專利名稱：：通過端粒截短的植物人工染色體平臺(tái)的制作方法通過端粒截短的植物人工染色體平臺(tái)
背景技術(shù)：
：本申請要求2006年5月9日申請的美國臨時(shí)專利申請順序號60/798,830和2006年10月24日申請的美國臨時(shí)專利申請順序號60/862,733的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請的全部公開內(nèi)容都通過引用特別結(jié)合到本文中。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和植物遺傳學(xué)領(lǐng)域。更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及植物人工微染色體平臺(tái)及其生產(chǎn)和使用方法。2.相關(guān)領(lǐng)域的描述生物中染色體的維持和遺傳通常需要三個(gè)必需元件復(fù)制起點(diǎn)、著絲粒和端粒，如之前用酵母人工染色體所鑒定的一樣。例如，Murray和Szostak(1983)描述了基于體外構(gòu)建的線性酵母人工染色體的克隆系統(tǒng)。然而，在多細(xì)胞真核系統(tǒng)中，已鑒定出的核酸元件中沒有一個(gè)能夠維持人工染色體。產(chǎn)生人工染色體的一種方法是通過從頭構(gòu)建，即將著絲粒、端粒和選擇標(biāo)記組裝起來并且重新導(dǎo)入植物中(美國專利第7,015,372號)。然而，已知對于通過減數(shù)分裂的有效傳遞，染色體具有最小尺寸限制(Schubert,2001)。雖然大多數(shù)從頭構(gòu)建的哺乳動(dòng)物微染色體可以在有絲分裂期間傳遞，但是還沒有這類微染色體在種系中傳遞的報(bào)道。迄今為止，真核生物中僅通過減數(shù)分裂傳遞的從頭構(gòu)建的人工染色體是酵母人工染色體(Murray和Szostak,1983;Murray和Szostak,1986)。另外，研究表明對于正常傳遞而言，植物著絲粒大小必須超過大約1兆堿基(Kaszas和Birchler，1998)，這個(gè)大小超過了目前可以體外組裝的大小。相比之下，一些具有天然著絲粒的截短的染色體可通過減數(shù)分裂傳遞(Shinohara等，2000;Tomizuka等，1997，2000;Voet等，2001;Shen等，1997,2000;Schubert，2001;Zheng等，1999;Kato等，2005;McClintock,1938;Brock和Pryor，1996;Nasuda等，2005)。已應(yīng)用于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的截短染色體的一種方法是端粒介導(dǎo)的截短(telomeremediatedtruncation)(Fair等，1991,1992，1995;Barnett等，1993;Itzhaki等，1992;Heller等，1996;Mills等，1999;Saffery等，2001)。然而，迄今為止還沒有研究披露用于植物染色體端粒介導(dǎo)的截短的方法。染色體缺失的其它方法已應(yīng)用于植物系統(tǒng)。例如，通過X射線或Y射線照射玉米花粉(McClintock,1938;Brock和Pryor,1996)或通過B-9與復(fù)制9S的易位(Zheng等，1999;Kato等，2005)所產(chǎn)生的玉米染色體發(fā)生了改變。然而，通過這些方法產(chǎn)生的染色體改變在減數(shù)分裂或有絲分裂期間缺乏穩(wěn)定傳遞，無法攜帶位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)，不能使異源序列進(jìn)行有效的表達(dá)，或者染色體改變難以產(chǎn)生。因此，本領(lǐng)域非常需要用于植物微染色體的產(chǎn)生和使用方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供可經(jīng)有絲分裂和減數(shù)分裂有效傳遞的植物微染色體，從而克服了本領(lǐng)域的局限性。術(shù)語"微染色體(minichromosome)"是指通過缺失部分天然染色體而制備的工程染色體。因此，微染色體與通過重組DNA技術(shù)從頭制備的人工染色體截然不同。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本文所述的植物微染色體，所述植物微染色體通過插入端粒重復(fù)序列使起始天然植物染色體截短而獲得。因此，本發(fā)明的植物微染色體可以限定為包含至少一個(gè)被截短的染色體臂。在一些其它的實(shí)施方案中，植物微染色體的兩個(gè)臂均被截短。在一些方面，植物微染色體可在植物有絲分裂和減數(shù)分裂期間有效傳遞，所述植物6與起始染色體(startingchromosome)的才直物品種相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，這類微染色體通常包含功能性著絲粒和復(fù)制起點(diǎn)，這兩者可供如實(shí)保持。在本發(fā)明的一個(gè)方面，植物微染色體包含天然著絲粒。天然著絲粒存在于內(nèi)源染色體中，并由著絲粒重復(fù)序列組成(Jiang等，2003)。這些序列在細(xì)胞分裂(例如有絲分裂和減數(shù)分裂)期間供染色體有效分離。因此，在本發(fā)明某些方面，植物微染色體限定為包含天然植物著絲粒序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的微染色體可限定為不包含新著絲粒。《效染色體還可包含工程端粒序列(engineeredtelomeresequence)。本文所用術(shù)語"工程端粒序列"是指比起存在于天然染色體的端粒序列有所不同的端粒序列。例如，工程端粒序列位于相對于著絲粒的位置可不同于存在于天然染色體的端粒的位置。具體地講，與天然端粒相比，本發(fā)明微染色體上的工程端粒序列可能更接近微染色體的著絲粒。例如，在本發(fā)明的植物微染色體中，工程端粒序列可限定為距天然染色體序列的著絲粒約10kb至約10Mb。在更具體的實(shí)施方案中，工程端?？删嗵烊蝗旧w序列的著絲粒約10kb至約5Mb或者約100kb至約lMb、2Mb、3Mb、4Mb或5Mb。本發(fā)明的植物微染色體還可包含兩個(gè)工程端粒序列，它們距微染色體著絲粒的距離可以不同。工程端粒序列可得自多種來源。例如，工程端粒序列可得自與天然染色體序列相同的植物品種或變種，或者得自相對于天然染色體序列是不同的植物品種。例如，端粒序列可以是由pAtT4克隆的端粒序列，所述pAtT4包含擬南芥型C4raZn'c/o/7^-type)端粒基序TTTAGGG(SEQIDNO:l)的同向重復(fù)序列或其衍生物(Richards和Ausubel，1988)。在這種情況下，每個(gè)重復(fù)序列包含端粒序列的430個(gè);威基對。工程端粒重復(fù)序列可得自玉米、小麥、燕麥、水稻、擬南芥或大豆。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，工程端?？砂鄠€(gè)端粒重復(fù)序列。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程端?？砂橛?個(gè)和100個(gè)之間、2個(gè)和50個(gè)之間或者2個(gè)和10個(gè)之間的重復(fù)序列，包括6個(gè)重復(fù)序列。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，提供端粒截短載體(telomeretruncationvector)上的端粒序列，例如本文所示端粒截短載體(例如pWY76、pWY86和pJV21)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，可采用端粒截短載體來產(chǎn)生截短的微染色體。端粒截短載體可包含在微染色體中，或者可從中分離出來。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，在產(chǎn)生微染色體期間端粒截短載體可缺失。例如，轉(zhuǎn)基因然后可被導(dǎo)入微染色體中以產(chǎn)生包含一個(gè)或多個(gè)添加轉(zhuǎn)基因的微染色體。通過這種方法形成的微染色體構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。植物微染色體的一個(gè)方面是它們的大小。本文所述的微染色體優(yōu)選編碼最低數(shù)目的可對包含微染色體的植物表型產(chǎn)生有害影響的內(nèi)源基因。因此，優(yōu)選制備缺失了大部分內(nèi)源染色體，而同時(shí)又保持足夠大小以穩(wěn)定傳遞的微染色體。當(dāng)天然染色體是A染色體時(shí)，這一點(diǎn)可能非常重要。B染色體通常不編碼必需功能，因此不太可能產(chǎn)生有害表型。然而，還是觀察到微染色體太小以致于不能經(jīng)有絲分裂和減數(shù)分裂如實(shí)保持下來。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，植物微染色體包含天然植物染色體序列，其中約1%至約99.9%的天然染色體序列缺失。在一些實(shí)施方案中，微染色體中約10%、20%、25%、35%、50%、75%、85%、90%、93%、95%、97°/。、99%、99.5°/。或99.90/0或從其中可派生的任何范圍的天然染色體序列缺失。在本發(fā)明的某些其它方面，植物微染色體可根據(jù)其大小來限定。例如，植物二微染色體大小可限定為約0.1Mb至約20Mb或30Mb。在其它的實(shí)施方案中，植物孩i染色體大小可為約1Mb、1.5Mb、2Mb、2.5Mb、3Mb、4Mb、5Mb、7.0Mb、9Mb、10Mb、20Mb、50Mb或100Mb或者其中可派生的任何范圍。例如，在某些情況下，本文所述的植物微染色體大小介于約1Mb和10Mb之間，或者介于約5Mb和10Mb之間。8在本發(fā)明的某些方面，植物微染色體可限定為通過有絲分裂以100%頻率進(jìn)行傳遞。在更多情況下，植物染色體通過其在減數(shù)分裂期間傳遞的頻率來限定。例如，植物微染色體在減數(shù)分裂期間可按大于約10°/。、20%、25%或30%的頻率進(jìn)行傳遞(50°/。為理想的傳遞)。因此，本發(fā)明的植物染色體可包含截短的A染色體或B染色體，當(dāng)微染色體在與起始染色體品種相同的植物中傳遞時(shí)，所述截短的A染色體或B染色體在減數(shù)分裂期間傳遞的頻率大于35%?？梢允褂枚喾N植物來制備本發(fā)明的植物微染色體。在一些實(shí)施方案中，該植物可限定為雙子葉植物或單子葉植物。例如，植物可為苜蓿、磨擦禾屬(J)7:^acwm)、玉米、油菜(canola)、水稻、大豆、煙草、草碎草、燕麥、黑麥、擬南芥或小麥。在本發(fā)明的某些方面，微染色體可限定為得自玉米植物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物微染色體可得自植物A染色體。例如，微染色體可包含得自A染色體的天然染色體序列，例如在玉米微染色體的情況下，它可包含得自玉米l、2、3、4、5、6、7、8、9或IO號染色體的天然序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物微染色體得自玉米7號染色體。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物微染色體包含植物B染色體的天然染色體序列。對于某些應(yīng)用，端粒截短的B染色體可提供益處，因?yàn)樗鼈儼潜匦杌?，預(yù)期這些非必需基因不會(huì)干擾植物表型或者不會(huì)干擾染色體的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。本文所述的端粒截短方法導(dǎo)致從B染色體中缺失天然染色體序列，特別是遠(yuǎn)離著絲粒的區(qū)。通過端粒截短來缺失控制不分離的B染色體區(qū)，從而基于B染色體的微染色體將正常分離。實(shí)際上，可以按照本文所述方法，利用任何類型的植物B染色體來制備植物微染色體。例如，植物微染色體可包含天然B染色體序列，這些B染色體序列得自玉米、黑麥或高粱，或者得自具有B染色體的任何其它植物品種，或者得自包含已導(dǎo)入B染色體的任何植物品種(Jones和Rees,1982)。在一些實(shí)施方案中，染色體的截短在包含多個(gè)B染色體的植物細(xì)胞中進(jìn)行，例如包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個(gè)或更多個(gè)B染色體拷貝的細(xì)胞。在本發(fā)明的某些方面，可優(yōu)選缺乏B染色體的含^t染色體植物，因?yàn)橥暾鸅染色體的存在可能引起B(yǎng)染色體衍生的微染色體不分離。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過導(dǎo)入完整B染色體或部分B染色體來操縱包含B染色體序列的植物微染色體的含量的方法。例如，可通過導(dǎo)入調(diào)控B著絲粒不分離的B染色體序列來調(diào)節(jié)植物微染色體的含量。本發(fā)明的植物微染色體可包含選擇標(biāo)記，該選擇標(biāo)記為攜帶標(biāo)記的植物細(xì)胞在特定生長條件下提供生長優(yōu)勢，從而能夠鑒定包含微染色體的植物、植物細(xì)胞或植物部分。選擇標(biāo)記可在細(xì)菌細(xì)胞中起作用。微染色體還可包含提供抗生素、除草劑或其它藥劑敏感性的"陰性"選擇標(biāo)記，從而能夠?qū)Π囟ㄎ⑷旧w的植物、植物細(xì)胞或任何其它目標(biāo)生物的細(xì)胞進(jìn)行選擇。此外，在某些方面，植物微染色體可包含雄性育性恢復(fù)基因，例如RG基因。植物微染色體還可包含位點(diǎn)專一重組序列。例如，本發(fā)明的微染色體可包含lox或i^r位點(diǎn)。位點(diǎn)專一重組為基因移進(jìn)移出人工染色體(例如本發(fā)明的植物微染色體)提供了簡便的方法。還可以這個(gè)方式提供隨機(jī)誘變。應(yīng)用位點(diǎn)專一重組以體內(nèi)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢詰?yīng)用位點(diǎn)專一重組將基因序貫添加到微染色體上，以便提供用于完整生化途徑或一套農(nóng)藝優(yōu)良性狀的基因。在本發(fā)明的某些方面，被插入起始植物染色體的端粒序列包含位點(diǎn)專一重組序列。在這個(gè)方面，可以快速產(chǎn)生包含位點(diǎn)專一重組序列的植物微染色體。在某些其它實(shí)施方案中，植物微染色體可包含控制細(xì)胞內(nèi)微染色體拷貝數(shù)的基因。這種基因的一個(gè)實(shí)例是介導(dǎo)上述不分離的B染色體的元件。一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因也可包含在微染色體內(nèi)。尤其預(yù)期有用的是與可插入微染色體內(nèi)的基因一樣多的且同時(shí)又保持功能和如實(shí)傳遞人工染色體的結(jié)構(gòu)基因。這可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在植物、植物細(xì)胞或任何其它目標(biāo)生物的細(xì)胞中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)外源基因的方法。外源基因可得自任何生物，包括植物、動(dòng)物和細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源基因賦予指定植物改進(jìn)的農(nóng)藝性狀。例如，轉(zhuǎn)基因可賦予抗蟲性(insectresistance),除草劑耐受性、糖代謝改變、脂肪酸代謝改變、抗病性和有害物抗性(pestresistance)等性狀。本發(fā)明還包括可使用微染色體同時(shí)轉(zhuǎn)移多個(gè)外源基因到包含完整生化或調(diào)節(jié)途徑的植物中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括可用作DNA克隆載體的植物微染色體。這種載體可用于植物和動(dòng)物測序計(jì)劃。在一些具體情況下，轉(zhuǎn)基因可隨端粒重復(fù)序列一起導(dǎo)入起始染色體，從而產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)基因的植物微染色體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含植物微染色體的植物細(xì)胞。該植物細(xì)胞的品種可與起始植物染色體的品種相同，然而在某些情況下，可以是不同品種。因此，包含植物微染色體的植物或植物種子也構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。在某些方面，包含微染色體的植物是玉米植物。一般而言，本發(fā)明的方法和組合物包括端粒介導(dǎo)的染色體截短(物)。例如，包含植物端粒的載體被導(dǎo)入植物細(xì)胞中。這類載體可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中，例如DNA轟擊或土壤桿菌04grakz"en'ww)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。例如，在某些實(shí)施方案中，可應(yīng)用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生由A染色體衍生的植物微染色體。相反地，在一些情況下，可應(yīng)用DNA轟擊產(chǎn)生由B染色體衍生的植物微染色體。在將端粒序列整合到植物染色體的一個(gè)或多個(gè)位置上后，可在整合點(diǎn)將染色體截短。因此，本發(fā)明的方法可包括用包含至少兩個(gè)端粒重復(fù)序列的異源核酸轉(zhuǎn)化起始植物染色體，并使起始植物染色體截短以便產(chǎn)生植物微染色體?？赏ㄟ^端粒整合來截短染色體的一個(gè)或兩個(gè)臂。然后，可通過例如DNA印跡法或FISH,對所得植物微染色體進(jìn)行篩選以確定其大小和來源。在本發(fā)明的另一些方法中，起始植物染色體用包含端粒重復(fù)序列和額外序列(例如位點(diǎn)專一重組序列、轉(zhuǎn)基因或其它選定序列)的異源核酸序列轉(zhuǎn)化。或者，起始植物染色體可用包含端粒重復(fù)序列的異源核酸序列轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生植物微染色體。隨后，植物微染色體可用包含額外序列(例如轉(zhuǎn)基因)的第二異源核酸序列轉(zhuǎn)化。例如，額外序列可包含尸/r或iox位點(diǎn)。在一些情況下，額外序列還可包含賦予抗蟲性、除草劑耐受性、糖代謝改變、脂肪酸代謝改變、抗病性、雄性育性恢復(fù)或有害物抗性的基因。因此，在某些實(shí)施方案中，額外基因可以是雄性育性恢復(fù)基因，例如Rf3基因。本發(fā)明這個(gè)方面可能特別有利，因?yàn)榛謴?fù)雄性育性的植物微染色體可以非常高效地傳遞到子代細(xì)胞。至于本文所述任何其它方法或組合物，都可采用本發(fā)明這個(gè)方法和/或組合物方面論述的實(shí)施方案。因此，有關(guān)一種方法或組合物的實(shí)施方案同樣可應(yīng)用于本發(fā)明的其它方法和組合物。本文所用的術(shù)語前未加數(shù)詞修飾時(shí)包括其復(fù)數(shù)形式。正如本文所附權(quán)利要求書一樣，當(dāng)與術(shù)語"包含"聯(lián)用時(shí)，術(shù)語前未加數(shù)詞修飾時(shí)可指一個(gè)或一個(gè)以上。權(quán)利要求書中使用的術(shù)語"或"是用來指"和/或"，除非明確說明僅指二者之一，或者二者相互排斥，雖然本公開內(nèi)容支持僅指二者之一和"和/或，，的定義。本文所用"其它"可指至少兩種或以上。本申請全文中，術(shù)語"約"用來指包括儀器誤差、測定數(shù)值所采用方法的固有偏差，或研究對象中存在的偏差。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢從以下詳述來看將是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng)了解的是，表示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的發(fā)明詳述和具體實(shí)施例只是通過實(shí)例的方式給出，因?yàn)閊^本發(fā)明詳述來看，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改動(dòng)和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。12以下附圖構(gòu)成本說明書的部分，并被用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。參照這些附圖中的一幅或多幅并結(jié)合本文所述具體實(shí)施方案細(xì)節(jié)可更好地理解本發(fā)明。圖1:染色體截短構(gòu)建體的實(shí)例。圖中表示構(gòu)建體pWY76和pWY86以及對照構(gòu)建體pWY96。圖中字母標(biāo)識(shí)的含義如下LB，T-DNA左邊界；RB,T-DNA右邊界；Tvsp,大豆?fàn)I養(yǎng)貯藏蛋白基因的終止子；Bar,雙丙氨膦抗性基因作為選擇標(biāo)記基因；TEV,煙草蝕斑病毒5'非翻譯區(qū)；P35S，花椰菜花葉病毒(CaMV)的2X35S啟動(dòng)子；Tnos,才艮癌土i裏才干菌(/^rakz"en'wwfww咖c/emO的Nos纟冬止子；Tmas，根癌土壤桿菌的Mas終止子；Pnos，根癌土壤桿菌的Nos啟動(dòng)子；Pmasl',沖艮癌土i裏桿菌的Mas啟動(dòng)子；lox和FRT,位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)；HPT,潮霉素B抗性基因；GFP，綠色熒光蛋白基因；DsRed，紅色熒光蛋白；FLP,位點(diǎn)專一重組酶基因；端粒，由擬南芥04ra6Wo/^s^^/&加)分離的pAtT4的端粒單元(Richards和Ausubel,1988)。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向，或者在端粒重復(fù)序列的情況下表示染色體取向。圖2:pJV21的結(jié)構(gòu)。四個(gè)功能部分用方框表示并標(biāo)注。LB，左邊界；RB,右邊界；lox,/ox(56位點(diǎn)；Cre,Cre重組酶基因；bar,雙丙氨膦抗性基因；35S,CaMV35S啟動(dòng)子；ubi,玉米泛蛋白啟動(dòng)子；n3'，胭脂氨酸合成酶基因的終止子序列；telo，400bp擬南芥端粒重復(fù)序列；Mrt和^scl，限制酶位點(diǎn)。發(fā)明詳迷植物育種的一個(gè)目的是選出所需要的性狀，例如抗病性、抗蟲性、生長率、營養(yǎng)需求和產(chǎn)量。遺憾的是，在許多植物品種中，不同變種對于地理區(qū)和氣候區(qū)是最佳的。然而，將所需性狀或基因培育成各個(gè)變種可能要花數(shù)年時(shí)間，因?yàn)楸匦柽x出任何特定性狀，同時(shí)又保持特定變種的特殊優(yōu)勢。某些性狀的改變或性狀的積累還可能需要多個(gè)轉(zhuǎn)13基因，這就使?jié)u滲變得復(fù)雜起來。因此，賦予農(nóng)藝優(yōu)良性狀理想的基因可由不同的染色體提供，因而可能不與其它基因連鎖，并且在子代植抹中易于選擇。然而，直至目前為止，還沒有能夠編碼基因的植物微染色體的記載。本發(fā)明通過提供可用于摻入所需轉(zhuǎn)基因的植物微染色體克服了本領(lǐng)域的局限性。在某些情況下，微染色體可以漸滲入植物的任何特定變種中，因?yàn)樗粫?huì)與其它染色體上編碼的任何背景基因連鎖。這些微染色體還可包含位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)，這使得基因能夠快速移進(jìn)或移出包含微染色體的任何植物變種。因此，這些新的植物微染色體通過提供遺傳上分離的表達(dá)平臺(tái)，從而減少了與連鎖拖曳(linkagedrag)有關(guān)的問題。I.重組系統(tǒng)在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，植物微染色體包含至少一個(gè)位點(diǎn)專一重組酶位點(diǎn)。已在若干種生物中鑒定出位點(diǎn)專一整合酶重組酶系統(tǒng)，包括但不限于噬菌體Pl的Cre〃ox系統(tǒng)(Abremski等，1983;美國專利第4,959,317號；美國專利第5,658,772號)、酵母的FLP/Fir系統(tǒng)(Golic和Lindquist，1989)、大腸桿菌(五.co/Z)的Pin重組酶(Enomoto等，1983)、噬菌體p的Gin/g/x重組酶(Maeser等，1991)、魯氏接合酵母(Z;^osacc/7aramycesrawx")pSRl質(zhì)粒的R/RS系統(tǒng)(Onouchi等,1991;Araki等，1992)和魯氏接合酵母的R重組酶(Onouchi等，1995)。研究表明，所有這些系統(tǒng)都在植物中起作用(O，Gorman等，1991;Maeser等,1991;Onouchi等，1991;Dale和Ow，1991)。一般認(rèn)為位點(diǎn)定向整合系統(tǒng)如Cre〃ox或FLP/7^r需要環(huán)狀DNA中間體。就這些系統(tǒng)而言，Cre〃ox和FLP/尸Wr已得到廣泛應(yīng)用。FLP/Fir系統(tǒng)是酉良酒酵母OSacc/z"raw;/c&yce陽v/w'ae)原有的(Golic和Lindquist，1989;有關(guān)綜述參見Futcher，1988)。酵母中，重組酶(FLP)存在于2p質(zhì)粒中，識(shí)別作為靶位點(diǎn)的599堿基對(bp)的反向重復(fù)序列(/W7)。599bp重復(fù)序列內(nèi)的最小功能序列單元僅包括34bp;被1個(gè)不對稱的8bp間隔區(qū)分隔開的2個(gè)13bp反向重復(fù)序列，盡管通常存在第3個(gè)13bp序列的非必需重復(fù)序列(Sauer，1994)。兩側(cè)鄰接反向重復(fù)序列的尸ir序列的flp介導(dǎo)的dna重排通常導(dǎo)致尸wr靶位點(diǎn)之間DNA發(fā)生倒位。在這種情況下，兩個(gè)FWr位點(diǎn)均被保留下來。FLP重組酶還可識(shí)別正向重復(fù)的F7r靶位點(diǎn)。兩側(cè)鄰接正向重復(fù)的/^7M立點(diǎn)的FLP介導(dǎo)的DNA重排通常導(dǎo)致位于FWr耙位點(diǎn)之間的DNA被切下。在這種情況下，切下的DNA以包含一個(gè)F/r位點(diǎn)的環(huán)狀形式釋放出來，而第二F/7M立點(diǎn)仍保留在模板DNA分子上。FLP重組酶還可介導(dǎo)不同DNA分子上F7r位點(diǎn)之間的重組，例如，F(xiàn)LP重組酶可介導(dǎo)不同染色體上^7r位點(diǎn)之間的重組。Sadowski(1995)指出，由FLP/7^r催化的重組在性質(zhì)上是可逆的。由FLP/Fir催化的DNA交換可以在體外進(jìn)行，因?yàn)檠芯勘砻骷兊腇LP重組酶介導(dǎo)i^7M立點(diǎn)之間的重組(Meyer-Leon等，1984)。酵母FLP/尸/r組合也已用來指導(dǎo)位點(diǎn)專一重組，在大腸桿菌(Cox，1983)和果蠅(DrosopW/a)基因組中，兩者都切下并擴(kuò)增兩側(cè)鄰接F/7M立點(diǎn)的序列(Golic和Lindquist，1989;Golic，1994)。已采用FLP/F^r指導(dǎo)位點(diǎn)專一性切割部分轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因得自同源重組的玉米和水稻原生質(zhì)體的質(zhì)粒DNA(參見例如美國專利第5,527,695號)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米中，已利用FLP/i^r位點(diǎn)定向切割插入玉米基因組的兩側(cè)鄰接F^r位點(diǎn)的序歹'J(美國專利號5,929,301和6,175,058)。外源DNA的染色體位點(diǎn)專一性靶向細(xì)菌和哺乳動(dòng)物染色體也可受FLP/F/r影響(Huang等，1991;O，Gorman等，1991)，已經(jīng)表明在非酵母基因組中，這種通過FLP插入i^r位點(diǎn)是可逆的(Huang等，1997)?？梢猿浞指淖僃/r位點(diǎn)以便發(fā)生重組但又是不可逆的(美國專利第6,187,994號)，或者相對于逆向反應(yīng)更有利于正向反應(yīng)(Senecoff等，1988)。第二個(gè)已充分表征的重組系統(tǒng)是噬菌體Pl的Cre〃ox(Abremski等，1983;有關(guān)綜述參見Craig，1988;Sauer，1994;Ow,1996)。Cre重組酶(eausing^combination(縮寫用英文"引起重組，，中有下劃線的字母表示)識(shí)別/ox(縮寫用locusofcrossingQver(交換基因座(x))下劃線字母表示)耙序列，介導(dǎo)相容性/ox位點(diǎn)間的位點(diǎn)專一重組。相容性位點(diǎn)(Compatiblesite)可包含或不包含相同的序列。丄o;c位點(diǎn)的長度為34堿基對，包含被8bp的其它間隔區(qū)核苷酸分隔開的2個(gè)13bp反向重復(fù)序列。丄o;c序列包括噬菌體PI的/ox尸(Albert等，1995)和從大腸桿菌分離的核苷酸序列的/oW、/o;c丄和/ox7位點(diǎn)(Hoess等，1982)。已報(bào)道的/ox尸位點(diǎn)的功能變異體包括但不限于/o;c(5(5、/ojc77和/o:c72(Albert等，1995;Langer等，2002)。還可以通過本領(lǐng)域已知的多種合成技術(shù)產(chǎn)生丄ox序列。用于產(chǎn)生功能性/ox位點(diǎn)的合成技術(shù)的實(shí)例參見Ogilvie等(1981)和Ito等(1982)。/ox位點(diǎn)是一種不對稱的核普酸序列，因此，同一DNA分子上的/ox位點(diǎn)彼此之間可能具有相同或相反的方向。相同方向的/ox位點(diǎn)間的重組導(dǎo)致位于兩個(gè)/ox位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段發(fā)生缺失。在這種情況下，所得的最初DNA分子末端之間產(chǎn)生連接，/ox位點(diǎn)被保留下來。缺失的DNA區(qū)段形成仍含有單一/ox位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子。同一DNA分子上相反方向的/ox位點(diǎn)間的重組導(dǎo)致位于兩個(gè)/ox位點(diǎn)之間DNA區(qū)段的核苦酸序列發(fā)生倒位。另外，緊鄰位于兩個(gè)不同DNA分子上的/ox位點(diǎn)的DNA區(qū)段可能發(fā)生彼此交換。所有這些重組事件都是由Cre編碼區(qū)的產(chǎn)物催化的，并且是可逆的。然而，可以充分改變/ojc位點(diǎn)，以便重組事件發(fā)生但又是抗反向重組反應(yīng)的(Albert等，1995;Araki等，1997;PCT公布號WO01/11058)，或者使得兩個(gè)位點(diǎn)是重組酶的"不相容的"重組底物(Hoess等，1986;Trinh和Morrison,2000;Lee和Saito,1988;EP1035208)。還可以通過排除重組酶來源，例如通過育種或使用特定的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，來防止發(fā)生反向反應(yīng)。Cre重組酶還可實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向整合。例如，采用Cre重組酶將/acZ報(bào)道基因整合到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞基因組中，一個(gè)/ox位點(diǎn)在/acZ打靶載體上，一個(gè)/ox位點(diǎn)已先位于CHO基因組DNA內(nèi)已經(jīng)表明，Cre重組酶在以下生物中介導(dǎo)/ox位點(diǎn)之間的重組酵母(Sauer,1987)和植物，例如煙草和擬南芥(參見例如美國專利第5,658,772號；Medberry等，1995;Albert等，1995)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠(Sauer和Henderson,1988;Fukushige和Sauer，1992;Sauer，1998)。還有研究報(bào)道了利用Cre〃o;c重組系統(tǒng)將大的BAC(細(xì)菌微染色體)片段位點(diǎn)專一性整合到植物和真菌基因組中(Choi等，2000)。一般認(rèn)為，為了實(shí)現(xiàn)將位點(diǎn)定向整合到單個(gè)基因組/o;c位點(diǎn)中，必須將包含單個(gè)/ox位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。因此，本發(fā)明的方法可使缺乏輔助序列的DNA分子實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向整合，所述輔助序列的存在通常是為了在細(xì)菌宿主細(xì)胞中復(fù)制和保持環(huán)狀分子。Wallace等人(2000)和Day等人(2000)論述了分別在胚胎干細(xì)胞或煙草中應(yīng)用位點(diǎn)定向整合作為在基因組中預(yù)選擇可重復(fù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的位點(diǎn)的方法。利用多個(gè)/ox位點(diǎn)，Cre重組酶可發(fā)起并實(shí)現(xiàn)重組，所述位點(diǎn)包括但不限于/ox尸和多個(gè)野生型/ox尸位點(diǎn)的變異體，例如/ojc66(Albert等，1995)。由/ox位點(diǎn)指導(dǎo)的DNA交換發(fā)生在8bp間隔區(qū)，基本上使所涉及的兩個(gè)/o;c位點(diǎn)的13bp反向重復(fù)序列發(fā)生交換。例如，位點(diǎn)定向重組，其中一個(gè)DNA分子上的單一/ox位點(diǎn)與第二DNA分子上的第二單個(gè)/ox位點(diǎn)重組，產(chǎn)生其中整合的DNA兩側(cè)各鄰接/o;c位點(diǎn)的序列。如果所涉及的不同分子上的單一/ox位點(diǎn)相同，則所得到的鄰接插入DNA的兩個(gè)/ojc位點(diǎn)也相同。然而，如果13bp反向重復(fù)序列上起始分子的兩個(gè)單一/ox位點(diǎn)不相同，則所得到的鄰接插入DNA的兩個(gè)/ox位點(diǎn)不同于起始/ox位點(diǎn)。例如，如果第一單一/ojc(5(5位點(diǎn)與第二單一/ojc77位點(diǎn)一起參與位點(diǎn)定向整合，則所得到的鄰接插入DNA兩側(cè)的/ox位點(diǎn)包含/ox尸和fox72位點(diǎn)序歹'J(Albert等，1995)。在兩個(gè)重組分子上，采用相同的/ojc或尸/7M立點(diǎn)的位點(diǎn)定向整合導(dǎo)致插入的DNA兩側(cè)鄰接相同的重組位點(diǎn)，這是一種易通過重組酶逆轉(zhuǎn)的反應(yīng)。為了防止插入序列的缺失，通常需要排除重組酶的酶來17源，例如，通過分離或通過將重組酶基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下并排除誘導(dǎo)源。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用這樣設(shè)計(jì)的位點(diǎn)專一重組序列，以便在整合反應(yīng)后，所得位點(diǎn)與反向反應(yīng)不相容或者減速進(jìn)行重組。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，向一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)(例如/ox或/^7)提供整合酶，例如Cre或FLP重組酶。例如，可通過基因和留存在宿主細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)保持的質(zhì)粒中的合適調(diào)控序列的表達(dá)而瞬時(shí)供應(yīng)重組酶。重組酶基因和合適的調(diào)控序列可插到生物基因組中，并在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)?；蛘?，可應(yīng)用有性雜交或育種將重組酶導(dǎo)入含有一個(gè)或多個(gè)靶/ox或i^7M立點(diǎn)的細(xì)胞中；在這種情況下，含有重組酶基因的生物(例如植物)可與含有/o:c或F/r耙位點(diǎn)的植物雜交，得自這種雜交的子代可能含有重組酶和一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)。在一些情況下，可將編碼所需重組酶的mRNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞以編碼和提供重組酶蛋白。在其它情況下，可將分離的重組酶蛋白導(dǎo)入包含靶重組位點(diǎn)的宿主細(xì)胞內(nèi)。在這些情況的任一種情況下，指導(dǎo)重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子可以是但不限于組成型或誘導(dǎo)型的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)了解的是，重組酶基因(例如Cre或FLP)的基因可以分別從噬菌體Pl或釀酒酵母中分離出來，并直接用于新的宿主系統(tǒng)，或者對于轉(zhuǎn)基因宿主中密碼子選擇的表達(dá)，可以使基因序列最優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可用合適的重組酶按類似方式識(shí)別天然存在的和合成的把位點(diǎn)并介導(dǎo)重組。重組酶介導(dǎo)的基因置換或基因切除的實(shí)例通常利用鄰接將被置換或切除的序列的兩個(gè)靶位點(diǎn)。例如，Odell等人(美國專利第5,658,772號)公開了在煙草中使用兩個(gè)/ox尸位點(diǎn)和Cre重組酶產(chǎn)生特異性基因置換。還使用Cre/7ox系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中以誘導(dǎo)型方式激活并去除轉(zhuǎn)基因(PCT公布號WO01/40492)。Baszczynski等人(美國專利第6,187,994號)公開了在玉米中使用多個(gè)不相同的Fi7M立點(diǎn)和FLP重組酶以產(chǎn)生多種基因變化。Baszczynski等人(美國專利第6,262,341號)還公開了使用具有雙靶位點(diǎn)特異性的嵌合Cre/FLP重組酶來實(shí)現(xiàn)一側(cè)鄰接/ojc序列、另一側(cè)鄰接F/r序列的DNA序列的重組。在這些情況的各種情況中，序列的整合或切除產(chǎn)生了作為部分重組方案的外源DNA片段。然而，位點(diǎn)定向整合只可利用受體基因組中的一個(gè)耙位點(diǎn)。本發(fā)明提供了非復(fù)制性的、體外產(chǎn)生的、易轉(zhuǎn)化的環(huán)狀分子的Cre介導(dǎo)靶向整合，該環(huán)狀分子含有將進(jìn)入之前已導(dǎo)入靶基因組的第二單一/ojc位點(diǎn)的第一單一/ojc位點(diǎn)。II.用于本發(fā)明的基因本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明的微染色體可用于表達(dá)多種基因。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些基因賦予包含本發(fā)明微染色體的植物農(nóng)藝上優(yōu)良的性狀。下面提供了一些用于本發(fā)明的非限制性基因?qū)嵗?。A.除草劑抗性已知多種除草劑抗性基因，這些基因可用于本發(fā)明。一個(gè)實(shí)例是賦予咪唑啉酮(imidazalinone)或磺酰脲等除草劑抗性的基因，所述除草劑抑制生長點(diǎn)或分生組織。這類編碼突變型ALS和AHAS酶的示例性基因參見例如Lee等(1988)、Gleen等(1992)和Miki等(1990)?？梢允褂貌莞熟⒌目剐曰?分別由突變型5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-enolpymvl-3phosphoshikimatesynthase,EPSP)和基因賦予的抗性)和其它膦化合物的抗性基因，例如草銨膦(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase,PAT)基因和吸水鏈霉菌OS^eptomycM/^gmsco;/cw力膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(6"r)基因)。參見例如Shah等人的美國專利第4,940,835號，它公開了可以賦予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列?？砂碅TCC保藏號39256獲得編碼突變型wo4基因的DNA分子，Comai的美國專利第4，769，061號中公開了該突變型基因的核苷酸序列。Kumada等人的歐洲專利申19請?zhí)?333033和Goodman等人的美國專利第4,975,374號公開了賦予除草劑(例如L-膦絲菌素)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列參見Leemans等人、DeGreef等人(1989)的歐洲申請第0242246號，它記載了表達(dá)編碼膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的嵌合bar基因活性的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。示例性的賦予苯氧基丙酸和環(huán)己烷二酮類(例如拿捕凈和吡氟氯禾靈)抗性的基因是Marshall等人(1992)披露的Acct-Sl、Accl-S2和Acct-S3基因。賦予抑制光合作用的除草劑抗性的基因也是已知的，例如三嗪和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。Przibilla等人(1991)描述了用編碼突變型戸M基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻(C7z/"m;^o/wo"ay)。Stalker的美國專利第4,810,648號公開了腈水解酶基因的核苷酸序列，可按ATCC保藏號53435、67441和67442獲得含有這些基因的DNA分子。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶編碼DNA的克隆和表達(dá)參見Hayes等(1992)。B.雄性不育和雄性育性的恢復(fù)賦予雄性不育的基因和雄性育性的恢復(fù)系的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，包括以下專利所公開的基因和恢復(fù)系美國專利第3,861,709號、美國專利第3,710,511號、美國專利第4,654,465號、美國專利第4,727,219號、美國專利第5,530,191號、美國專利第5,625,132號和美國專利第5，689，041號，所述專利的公開內(nèi)容均通過引用全部特別結(jié)合到本文中。雄性不育基因可增加用其產(chǎn)生雜種的效率，因?yàn)樗鼈兣懦嗽谥付s交中給用作母本的玉米植抹物理去雄的需要。如果需要采用本發(fā)明的雄性不育性系統(tǒng)與玉米植物時(shí)，同樣利用一個(gè)或多個(gè)雄性育性恢復(fù)系基因可能是有益的。例如，如果使用胞質(zhì)雄性不育(CMS),則產(chǎn)生雜種種子需要3個(gè)近交系(l)具有CMS胞質(zhì)的胞質(zhì)雄性不育系；(2)具有正常胞質(zhì)的能育性近交系，這對于核基因而言是與CMS系等基因的("保持系")；和(3)不同的具有正常胞質(zhì)的能育性近交系，它攜帶育性恢復(fù)基因("恢復(fù)"系)。CMS系通過用保持系授粉而進(jìn)行繁殖，其所有子代均是雄性不育，因?yàn)镃MS胞質(zhì)得自母本。在與恢復(fù)系雜交的雜種中，這些雄性不育植物于是可有效地用作母本，而無需給母本的雄性生殖部分進(jìn)行物理去雄。雄性育性恢復(fù)系基因的存在導(dǎo)致產(chǎn)生完全能育的F,雜種后代。如果父本中不存在恢復(fù)基因，則得到雄性不育雜種。當(dāng)使用玉米植物營養(yǎng)組織(例如用于青貯飼料)，這類雜種是有益的，但是在大多數(shù)情況下，種子仍被認(rèn)為是最有價(jià)值的作物部分，所以必需恢復(fù)這些作物雜種的育性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及雜交玉米植物CH389090，該玉米植物包含能夠在其它雄性不育植物中恢復(fù)雄性育性的遺傳基因座?？蓱?yīng)用于本發(fā)明植物的雄性不育性基因和相應(yīng)恢復(fù)系的實(shí)例為植物育種領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可參見例如美國專利第5,530,191號、美國專利第5,689,041號、美國專利第5,741,684號和美國專利第5，684，242號，所述專利的公開內(nèi)容通過引用全部特別結(jié)合到本文中。例如，恢復(fù)系基因可以是Rf3基因(Duvick,1965;Chase和Gabay-Laugh腿2004;Gabay-Laugh腿等，2004)或用于Bamase/Barstar恢復(fù)系統(tǒng)的基因(Mariani等，1990;Mariani等，1992)。C.抗病性植物防御通常由植物中的抗病性基因(R)產(chǎn)物與病原體中的相應(yīng)無毒(Avr)基因產(chǎn)物之間特異性相互作用激活。植物系可用克隆的抗性基因轉(zhuǎn)化以改造成抗特定病原體毒抹的植物。參見例如Jones等(1994)(黃枝孢(C7a^w/on'ww/w/vww)抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin等(l993)(丁香假單胞菌致病變種(尸^i^owo"oss,/wgaepv.)抗性的番茄Pto基因)和Mindrinos等(1994)(丁香假單胞菌抗性的擬南芥RSP2基因)。病毒侵襲蛋白或由其衍生的復(fù)合毒素也可用于病毒病抗性。例如，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中，病毒外殼蛋白蓄積賦予了對產(chǎn)生該外殼蛋白基21因的病毒以及相關(guān)病毒引起的病毒感染和/或病害發(fā)展的抗性，參見Beachy等(1990)。外殼蛋白介導(dǎo)的抗性被賦予轉(zhuǎn)化植物以對抗苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕斑病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒。還可使用病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等(1993),他們指出表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)而免于病毒侵染。例如，Logemann等人(1992)公開了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物增加了真菌病抗性。D.糯性谷物淀粉糯性特征是隱性性狀的實(shí)例。在這個(gè)實(shí)例中，由第一回交代(BC1)得到的子代必須生長和自交。然后對得自BC1植物的自交種子進(jìn)行檢驗(yàn)以確定BC1植物攜帶糯性性狀的隱性基因。在其它隱性性狀中，需要進(jìn)行額外子代的4企驗(yàn)，例如使額外子代(例如BC1S1)生長，以確定植物攜帶的隱性基因。E.抗蟲性抗蟲性基因的一個(gè)實(shí)例包括蘇云金芽孢桿菌(Sad//^Awn'"g/e"w》蛋白、其衍生物或其合成的模式多肽。參見例如Geiser等(1986)，他們公開了Bt5-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷^列。此外，編碼S-內(nèi)毒素基因的DNA分子可按例如ATCC保藏號40098、67136、31995和31998，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)。另一個(gè)實(shí)例是凝集素。參見例如VanDamme等(1994),他們公開了君子蘭(C7/v/a柳'"/ato)甘露糖結(jié)合凝集素基因的若干核苷酸序列。也可采用維生素結(jié)合蛋白，例如抗生物素蛋白。參見PCT申請US93/06487，所述申請的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。這個(gè)申請教導(dǎo)了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對害蟲的殺幼蟲劑的用途。而另一個(gè)抗蟲性基因是酶抑制物，例如蛋白酶(protease)或蛋白水解酶(proteinase)抑制物或淀粉酶抑制物。參見例如Abe等(1987)(水稻半胱氨酸蛋白酶抑制物的核苦酸序列)、Himb等(1993)(編碼煙草蛋白酶抑制物I的cDNA核苷酸序列)和Sumitani等(1993)(硝孢鏈霉菌OSreptowyc^"/fms;orew力a-淀粉酶抑制物的核苦酸序列)。還可采用昆蟲特異性激素或信息素。參見例如Hammock等人(1990)有關(guān)桿狀病毒表達(dá)的克隆保幼激素酯酶(一種保幼激素的鈍化物)的公開內(nèi)容。還有的其它實(shí)例包括昆蟲特異性抗體或其衍生的免疫毒素和發(fā)育停頓蛋白。參見Taylor等(1994),他們指出轉(zhuǎn)基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段使酶失活。F.改進(jìn)的脂肪酸代謝、肌醇六磷酸代謝和糖代謝可以采用賦予改進(jìn)脂肪酸代謝的基因。例如，可以采用硬脂酰ACP去飽和酶基因(參見Knutzon等(1992))。還^t皮露了各種脂肪酸去飽和酶(基因)，例如釀酒酵母0LE1基因，其編碼A9脂肪酸去飽和酶，這是一種由棕櫚酰(16:0)輔酶A或硬脂酰(18:0)輔酶A形成單不飽和棕櫚油酸(16:l)和油酸(18:l)脂肪酸的酶(McDonough等，1992);編碼蓖麻硬脂酰?；d體蛋白A-9去飽和酶的基因(Fox等1993);藍(lán)細(xì)菌集胞藻(S)'"eckc^fe)負(fù)責(zé)將亞油酸(1S:"轉(zhuǎn)化成？亞麻酸(1S:3力的A^去飽和酶和A12-去飽和酶(Reddy等1993);得自擬南芥的編碼co-3去飽和酶的基因(Arondel等1992));植物A9-去飽和酶(PCT申請公布號WO91/13972)及大豆和蕓苔(Bm^/ca)A15去飽和酶(歐洲專利申請公布號EP0616644)。還可通過導(dǎo)入肌醇六磷酸酶編碼基因以提高肌醇六磷酸的分解，將更多游離磷酸加到轉(zhuǎn)化植物中，從而改進(jìn)肌醇六磷酸代謝。例如，有關(guān)黑曲霉C^pe/^7/ww/gw)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內(nèi)容可參見VanHartingsveldt等(1993)。例如，在玉米中，這可通過克隆然后再導(dǎo)入與單一等位基因有關(guān)的DNA來完成，所述單一等位23基因是造成以低水平肌醇六磷酸為特征的玉米突變型的原因(參見Raboy等(1990))。已知可用來改變糖代謝的多種基因。例如，植物可用編碼改變淀粉分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化。參見Shiroza等(1988)(變異鏈球菌OS^e/tococciwwwtora)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)、Steinmetz等(1985)(枯草芽孢桿菌CSGc/〃wwto7/》果聚糖蔗糖酶(蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶)基因的核苷酸序列)、Pen等(1992)(表達(dá)地衣芽孢桿菌CSac/〃w//c'/ze"^rm"')a-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生)、Elliot等(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苦酸序列)、Sergaard等(1993)(大麥a-淀粉酶基因的位點(diǎn)定向誘變)和Fisher等(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶11)。得自玉米并編碼10kD玉米醇溶蛋白貯藏蛋白的Z10基因還可用來改變細(xì)胞中10kD玉米醇溶蛋白相對于其它組分的含量(Kirihara等，1988)。III.植物及其用途本發(fā)明提供包含本發(fā)明的植物微染色體的轉(zhuǎn)基因植物，其中包括但不限于苜蓿、玉米、油菜、水稻、大豆、煙草、草沖草、燕麥、黑麥和小麥。還包括植物的種子，所述種子包含本發(fā)明的微染色體。例如，在某些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的微染色體的種子可表達(dá)賦予除草劑耐受性的基因。除草劑耐受性基因的一個(gè)有益實(shí)例提供草甘膦(N-(膦?；鶗趸?甘氨酸)抗性，包括這類除草劑的異丙胺鹽形式。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)可與植物的其它病害防治性狀組合以獲得用于提高防治植物病害所需的性狀。將應(yīng)用截然不同的作用方式的病害防治性狀組合在一起，可以為轉(zhuǎn)基因植物提供比帶有單一防治性狀的植物更一致并更持久的保護(hù)，因?yàn)樘镩g發(fā)生抗性的概率降低。本發(fā)明還涉及含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明微染色體的商品以及由含有一個(gè)或多個(gè)微染色體的重組植物或種子生產(chǎn)的商品。含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明序列的商品往往包括但不限于碾碎谷物、油品、壓碎谷物、整粒谷物或植物種子，或者包含含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明序列的重組植物或種子的任何碾碎谷物、油品、壓碎谷物、整粒谷物的任何食品。在一種或多種商品或本文所包括的產(chǎn)品中檢測出一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的序列實(shí)際上是商品或產(chǎn)品包含本發(fā)明微染色體的證據(jù)。本發(fā)明又一方面涉及包含微染色體的植物的組織培養(yǎng)物。本文所用術(shù)語"組織培養(yǎng)物"是指包含相同或不同類型的分離細(xì)胞的組合物或者構(gòu)成植物部分的這類細(xì)胞的集合體。示例性的組織培養(yǎng)物的類型為原生質(zhì)體、愈傷組織和在植物或植物部分中是完整的植物細(xì)胞，例如胚、花粉、花、種仁、穗、穗軸、葉、苞葉(husk)、柄、根、根尖、花藥、玉米長須，等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)物包括從這些植物部分未成熟組織中得到的胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、花粉、葉或花藥。植物組織培養(yǎng)物的制備和保持方法是本領(lǐng)域眾所周知的(美國專利第5,538,880號和美國專利第5,550,318號，所述各專利都通過引用全部結(jié)合到本文中)。舉例來說，包含器官(例如雄花穗或花藥)的組織培養(yǎng)物已被用來產(chǎn)生再生植物(美國專利第5,445,961號和美國專利第5,322,789號；所述專利的公開內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中)。一種玉米組織培養(yǎng)物類型是雄花穗/花藥培養(yǎng)物。雄花穗含有花藥，花藥進(jìn)而包住小孢子。小孢子發(fā)育成花粉。對于花藥/小孢子培養(yǎng)物，如果雄花穗是植物組成部分，則優(yōu)選在當(dāng)小孢子為單核時(shí)的階段挑選出，也就是說只包括1個(gè)而不是2個(gè)或3個(gè)核。確定正確階段的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括卡普霉素(mitramycin)熒光染色法、錐蟲藍(lán)(優(yōu)選)和乙酸洋紅壓片法。已觀察到單核小孢子階段中期是對本文隨后公開的最終產(chǎn)生植物的方法作出最大反應(yīng)的發(fā)育階段。盡管含有小孢子的植物器官(例如雄花穗)一般可在大約25。C以下的任何低溫下進(jìn)行預(yù)處理，但是優(yōu)選4-25。C的范圍，特別優(yōu)選8-14。C的范圍。盡管其它溫度也產(chǎn)生胚狀體并再生出植物，但是比起優(yōu)選范圍之外溫度預(yù)處理，低溫處理產(chǎn)生最佳反應(yīng)速度(responserate)。反應(yīng)速度用培養(yǎng)物中激發(fā)的胚狀體數(shù)或者每小孢子數(shù)再生的植抹數(shù)表示。小孢子培養(yǎng)的示例性方法參見例如美國專利第5,322,789號和美國專利第5,445,961號，所述專利的公開內(nèi)容通過引用特別結(jié)合到本文中。此外，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，起始植物或植物細(xì)胞用核酸(例如端粒截短載體)轉(zhuǎn)化。用核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，該方法可采用本文列舉的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或DNA粒子轟擊。已經(jīng)開發(fā)出某些用于轉(zhuǎn)化高分子量核酸的專門方法。例如，Hamilton及其同事設(shè)計(jì)的BIBAC系統(tǒng)(Hamilton,1997;Hamilton等，1996;專利號5,733,744),用于大的T-DNA插入片段轉(zhuǎn)化至植物基因組。BIBAC結(jié)合了Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)移功能和保持細(xì)菌人工染色體(BAC)大的DNA片段的能力。至于BAC,它具有單拷貝的大腸桿菌F質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，用于將質(zhì)粒穩(wěn)定保持在大腸桿菌中。它還具有單拷貝的土壤桿菌Ri質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和用于T-DNA轉(zhuǎn)化的T-DNA邊界。一個(gè)類似系統(tǒng)，具有大腸桿菌噬菌體PI起點(diǎn)的可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)，也已用于大的DNA的轉(zhuǎn)化(Liu等，1999)。IV.包含微染色體的植物的育種如上文所述，可按照本發(fā)明使用起始天然植物染色體產(chǎn)生植物微染色體。在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的天然染色體可為玉米染色體，例如玉米B染色體或玉米A染色體。例如，可使用表l中所列的任何玉米(Zeamcy")染色體作為制備本發(fā)明微染色體的起始染色體。表1表示玉米A染色體的大小，單位為兆堿基對(Mb)或厘摩(cM)。單位為cM的大小可通過Sharopova等人(2002)介紹的兩種不同的方法測定。26表l:玉米A染色體大小<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>還應(yīng)當(dāng)了解的是在一些情況下，微染色體包含位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)。因此，包含微染色體的任何植物變種均可用能夠通過位點(diǎn)專一重組將轉(zhuǎn)基因?qū)胛⑷旧w的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。植物微染色體一旦產(chǎn)生，則通過本領(lǐng)域眾所周知的植物育種技術(shù)可容易地漸滲到所需遺傳背景中。因此，本發(fā)明提供用于包含微染色體的植物的育種方法。按照這一方法，可將第一親本植物與第二親本植物雜交，其中第一植物和第二植物包含微染色體，或者其中至少一種植物包含微染色體。例如，包含微染色體的玉米植物(夏玉米(Zeawa^丄.))可通過自然或機(jī)械技術(shù)進(jìn)行雜交。有花植物當(dāng)風(fēng)或昆蟲從植物中傳播出花粉時(shí)，便產(chǎn)生天然授粉。然而，可通過控制傳入花粉的類型或者通過人工授粉進(jìn)行機(jī)械授粉。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交包含以下步驟(a)以傳粉接近的方式播種第一親本植物和第二親本植物的種子，優(yōu)選為第一近交植物的種子和不同的第二近交植物的種子；(b)將第一親本植物和第二親本植物的種子培育或生長成為開花植物；(c)將第一親本植物或第二親本植物的花去雄，即對花進(jìn)行處理從而防止花粉產(chǎn)生，或者用作母本雄性不育植物，從而提供去雄親本植物；(d)允許在第一親本植物和第二親本植物之間發(fā)生天然異花傳粉；(e)收獲去雄親本植物所產(chǎn)生的種子；并且如果需要，(f)將收獲的種子栽培成植物，優(yōu)選雜交植物。通常通過以交替行、小區(qū)或者以任何其它方便的種植模式種植親本植物，來以彼此傳粉接近的方式種植親本植物。如果親本植物性成熟的時(shí)間不同，則可能需要先種植成熟較慢的植物，從而確保在母本可接納花粉期間可獲得父本的花粉。栽培兩個(gè)親本的植物，并允許生長到開花時(shí)。最好在這個(gè)生長階段，根據(jù)栽培人員的適當(dāng)考慮，用肥料和/或其它農(nóng)藥對植物進(jìn)行一般處理。開花時(shí)，如果包含微染色體的植物是父本，則從用作母本植物的所有植物上摘除這些親本植物的產(chǎn)花粉器官以避免自花傳粉。這可以手工進(jìn)行，但是如有需要也可以用機(jī)器進(jìn)行。或者，當(dāng)母本植抹包含賦予雄性不育的胞質(zhì)基因或核基因時(shí)，則可能不需要摘除產(chǎn)花粉的器官。另外，可以使用化學(xué)去雄劑使雌抹的雄性花不育。在這種情況下，用作雄抹的親本植物可不用化學(xué)藥劑處理，或者可包含引起化學(xué)藥劑去雄作用抗性的遺傳因子。去雄劑影響參與發(fā)育、成熟或花粉釋放的過程或細(xì)胞。經(jīng)這類去雄劑處理的植物呈雄性不育，但是通常保持雌性育性。化學(xué)去雄劑的應(yīng)用參見例如美國專利第4,936,904號，其公開內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。此外，PCT公布號WO98/44140公開了將草甘膦耐藥性玉米植物與ROUNDUP除草劑(Monsanto，St.Louis，MO)配合使用，以產(chǎn)生雄性不育玉米植物。去雄后，通常再使植物繼續(xù)生長，由于風(fēng)的作用而發(fā)生天然異花傳粉，這在禾本科(例如玉米)授粉中是常見的。由于母本植物被去雄，父本植物的所有花粉都可用于授粉，因?yàn)橹耙褟碾s交中用作雌抹的所有植物上摘除了帶有花粉的開花部分。當(dāng)然，在這個(gè)雜交過程期間，使親本變種如此生長，即與其它田間植物隔離，從而將外部來源花粉的任何意外污染減到最小，或者防止外部來源花粉的任何意外污染。這些隔離技術(shù)均在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握之中?？墒闺s交的兩個(gè)親本植物繼續(xù)生長直到成熟，或者開花結(jié)束后可毀掉雄性行。僅收獲母本植物的種子以得到新的F,雜交種子。然后，可在隨后的生長季節(jié)，將所產(chǎn)生的新的F,雜種種子播種在商業(yè)化田間，又或者繼續(xù)育種方案以便開發(fā)新的近交系?；蛘?，在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本植物和第二親本植物的一種或兩種可包含植物微染色體。因此，包含本發(fā)明的微染色體的任何植物均構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。本文所用雜交可指自交、回交、與其它變種或同一變種雜交、與種群雜交等。因此，采用包含微染色體的植物作為親本所產(chǎn)生的所有玉米植物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例下面實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，以下實(shí)施例中所公開的技術(shù)代表本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明中操作良好的技術(shù)和/或組合物，因此可被視為構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，根據(jù)本公開內(nèi)容，在已公開的具體實(shí)施方案中進(jìn)行多種修改，依然可得到相同或類似結(jié)果而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1截短端粒的通用方法端粒介導(dǎo)的染色體的截短通過將6拷貝的端粒重復(fù)序列由轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入內(nèi)源植物染色體中來實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)特殊情況下，由Richards和Ausubel(1988)之前克隆的擬南芥端粒制備了端粒重復(fù)序列。玉米HiII(Armstrong和Green，1985)未成熟胚根據(jù)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案用標(biāo)準(zhǔn)雙元載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化(Frame等，2002)。在土^t桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化期間，T-DNA用土壤桿菌VirD2和VirE蛋白進(jìn)行保護(hù)，并且通過異常重組機(jī)制整合到植物基因組內(nèi)?？赡馨l(fā)生少量缺失，大多數(shù)發(fā)生在左邊界區(qū)，有時(shí)發(fā)生在右邊界區(qū)。然而，這些缺失不會(huì)破壞端粒序列。端粒重復(fù)序列的存在使得在整合時(shí)將染色體截短。已經(jīng)證實(shí)端粒相關(guān)染色體截短的發(fā)生，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)已被用來產(chǎn)生微染色體(Farr等，1991、1992、1995;Barnett等，1993;Itzhaki等，1992;Heller等，1996;Mills等，1999;Saffery等，2001)。采用兩個(gè)端粒介導(dǎo)的染色體截短構(gòu)建體，證實(shí)了6拷貝的同向擬南芥端粒單元可在玉米中使染色體截短。構(gòu)建了兩種染色體截短的雙元構(gòu)建體用于玉米Hill未成熟胚的土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化(pWY76和pWY86;參見圖1)。對于pWY76和pWY86，分別使93個(gè)和83個(gè)轉(zhuǎn)基因系恢復(fù)。應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)方法(Kato等，2004)檢測了T0轉(zhuǎn)基因植物中期染色體的轉(zhuǎn)基因。對于pWY76觀測到共123個(gè)轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)，對于pWY86觀測到107個(gè)位點(diǎn)，分別有54個(gè)和55個(gè)整合位點(diǎn)位于染色體末端。在其中發(fā)生了染色體截短的轉(zhuǎn)基因系中，還觀察到花粉敗育。此外，通過核型分析探針混合物，在若干轉(zhuǎn)基因系中檢測到遠(yuǎn)端FISH標(biāo)記的缺失。例如，在一個(gè)pWY76轉(zhuǎn)基因系中，3號染色體短臂被截短。DNA印跡法分析表明雜交條帶圖不清晰，這是異源基因新接入到端粒的典型特征(Farr等，1991)。這些研究表明，在這些轉(zhuǎn)基因系中發(fā)生了染色體截短。為了與pWY76和pWY86轉(zhuǎn)基因相比較，還同時(shí)將另外兩種無端粒重復(fù)序列的構(gòu)建體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化；然而，沒有觀察到染色體的截短。這些結(jié)果表明，端粒重復(fù)序列是染色體截短的原因。通過FISH篩選，在一個(gè)pWY86系中觀察到A染色體衍生的微染色體。發(fā)現(xiàn)這個(gè)微染色體起源于7號染色體，其長臂的大部分缺失。最初是在無B染色體的四倍體系中觀察到這個(gè)微染色體。由于它發(fā)生在多倍體中，由染色體的截短引起的缺陷被其二倍體配子體的同源物補(bǔ)償。實(shí)際上，在其中一個(gè)染色體缺陷的二倍體系中，沒有觀察到通常所觀察到的50%花粉敗育，在與由二倍體植物恢復(fù)的轉(zhuǎn)化體雜交后，30含有這種微染色體的子代得到恢復(fù)，這使倍性水平降低至三倍體。倍性水平被進(jìn)一步降低至二倍體并加上Hill和Mo17背景下的微染色體。進(jìn)一步的研究表明這個(gè)微染色體不會(huì)引起任何異常的表型。作為雄抹當(dāng)與二倍體植物雜交時(shí)，該微染色體以38.5%(10/26)的比率傳遞。用于植物端粒截短的核酸構(gòu)建體采用雙元載體pTF101.1構(gòu)建了兩個(gè)截短構(gòu)建體和無端粒對照(Paz等，2004)，被用來產(chǎn)生微染色體(參見圖l構(gòu)建體圖譜)。這些構(gòu)建體上的組分按順序排列如下pWY76:LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ox66-GFP-Tnos-Pmas-HPT-Tmas-6x端粒-RB,pWY86:LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ojc77-DsRed-Tnos-Pnos-Fir-FLP-Tnos-6x端粒-RB和pWY96:LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ox7/-DsRed-Tnos-Pnos-F^r-FLP-Tnos-Pmas-HPT-Tmas-RB。pWY76和pWY86中分別包括無啟動(dòng)子的1ox66-GFP或1ox71-DsRed融合基因，允許其它基因?qū)Ｒ恍哉系絣ox位點(diǎn)上。另外，pWY86上包括的Pnos-F7r-FLP-Tnos盒，允許在FRT位點(diǎn)上進(jìn)行位點(diǎn)專一重組以進(jìn)行進(jìn)一步基因整合。實(shí)施例2B染色體的端粒截短為了通過端粒介導(dǎo)的染色體的截短來產(chǎn)生微B染色體，將得自墨西哥黑甜玉米(BlackMexicanSweet，BMS)的玉米細(xì)胞的B染色體導(dǎo)入玉米HiII親本A系，并使之積蓄至多拷貝。通過基因槍轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)(Frame等，2000)，將兩個(gè)端粒相關(guān)染色體的截短構(gòu)建體與pACH25構(gòu)建體(Christensen和Quail，1996)混合以靶向具有多個(gè)B染色體的Hill雜種未成熟胚或Hill親本A未成熟胚。由pACH25構(gòu)建體的玉米泛蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Zw基因能夠有效地選出補(bǔ)充了雙丙氨膦的培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因事件。B染色體和A染色體構(gòu)建體截短物的端粒序列一旦整合到染色體上，便可從截短的B染色體和A染色體產(chǎn)生微染色體。通過FISH,由再生的除草劑抗性植物(TO)獲得的根尖中期染色體中篩選出微染色體。采用pACH25質(zhì)粒和pWY96構(gòu)建體(參見實(shí)施例l)作為FISH篩選的探針，這具有除端粒序列以外幾乎所有pWY76和pWY86兩者的序列(參見下文)。pWY96探針可與pWY76和pWY86轉(zhuǎn)基因兩者進(jìn)行有效雜交。使用B重復(fù)序列探針以鑒定B染色體的截短(Alfenito和Birchler，1993)。鑒定了48個(gè)微染色體；其中41個(gè)來自B染色體，7個(gè)來自A染色體。得自B染色體的所有微染色體是可傳遞的，其大多數(shù)在Tl代恢復(fù)。在3個(gè)截短的A微染色體上進(jìn)行A染色體加倍處理(Kato和Birchler,2006)以保存微染色體，否則如果保存在二倍體的話，它們將在減數(shù)分裂中丟失。實(shí)施例3用BIBAC載體系統(tǒng)通過土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化表達(dá)Cre基因?qū)τ诰哂邪ǔ輨┛剐詷?biāo)記基因、作為熒光原位雜交(FISH)標(biāo)記的30kb酵母基因組DNA和35S-/ox-Cre重組表達(dá)盒在內(nèi)的大量遺傳物質(zhì)的玉米轉(zhuǎn)化，采用了BIBACTM載體系統(tǒng)。簡單地講，如下構(gòu)建了BIBAC基因轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pJV21。對pCH20載體(Hamilton，1997)進(jìn)行了改進(jìn)以使5amffl至5Vral片段缺失。通過在5Wal位點(diǎn)上添加BamHI接頭，隨后用Samffl消化并再連接，重新構(gòu)建了SamHI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒稱為pJV06。通過平端連接，將得自pED97的含有35S-Zox尸-Cre基因表達(dá)盒的3.4kb州'"dniASa/1片段克隆到5awffl位點(diǎn)來制備pJV08。接著，將得自pAHC25(Christensen等，1992)的400bp端粒序列和ubi-6ar基因表達(dá)盒裝配到pBLUESCRIPT(Strategene，LaJolla，Califomia)中，然后通過平端連接克隆到pJV08的5>力位點(diǎn)以制備pJV15，其中端粒序列被置于雙元載體的左邊界。對于這些研究，ubi-k^基因被用作選擇標(biāo)記。端粒序列TTTAGGG(SEQIDNO:l)指向左邊界。通過平端連接將另一個(gè)400bp端粒序列克隆到位點(diǎn)以制備LB上的800bp端粒序列的同向重復(fù)序列。對克隆進(jìn)行了測序以證實(shí)端粒重復(fù)序列的方向。然后，將得自BIBAC1(Hamilton,1997;Hamilton等，1996)的30kb酵母DNA克隆到Notl位點(diǎn)以制備pJV21(圖2)。按照生產(chǎn)商的說明書(Gibco,InvitrogenCo"Carlsbad,California),對感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到土壤桿菌菌抹LBA4404中。在這個(gè)構(gòu)建體中，在鄰近右邊界處克隆35S-/o:c6<5-Cre表達(dá)盒，以便通過基因轉(zhuǎn)化將Cre〃ox位點(diǎn)專一重組系統(tǒng)置入基因組。遺傳轉(zhuǎn)化土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化用pJV21構(gòu)建體進(jìn)行以轉(zhuǎn)化具有0-12個(gè)B染色體的Hill植物的未成熟胚。75個(gè)轉(zhuǎn)化系得到恢復(fù)。轉(zhuǎn)基因通過DNA雜交和FISH得到證實(shí)(Kato等，2004)。在以DNA雜交為特征的60個(gè)系中，45個(gè)系具有單拷貝轉(zhuǎn)基因。75個(gè)轉(zhuǎn)基因系中的63個(gè)具有單一轉(zhuǎn)基因，由FISH得到證實(shí)。分別用bar基因和Cre基因探針，通過在T-DNA區(qū)的左端和右端的DNA印跡雜交，對轉(zhuǎn)基因完整性進(jìn)行了分析。在已分析的75個(gè)系中，觀察到52個(gè)轉(zhuǎn)基因系在左邊界和右邊界具有相同的拷貝數(shù)，這就表明了在這些情況下轉(zhuǎn)基因是完整的。轉(zhuǎn)基因整合到端粒區(qū)與具有分離條帶的轉(zhuǎn)基因事件相比，一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件Jll-9的DNA雜交條帶圖不清晰。不清晰的雜交條帶圖是由天然端粒活性或者在端粒介導(dǎo)的染色體的截短期間接入新端粒所產(chǎn)生的端粒特點(diǎn)，因?yàn)槎肆Ｄ┒宿D(zhuǎn)移酶在不同細(xì)胞中添加了不同數(shù)目的端?；騎TTAGGG;(SEQIDNO:l)(Fair等，1991;Richards和Ausubel,1988)。為了證明這個(gè)轉(zhuǎn)基因的末端性質(zhì)，使用切割正好在800bp端粒重復(fù)序列之前的轉(zhuǎn)基因遠(yuǎn)端區(qū)的多個(gè)限制酶來消化J11-9基因組DNA，并按33有關(guān)方法(Yu等，2006b)用32P標(biāo)記的k^基因探針進(jìn)行DNA雜交。不清晰雜交條帶圖根據(jù)3個(gè)限制酶切割位點(diǎn)(Wa1,Wol和Dral)和染色體端粒末端之間的距離發(fā)生了位移。例如，最近端的酶DraI形成范圍超過6kb的最大尺寸的不清晰條帶圖，而最遠(yuǎn)端的一個(gè)力al形成范圍為3.2-4.6kb的不清晰條帶圖，^T/oI形成的不清晰圖介于5-6kb。相比之下，在較近端的Z/^dlll位點(diǎn)上的切割形成了分離條帶。如果///wdlll位點(diǎn)在基因探針遠(yuǎn)端，則可形成分離條帶。這個(gè)///"dill位點(diǎn)很可能存在于天然端粒中，因?yàn)樵谖覀兊膒JV21構(gòu)建體的序列數(shù)據(jù)沒有觀察到該位點(diǎn)。因此，Jll-9中轉(zhuǎn)基因的末端位置可能是端粒內(nèi)整合事件的結(jié)果而不是端粒從頭形成的結(jié)果。另外，在Jll-9植物中沒有觀察到生長異常、配子體不育或傳遞減弱，這就表明沒有由該轉(zhuǎn)基因引起的功能遺傳物質(zhì)的丟失，這種現(xiàn)象常常在具有染色體的截短的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到(Yu等，2006b)。通過細(xì)胞學(xué)分析也顯示了這個(gè)轉(zhuǎn)基因的末端定位。使得自Jll-9根尖的染色體與熒光素-dUTP標(biāo)記的30kbDNA探針雜交，該探針與核型分析混合物相混合(Kato等，2004)。用該混合物產(chǎn)生出HiII轉(zhuǎn)化受體的核型(Yu等，2006a)。鑒定出該轉(zhuǎn)基因在3L染色體臂的末端。轉(zhuǎn)基因的位置和分布為了制作轉(zhuǎn)基因位置和分布譜，將FISH分析擴(kuò)大到所有轉(zhuǎn)基因系。通過FISH,在每個(gè)染色體核型(表2)中觀察到轉(zhuǎn)基因，且整合位點(diǎn)存在于或接近端粒、著絲粒、常染色質(zhì)區(qū)、異染色質(zhì)染色紐(knob)和NOR區(qū)。除8S和10S外，所有染色體臂都包括在內(nèi)。轉(zhuǎn)基因隨機(jī)分布在10個(gè)A染色體上，其中大染色體上的數(shù)目較多，小染色體上的數(shù)目較少，正如預(yù)期一樣。然而，在任何B染色體上均未觀察到轉(zhuǎn)基因，盡管轉(zhuǎn)化植物中存在多達(dá)12個(gè)B染色體("B")(平均3.9)。表2:轉(zhuǎn)基因事件與由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的玉米pJV21構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>轉(zhuǎn)基因系BDNA印跡FISHCre活性染色體定位CreY3012-223211+3L,中部12-231100-12-247111+8L，染色紐12-254121+2L，著絲粒-隨體-Y3012-265111+IOL，遠(yuǎn)端12-279111+1S，中部12-283111+12-292111+3L,中部12-30101+12-314111+6S，NOR12-324111+3S，遠(yuǎn)端12-332111+3L,中部12-343111+2S,遠(yuǎn)端12-354111-8L,著絲粒-Y30-染色紐12-360111+12-372112+1S+6L，lS-染色紐，61^=遠(yuǎn)端Oe/7o)c位點(diǎn)專一重組系統(tǒng)用BIBAC構(gòu)建體轉(zhuǎn)化將84個(gè)轉(zhuǎn)基因隨機(jī)置入玉米基因組。這些轉(zhuǎn)基因大多是完整的，如DNA雜交所示。用Cre基因探針通過DNA雜交在75個(gè)轉(zhuǎn)基因系檢測出91個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)(表2)。為了證實(shí)這些Cre轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和功能，報(bào)道構(gòu)建體pHK52(Srivastava等，1999)經(jīng)基因槍遞送到轉(zhuǎn)基因植物子代的未成熟胚中。pHK52構(gòu)建體含有處于玉米泛蛋白啟動(dòng)子之下的反義取向的P-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因。反義GUS基因兩側(cè)鄰接/oc尸位點(diǎn)的反向重復(fù)序列。反義GUS基因可逆轉(zhuǎn)為有義取向，并在Cre重組酶存在下進(jìn)行表達(dá)，該酶催化兩側(cè)鄰接lox位點(diǎn)反向重復(fù)序列的遺傳元件的倒位。對所有轉(zhuǎn)基因系的轟擊胚進(jìn)行了瞬時(shí)GUS測定。這項(xiàng)研究證實(shí)，在68個(gè)系中Cre基因具有功能(表2)。對于Jll-9與HiII系遠(yuǎn)交，分離出轉(zhuǎn)基因的胚群體。37在總共50個(gè)胚的30個(gè)中(比率約為1:1),其GUS表達(dá)被激活。實(shí)施例4B染色體通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化的端粒截短由于B染色體具有使其成為優(yōu)選微染色體的許多性質(zhì)，因此進(jìn)行色體。在這些研究中釆用了端粒截短構(gòu)建體pWY76和pWY86(圖1)。另外，通過用尸w/IA4vr11消化Y86并且自身連接以缺失35S-Z"r基因表達(dá)盒來制備質(zhì)粒pWY86-kzr。Christensen和Quail(1996)之前就描述了用于研究的質(zhì)粒pAHC25。簡單地講，在層流罩超靜臺(tái)(flowhood)中，在無菌條件下解剖1.2-2.0mm之間的未成熟胚。按照Songstad等人(1996)和Frame等人(2000)所述方法，進(jìn)行了玉米未成熟胚的基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化。將未成熟胚面朝下放置在含有N6鹽和維生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH5.8)(Chu等，1975)中，培養(yǎng)基補(bǔ)充了2.0mg/L2,4-D、100.0mg/L肌醇、2.8g/L脯氨酸、30.0g/L蔗糖、100.0mg/L酪蛋白水解物、3.0g/LGELRITE、25pM硝酸4艮。將胚在28。C下誘導(dǎo)2-4天，然后轉(zhuǎn)移到含有N6鹽和維生素的滲透培養(yǎng)基(pH5.8)中，培養(yǎng)基補(bǔ)充了2.0mg/L2,4-D、100.0mg/L肌醇、0.7g/L脯氨酸、30.0g/L蔗糖、100.0mg/L酪蛋白水解物、36.4g/L山梨醇、36.4g/L甘露醇、3.0g/LGELRITE、25inM硝酸銀，在轟擊前進(jìn)行4小時(shí)滲透處理。質(zhì)粒用Qiagen小量制備盒(miniprepkit)(Qiagen,Valencia,Califomia)制備。將3毫克的0.6n金粒子(BIO-RAD，Hercules,Califomia)涂上1pg端粒截短質(zhì)粒(pWY76、pWY86或pWY86-bar)和0.25|LigpAHC25的混合物。使用以下參數(shù)，用PDS1000/He基因槍(BIO曙RAD)進(jìn)行轟擊650psi破裂盤(rupturedisk)壓力，6cm耙距，6mm縫隙(gap),1.2cm從大載體(macro-carrier)至阻擋板(stoppingplate)，破裂時(shí)28Torr真空。38滲透培養(yǎng)基中經(jīng)轟擊的胚用PARAFILM包起來，在28°。下培育過夜后，次日轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)基因植物微染色體的FISH分析通過上述FISH，篩選出TO轉(zhuǎn)基因植物的微染色體。pWY96和pAHC25的探針通過切口平移用德克薩斯紅(Texasred)dCTP標(biāo)記(Kato等，2004)，與轉(zhuǎn)基因雜交。B重復(fù)序列(Alfenito和Birchler1993)用AlexaFluor-488dCTP標(biāo)記，并且分別與pWY96或pAHC25轉(zhuǎn)基因探針混合以篩選通過基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化的B染色體。CentC(Ananiev等，1998)和NOR(Stein等，1998)探針用AlexaFluor-488dCTP(Invitrogen)標(biāo)記；CRM(Zhong等，2000)用Cy5-dCTP標(biāo)記。微染色體根據(jù)它們與正常A型染色體或B型染色體相比較的大小來鑒定。按照Gao等人(1999)和Yu等人(2006)所述方法進(jìn)行了減數(shù)分裂細(xì)胞的FISH。B重復(fù)序列用德克薩斯紅dCTP標(biāo)記，染色紐序列(14)用AlexaFluor-488dCTP標(biāo)記。從雙丙氨膦抗性愈傷組織中再生出281個(gè)轉(zhuǎn)基因事件(67個(gè)具有pWY76，87個(gè)具有pWY86,127個(gè)具有pWY86-bar)。FISH表明，41個(gè)事件在B染色體上具有轉(zhuǎn)基因，它包括24個(gè)具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)基因的微染色體和20個(gè)具有內(nèi)部轉(zhuǎn)基因的完整B染色體。另外，鑒定出5個(gè)A-B和1個(gè)B-A易位以及7個(gè)得自A染色體的片段。最后，還鑒定出10個(gè)無轉(zhuǎn)基因信號的截短的B染色體衍生物。當(dāng)端粒介導(dǎo)的染色體的截短出現(xiàn)在這樣的定位即轉(zhuǎn)基因保留在無著絲粒片段上，并且在有絲分裂期間丟失時(shí)，很可能發(fā)生這些事件。如果這些微染色體沒有得到同一事件額外轉(zhuǎn)基因的支持，則它們在轉(zhuǎn)化過程的選擇期間便可能丟失。因此，這些微染色體在數(shù)量上少于具有轉(zhuǎn)基因的微染色體。微染色體大小的測量為了測量86B23的B著絲粒重復(fù)序列的大小，將B重復(fù)序列祐_標(biāo)記成綠色的綠色通道(greenchannel)的10個(gè)中期染色體圖像輸入FujifilmImageGaugeV3.3程序(Fuji,Tokyo,Japan)。對微染色體著絲粒的量和正常B染色體著絲粒的量進(jìn)行了測定，計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞微染色體著絲粒與正常B著絲粒的比率。計(jì)算出平均比率和標(biāo)準(zhǔn)差。為了測量86B23的染色體大小，粗線期染色體用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，用Zeiss熒光顯微鏡(CarlZeiss,Inc.，Oberkochen,Germany)拍攝圖像，并且輸入FujifilmImageGauge程序(Fuji)。測量了微染色體和正常B染色體的長度，計(jì)算得出它們的比率。將其它微染色體與同一細(xì)胞正常B染色體進(jìn)行比較，根據(jù)其外觀從直觀上估計(jì)其它微染色體的大小。若干截短的B染色體的大小比較結(jié)果見表3。微染色體的傳遞試驗(yàn)這些研究的結(jié)果表明，減數(shù)分裂期間微染色體的傳遞各不相同(表3)。單價(jià)R2(34.8。/。來自自花傳粉)的傳遞可與之前報(bào)道的等臂染色體8S"S(37.5%)(Yu等，2006)相當(dāng)。B型^f敖染色體通過父本的傳遞從12%(86-74)到39%(76-15a)不等(表3)。微染色體的傳遞受多種因素的影響，例如染色體大小極限值(Schubert，2001;Spence等，2006)。另已知B著絲粒大小和結(jié)構(gòu)可影響B(tài)染色體衍生物的傳遞(Kaszas和Birchler1998)。大多數(shù)B染色體衍生的微染色體在正常B染色體存在下不分離。B染色體長臂遠(yuǎn)端區(qū)和著絲粒是造成B染色體不分離的原因(Carlson1978)。例如，在正常B染色體存在下，父本將2拷貝微染色體傳遞給子代(表3)。B型微染色體的這個(gè)性質(zhì)提供了機(jī)制，以產(chǎn)生一系列用于增加目標(biāo)基因表達(dá)的微染色體。表3:B微染色體大小和傳遞比率<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>NM表示未測量。*具有微染色體的子代數(shù)目/所測試子代的數(shù)目。**微染色體傳遞數(shù)/所測試的子代數(shù)。B染色體和衍生物的轉(zhuǎn)基因個(gè)體的組織化學(xué)GUS測定法如同其它生物的超數(shù)B染色體一樣，玉米的B染色體也是惰性的，沒有任何測得出的活性基因(Jones，1995)。然而，尚不清楚B染色體缺乏基因活性是由缺乏基因引起的，還是因?yàn)锽染色體由其異染色質(zhì)性質(zhì)所致的基因轉(zhuǎn)錄抑制引起的。玉米B染色體的轉(zhuǎn)化被用來確定是否存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抑制。在本項(xiàng)研究中，記錄了17個(gè)在B染色體上只具有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因事件。這就表明它們可能受來自B染色體的轉(zhuǎn)基因k^基因表達(dá)的支持，盡管有可能在A染色體上存在轉(zhuǎn)基因，但是因太小以致于不能通過FISH方法檢測出。通過對抗性愈傷組織進(jìn)行分析，測定了這些事件中9個(gè)有GUS基因表達(dá)。其它事件缺乏GUS表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)化過程中GUS基因沉默或者是缺乏完整GUS基因表達(dá)盒造成的。然而，在至少6個(gè)事件中，GUS基因表達(dá)是由B染色體或衍生物上的轉(zhuǎn)基因造成的(表4)。在這些情況下，測定了由分離的子代發(fā)育的主根的GUS表達(dá)。例如，在76-15a、76-15b和86-74與受體品系植林遠(yuǎn)交的子代中，在B染色體或截短的衍生物上具有轉(zhuǎn)基因的所有子代(分別為14、11和3抹個(gè)體)均表達(dá)GUS,但是在B染色體或衍生物不具有轉(zhuǎn)基因的子代(分別為22、19和22抹個(gè)體)無一表達(dá)GUS。在具有最小微染色體的自花傳粉的86B23子代中，在微染色體上具有轉(zhuǎn)基因的25抹個(gè)體中有23林表達(dá)GUS，但是不具有微染色體的26林個(gè)體中無一顯示GUS表達(dá)。B染色體和衍生物上缺乏轉(zhuǎn)基因的子代中不存在GUS表達(dá)，證實(shí)了GUS表達(dá)來自B染色體或衍生物上的轉(zhuǎn)基因，沒有未被檢測的A染色體事件。因此，插入B染色體的轉(zhuǎn)基因至少在所測試的位點(diǎn)上進(jìn)行了表達(dá)。這些位點(diǎn)似乎沿B染色體著絲粒直到B染色體長臂的末端隨機(jī)分布。41表4:B微染色體中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)事件76-15a76-15b86-7486B2386B15576-1086-14染色體大小1/2BIB1/5B1/20B3/4B1B1B轉(zhuǎn)基因定位遠(yuǎn)端內(nèi)部遠(yuǎn)端遠(yuǎn)端遠(yuǎn)端遠(yuǎn)端著絲粒GUS+14113237216合計(jì)141132591223%100.0腦.O100.092.077.816.769.6按照J(rèn)efferson等(1987),通過GUS染色試劑盒(Sigma,St.Louis，MO)進(jìn)行了GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)測定。將愈傷組織或長2-5mm的切根直接放入50|il裝在96孔PCR板的GUS染色溶液中。將板用PARAFILM包起來，在37。C下培育1小時(shí)。/L-9^及2之間的重組為了說明微染色體作為人工染色體平臺(tái)的用途，測定了R2微染色體上/ojc位點(diǎn)的Cre催化交換。將具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)基因35S-/ox(56-Cre表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植抹Jll-9作為母本與R2雜交，R2含有無啟動(dòng)子的/ox77-DsRed(Clontech,MountainView,California)基因。丄ox(5(5和/ox77是突變的/ox重組位點(diǎn)，該位點(diǎn)按如上所述的最利于正向反應(yīng)的方式重組。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的成功重組導(dǎo)致了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因遠(yuǎn)端區(qū)的交換，并將J11-9的遺傳物質(zhì)添加到R2^f效染色體上?？赏ㄟ^可逆反應(yīng)來監(jiān)測重組，該反應(yīng)將無啟動(dòng)子DsRed基因置于35S啟動(dòng)子控制下，從而產(chǎn)生可識(shí)別的紅色熒光蛋白。采用具有德克薩斯紅濾光片的熒光立體顯微鏡，在發(fā)芽幼苗的主根中對重組事件進(jìn)行了篩選。根據(jù)熒光分析，從雜合Jl1-9與雜合R2雜交的總共44林F1子代中鑒定出4林植林。大約8.7%的子代(約4抹植林)應(yīng)具有基于R2和Jl1-9傳遞的兩種轉(zhuǎn)基因(表4)。為了確定紅色熒光是否是位點(diǎn)專一重組的結(jié)果，從表達(dá)紅色熒光的4抹植林的每一林中分離出基因組DNA,并用作模板用于PCR擴(kuò)增兩個(gè)預(yù)期的重組產(chǎn)物。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序，各種情況下/ox位點(diǎn)上的重組得到證實(shí)。測序區(qū)的構(gòu)型與預(yù)期模式相匹配。因此，證實(shí)42了該微染色體適于通過位點(diǎn)專一重組系統(tǒng)用于遺傳操作，并且能夠用作微染色體型人工染色體(AC)的原型。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)通過參照其以下方面而結(jié)合到本文中補(bǔ)充、說明、提供本文所采用方法、技術(shù)和/或組合物的背景或者教導(dǎo)本文所采用的方法、技術(shù)和/或組合物。美國專利3,710,511美國專利3,861,709美國專利4,654,465美國專利4,727,219美國專利4,769,061美國專利4，810，648美國專利4,940,835美國專利4,959,317美國專利4，975，374美國專利5,270,201美國專利5,322,789美國專利5,445,961美國專利6,262,341美國專利5,527,695美國專利5,530,191美國專利5,538,880美國專利5,550,318美國專利5,625,132美國專利5,658,772美國專利5,684,242美國專利5,689,041美國專利5,733,744美國專利5,736,369美國專利5,741,684美國專利5,929,301美國專利6,175,058美國專利6,187,994美國專利7,015,372Abe等，J編.C7z亂,262:16793,1987。Ab腿ski等，Ce〃,32(4):1301-1311,1983。Albert等，P/a"",7:649-659，1995。Alfenito和Birchler,135:589-597，1993。Ananiev等，A^/爿cat/Sc/L^4,95:13073，1998。Araki等，/Mo/.A'o/.,225(l):25-37,1992。Amki等，齒c/e/d^L，25(4):868-872,1997。Armstrong和Green,尸/awto,164:207-214,1985。Arondel等，5We"ce,258(5086):1353-1355,1992。Barnett等，A^c/e/c爿"Ai&s"21:27-36，1993。Bea勿等，^肌Aev.尸—戸Ao/.，28:451,1990。Brock和Pryor,C7z國譜扁，104:575-584,1996。Chang,載于尸te/"Stalker和Murphy(主編)，Wallingford，U.K.,CABInternational,17-35,1992。Chase和Gabay-Laughnan,載于Mo/ec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。6.權(quán)利要求3的植物微染色體，其中所述工程端粒序列得自擬南芥。7.權(quán)利要求1的植物微染色體，其中所述起始植物染色體的兩個(gè)臂都被截短。8.權(quán)利要求1的植物微染色體，其中所述微染色體的大小為約1Mb至約100Mb。9.權(quán)利要求1的植物微染色體，其中所述起始植物染色體是A染色體。10.權(quán)利要求1的植物微染色體，其中所述起始植物染色體是B染色體。11.權(quán)利要求1的植物微染色體，其中所述起始植物染色體得自雙子葉植物。12.權(quán)利要求11的植物微染色體，其中所述起始植物染色體得自單子葉植物。13.權(quán)利要求12的植物微染色體，其中所述起始植物染色體得自玉米。14.權(quán)利要求1的植物微染色體，其還包含位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)。15.權(quán)利要求15的植物微染色體，其中所述位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)是Fir或ioxY立點(diǎn)。16.權(quán)利要求1的植物微染色體，其還包含轉(zhuǎn)基因。17.權(quán)利要求16的植物微染色體，其中所述轉(zhuǎn)基因賦予選自以下的性狀抗蟲性、除草劑耐受性、糖代謝改變、脂肪酸代謝改變、抗病性、雄性育性恢復(fù)和有害物抗性。18.—種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含權(quán)利要求1的植物微染色體。19.一種植物，所述植物包含權(quán)利要求1的植物微染色體。20.權(quán)利要求18的植物，其中所述植物是玉米。21.—種種子，所述種子包含權(quán)利要求1的植物微染色體。22.—種產(chǎn)生植物微染色體的方法，該方法包括以下步驟(a)用包含至少兩個(gè)端粒重復(fù)序列的異源核酸轉(zhuǎn)化起始植物染色體；和(b)使起始植物染色體發(fā)生截短以產(chǎn)生植物微染色體。23.權(quán)利要求22的方法，該方法還包括用位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)轉(zhuǎn)化起始植物染色體。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述位點(diǎn)專一重組位點(diǎn)是/^r或lox位點(diǎn)。25.權(quán)利要求22的方法，其中所述端粒重復(fù)序列得自擬南芥。26.權(quán)利要求22的方法，其中所述異源核酸包含約6個(gè)端粒重復(fù)序列。27.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。28.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體通過DNA轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化。29.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體的兩個(gè)臂都被截短。30.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體是A染色體。31.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體是B染色體。32.權(quán)利要求22的方法，該方法還包括用選定的編碼序列轉(zhuǎn)化起始植物染色體。33.權(quán)利要求22的方法，其中所述選定的編碼序列賦予選自以下的性狀抗蟲性、除草劑耐受性、糖代謝改變、脂肪酸代謝改變、抗病性、雄性育性恢復(fù)和有害物抗性。34.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物染色體包含在植物細(xì)胞內(nèi)。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述植物細(xì)胞包含至少2個(gè)B染色體拷貝。36.權(quán)利要求18的植物細(xì)胞，其中所述植物微染色體包含轉(zhuǎn)基因。37.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物A染色體通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。38.權(quán)利要求22的方法，其中所述起始植物B染色體通過微彈轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化。39.權(quán)利要求17的植物微染色體，其中所述賦予雄性育性恢復(fù)的編碼序列是Rf3基因。40.權(quán)利要求33的方法，其中所述賦予雄性育性恢復(fù)的編碼序列是Rf3基因。全文摘要本發(fā)明提供由天然染色體經(jīng)端粒介導(dǎo)的截短產(chǎn)生的工程植物微染色體。這些微染色體從一代如實(shí)傳遞到下一代，本發(fā)明還提供一個(gè)理想的平臺(tái)，用于通過育種使基因進(jìn)入所需植物變種而又無與標(biāo)準(zhǔn)育種方法有關(guān)的問題，例如連鎖拖曳。文檔編號C12N15/82GK101484581SQ200780025280公開日2009年7月15日申請日期2007年5月9日優(yōu)先權(quán)日2006年5月9日發(fā)明者J·M·維加,J·伯奇勒,W·于申請人:密蘇里大學(xué)學(xué)監(jiān)