所述方法包括 通過由兩個或多個MOV閥或泵驅(qū)動的路由選擇器或"T"形結(jié)構(gòu)反復(fù)改變微流體裝置中兩種或多種溶液的流向，從而混合所述溶液。
33. —種混合微米級或納米級溶液的方法，所述方法包括 通過由兩個或多個MOV閥或泵驅(qū)動的路由選擇器或"T"形結(jié)構(gòu)來回移動兩種或多種溶液，從而混合所述溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了將微芯片與各種類型的模塊接口連接的方法和裝置。所述技術(shù)可用作各種應(yīng)用，如DNA測序和基因型分析、蛋白質(zhì)組學(xué)、病原體檢測、診斷和生物防衛(wèi)的樣品制備和分析系統(tǒng)。
文檔編號C12M1/00GK101415813SQ200780011795
公開日2009年4月22日 申請日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月3日
發(fā)明者D·蘭克, I·I·布拉加, S·B·喬瓦諾維齊 申請人:微芯片生物工藝學(xué)股份有限公司