專利名稱：一種端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于端粒酶活性檢測技術領域，涉及一種端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
端粒酶(Telomerase)是一種核蛋白逆轉錄酶，由RNA模板和蛋白催化亞基組成。通過反轉錄作用，它可以延伸染色體端粒的3'末端的重復序列(TTAGGG) n，從而實現(xiàn)穩(wěn)定端粒長度，抑制細胞分裂的作用。在正常人體組織和細胞中，端粒酶的活性被抑制，而在超過85%的已知腫瘤細胞中，端粒酶往往具有較高的活性,被認為與腫瘤細胞的激活,轉化增殖等過程密切相關。在臨床診斷領域，端粒酶是一種重要的惡性腫瘤標志物。此外，許多癌癥治療方法和藥物也以抑制腫瘤細胞中端粒酶活性為目標，因此，建立高靈敏度、選擇性強、操作簡便的端粒酶活性檢測方法，對于癌癥的早期診斷及治療具有十分重要的意義。目前，對于腫瘤細胞中的端粒酶檢測主要是通過在kim等建立的端粒酶重復序列擴增法(Telomeric repeat amplification protocol, TRAP)基礎上建立起來的一系列改良方法，包括TRAP結合EB染色法，TRAP結合銀染色法，實時熒光TRAP法等。該類方法的核心在于利用聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增被端粒酶延長的底物(Telomerase Substrate,TS),實現(xiàn)檢測信號的放大，通過PCR產(chǎn)物來表征端粒酶的逆轉錄活性。雖然TRAP類方法具有較高的靈敏度，但操作復雜，反應步驟多，耗時長，需要配備價格昂貴的熱循環(huán)設備；此外，PCR技術中Taq聚合酶的活性容易受到復雜體系的抑制，產(chǎn)生假陰性結果，而引物二聚體又容易引起假陽性信號，對端粒酶的檢測形成嚴重的干擾。因此TRAP類方法不適用于臨床腫瘤細胞端粒酶的實時、快速檢測。近年來，為了避免TRAP類方法的缺陷，國內(nèi)外的研究者們相繼建立了許多新型端粒酶檢測技術，包括化學發(fā)光法，比色法，電化學方法，熒光法等。這些方法雖然更加簡便，快速，但卻難以獲得令人滿意的靈敏度與檢測范圍，同時一些價格按昂貴或不易合成的材料也限制了該類方法在實際中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，通過基于DNA分子機器的等溫級聯(lián)核酸擴增方法替代傳統(tǒng)的基于PCR擴增技術的TRAP法對端粒酶活性進行檢測，并結合特殊的DNA結構來抑制非特異性擴增。該方法不僅具有與TRAP法相媲美的靈敏度，同時操作簡便，成本較低。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種端粒酶活性檢測試劑盒，包括端粒酶底物，與端粒酶結合后，利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物；端粒酶逆轉錄緩沖液，用于延長端粒酶底物的反應；DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；
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觸發(fā)DNA分子機器工具的探針,包括3WJ模板、3WJ引物、primerl和primer2 ；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩爾比為1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端開始包括三部分第一部分與端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互補，第二部分與3WJ引物3'端5 Sbp的堿基互補，第三部分是用于一級擴增的模板，包含一個核酸切口酶的識別位點；3WJ引物由3'端開始包括三部分，第一部分與3WJ模板的第二部分相互補的序列，第二部分與端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互補，第三部分與端粒酶底物的延長部分的序列相互補；端粒酶底物primer I primer 2的摩爾比為I :5 10:5 10 ;primer I包括兩部分,3'端第一部分與primer 2的3’端互補,其長度為5 8個bp ;第二部分是與一級擴增產(chǎn)物相互補的序列；primer 2包括兩部分,3'端第一部分與primer I的第一部分互補；第二部分是用于二級擴增的模板，其長度為15 21bp ；分子信標探針包括一個莖環(huán)結構，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，其環(huán)狀部分序列與二級擴增產(chǎn)物的序列相互補，分子信標探針的摩爾濃度為primer 2的3 6倍;DNA 分子機器擴增反應緩沖液10mM Tris-HCl, 50mM NaCl，IOmM MgCl2 和 ImMDDT，pH=7. 9。所述所述的DNA分子機器工具由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶組成，端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；primer I的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示；primer 2 核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 5 所不；分子信標探針的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。所述的3WJ模板的Y端還被磷酸化。一種端粒酶活性檢測方法，包括以下步驟I)將待測細胞裂解后離心，分離得到含有端粒酶的上清液；2)將含有端粒酶的上清液與端粒酶底物混合，在端粒酶逆轉錄緩沖液中利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物，生成端粒酶延長產(chǎn)物；3)端粒酶底物延長反應完成后，加入觸發(fā)DNA分子機器工具的探針、DNA分子機器工具、作為底物的dNTPs，以及信號轉化分子，在DNA聚合酶與核酸切口酶所要求的溫度下進行擴增反應，最終形成的二級擴增產(chǎn)物與信號轉化分子作用產(chǎn)生放大的熒光檢測信號；
所述的DNA分子機器工具包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；所述的探針包括3WJ模板、3WJ引物、primerl和primer2 ;所述的信號轉化分子為分子信標探針；其中，端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩爾比為1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端開始包括三部分第一部分與端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互補，第二部分與3WJ引物3'端5 Sbp的堿基互補，第三部分是用于一級擴增的模板，包含一個核酸切口酶的識別位點；3WJ引物由3'端開始包括三部分，第一部分與3WJ模板的第二部分相互補的序列，第二部分與端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互補，第三部分與端粒酶底物的延長部分的序列相互補；端粒酶延長產(chǎn)物、3WJ模板和3WJ引物混合形成便于DNA聚合酶擴增的三元連接結構；三元連接結構在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs的存在下啟動DNA分子機器擴增反應，產(chǎn)生一級放大產(chǎn)物；primerl和primer2是針對一級放大產(chǎn)物設計的兩個探針,端粒酶底物primerl primer2的摩爾比為I :5 10:5 10 ;primerl包括兩部分,3'端第一部分與primer2的3’端互補,其長度為5 8個bp ;第二部分是與一級擴增產(chǎn)物相互補的序列；primer2包括兩部分,3'端第一部分與primerl的第一部分互補；第二部分是用于二級擴增的模板，其長度為15 21bp ；一級放大產(chǎn)物與primerl和primer2形成堿基堆積結構，在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs作用下觸發(fā)DNA分子機器，產(chǎn)生二級放大產(chǎn)物；分子信標探針包括一個莖環(huán)結構，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，其環(huán)狀部分序列與二級擴增產(chǎn)物的序列相互補，分子信標探針的摩爾濃度為primer2的3 6倍;生成的二級放大產(chǎn)物與分子信標雜交形成雙鏈，破壞其穩(wěn)定的莖環(huán)結構，導致熒光基團與猝滅基團分開，產(chǎn)生熒光信號；4)待反應完成后，利用熒光儀檢測熒光信號的強度，根據(jù)熒光信號的檢測結果與細胞數(shù)量來繪制標準曲線，其中，橫坐標為細胞數(shù)量的對數(shù)，縱坐標為相對突光增強倍數(shù)(F-F0) AVF為熒光檢測強度，F(xiàn)tl為細胞數(shù)量為零時的背景熒光強度，根據(jù)標準曲線反映的線性關系來判斷待測細胞中端粒酶的活性。所述的標準曲線表示為Y=AlogX+B, Y表示相對突光增強倍數(shù)(F-Fci) /Fc^X表示細胞數(shù)量，A與B由標準曲線來確定。所述的端粒酶逆轉錄緩沖液包括20mM Tris-HCUl. 5mM MgCl2、ImMEGTA、63mMKCl、O. 2mM dNTPs 和體積分數(shù)為 O. 05% 的 Tween20, ρΗ=7· 9 ；利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物時，端粒酶底物濃度為150ηΜ，反應溫度為30 °C，反應時間為60min。所述的端粒酶延長產(chǎn)物、3WJ模板和3WJ引物形成的三元連接結構后，首先在DNA聚合酶作用下由3WJ引物的3'端進行擴增，與3WJ模板的第三部分的序列形成含有核酸切口酶識別的雙鏈序列；核酸切口酶識別并切割單鏈后形成可再次被DNA聚合酶作用的缺口，從而引發(fā)擴增-置換-切割循環(huán)的DNA分子機器，產(chǎn)生一級放大產(chǎn)物；—級放大產(chǎn)物與primerl和primer2形成的堿基堆積結構,在DNA聚合酶作用下，primerl和primer2的3'端均進行擴增；primerl擴增后與primer2的第二部分形成含有核酸切口酶識別的雙鏈序列；核酸切口酶識別并切割單鏈后可再次形成被DNA聚合酶作用的缺口，從而引發(fā)擴增-置換-切割循環(huán)的DNA分子機器，形成二級放大產(chǎn)物；primer2擴增后導致一級放大產(chǎn)物被置換下來,與其他的primerl和primer2形成的新的堿基堆積結構，從而觸發(fā)多個擴增-切割循環(huán)的DNA分子機器，進一步放大檢測信號。所述的DNA分子機器為由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶組成的DNA分子機器，其反應溫度為37度，要求的反應體系包括IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmM MgCl2, ImMDDT，10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nM primerl, 50nM primer2，IOOnM分子信標探針，0. IU/μ L KF 聚合酶，O. 2U/ μ LNt. BbvCI 和 O. 2mM dNTPs, ρΗ=7· 9 ;反應時間為 90 120min。所述的3WJ模板的第二部分的A-T比例大于75%。所述的3WJ模板的Y端還被磷酸化。所述的分子信標探針其5'與3'端分別標記有熒光基團FAM和猝滅基團DABCYL。所述的端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；primerl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示；primer2 核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 5 所不；分子信標探針的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果I、本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，是一種基于等溫核酸擴增技術的端粒酶檢測方法，通過等溫級聯(lián)核酸擴增放大端粒酶逆轉錄產(chǎn)物，然后將其轉化為方便檢測的熒光信號，從而具有很高的靈敏度與檢測范圍。2、本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，采用的等溫核酸擴增放大技術是基于鏈置換擴增(Strand displacement amplification, SDA)的DNA分子機器(DNA-machine),利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶的延伸反應與核酸切口酶(nickingenzyme)識別并切割特定雙鏈中單鏈的性質,在等溫條件下可以對寡核苷酸單鏈迅速擴增。該反應其不僅具有較高的擴增效率，同時不需要精確的熱循環(huán)設備；此外具有鏈置換活性的DNA聚合酶,如KF聚合酶(Klenow Fragment polymerase)等相對于Taq DNA聚合酶受復雜體系影響較小。3、本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，為了克服基于核酸擴增放大信號檢測體系中非特異性擴增(Nonspecific amplification)對于目標物檢測的干擾，采用了兩對探針分別形成三元連接(Three-way junction, 3WJ)結構，以及堿基堆積雜交(Base-stacking hybridization)結構,從而達到抑制非特異性擴增,提高檢測靈敏度的目的I) 3WJ探針上5-8個bp的互補區(qū)域，3WJ引物與端粒酶底物3’端2_6個bp的互補區(qū)域，以及primerl和primer2的3’端5_8個bp的互補區(qū)域在DNA分子機器的反應溫度下難以形成穩(wěn)定的雜交結構，確保了它們各自之間不會相互作用產(chǎn)生非特異性擴增；2)當不存在端粒酶時，端粒酶底物與3WJ模板的雜交有效地覆蓋了 3WJ模板的大部分上游序列，大大降低了由單堿基引發(fā)的非特異性擴增的概率。確保了等溫級聯(lián)核酸擴增檢測端粒酶活性的方法具有較低的背景信號。
3)在3WJ模板的3’端修飾磷酸基團抑制3WJ模板自身的非特異性擴增。4、本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，將三元連接結構觸發(fā)的DNA分子機器與堿基堆積雜交觸發(fā)的DNA分子機器通過一級擴大反應產(chǎn)物進行串聯(lián)，構建了一種新型的等溫級聯(lián)核酸擴增信號放大系統(tǒng)，具有很高的放大效率。5、本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，與基于PCR技術的TRAP類商品化方法操作相比，操作更加簡便，步驟少，且不需要昂貴的熱循環(huán)設備；由于本發(fā)明利用的基于DNA分子機器的等溫核酸擴增技術不容易受到復雜體系的干擾，減少了 TRAP類商品化方法中經(jīng)常出現(xiàn)的假陰性信號。6、本發(fā)明提供端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，對腫瘤細胞具有較好的選擇性，可以顯著反應腫瘤細胞與正常體細胞端粒酶的活性的差異；對各種腫瘤細胞中端粒酶活性的檢測具有廣泛適用性。7、本發(fā)明提供端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，不僅可用于腫瘤細胞中端粒酶活性的檢測，還可用于檢測化學藥物對端粒酶活性產(chǎn)生的抑制作用。為癌癥臨床藥物治療提供了一種監(jiān)測手段。


圖I是本發(fā)明的等溫級聯(lián)核酸擴增信號放大過程的示意圖；圖2-1 2-2是Hela細胞提取物中端粒酶活性的定量檢測結果，其中圖2_1為不同數(shù)量Hela細胞端粒酶提取物對應的熒光發(fā)射光譜，圖2-2為518nm處熒光增強倍數(shù)與Hela細胞數(shù)量的關系；圖3是不同細胞中端粒酶提取物的檢測結果；圖4是3’ -疊氮-3’ -脫氧胸苷(AZT)對Hela細胞中端粒酶活性抑制的檢測結
果O
具體實施例方式下面結合具體的附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。參見圖1，基于三元連接結構和堿基堆積介導等溫級聯(lián)信號放大檢測端粒酶活性的示意圖，其中a)為端粒酶延長底物的反應過程，b)和c)為基于DNA分子機器的等溫級聯(lián)信號放大過程。具體使用了 6種寡核苷酸探針，包括端粒酶底物、3WJ模板、3WJ引物、primerl、primer2,以及分子信標探針；分別對其功能陳述如下端粒酶底物，能夠被端粒酶識別并進行延長反應；其與端粒酶結合后，利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩爾比為1:0. 5-1. 5:0. 5-1. 5 ；3WJ模板由3'端開始包括三部分第一部分與端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互補，第二部分與3WJ引物3'端5 Sbp的堿基互補，第三部分是用于一級擴增的模板，包含一個核酸切口酶的識別位點；3WJ引物由3'端開始包括三部分，第一部分與3WJ模板的第二部分相互補的序列，第二部分與端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互補，第三部分與端粒酶底物的延長部分的序列相互補；端粒酶底物primerl primer2的摩爾比為I :5 10:5 10 ;primerl包括兩部分,3'端第一部分與primer2的3’端互補,其長度為5 8個bp ;第二部分是與一級擴增產(chǎn)物相互補的序列；primer2包括兩部分,3'端第一部分與primerl的第一部分互補；第二部分是用于二級擴增的模板，其長度為15 21bp ；分子信標探針包括一個莖環(huán)結構，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，其環(huán)狀部分序列與二級擴增產(chǎn)物的序列相互補，分子信標探針的摩爾濃度為primer2的3 6倍;能夠符合上述要求的寡核苷酸探針即可用于等溫級聯(lián)擴增檢測端粒酶活性，下面給出一種具體的序列設計(5’-3’)端粒酶底物AATCCGTCGAGCAGAGTT；3WJ 引物TAACCCTAACCCTAACCCTAAAAGAAAAAG ；3WJ 模板GGAAGAGACGAGCGGCTGAGGTTCTTTTTCCTCTGCTCGACGGATT ；primerl:GGAAGAGACGAGCGG CTGAAGCGA ；primer2:AAAGGTGCAGGATGGAGCTGAGGCCCTCGCT ；分子信標FAM-CCTAGCGAAAGGTGCAGGATGGAGCTGAGGCTAGG-DABCYL;參見圖1，3WJ模板上的區(qū)域I被設計成與端粒酶底物的5’端序列互補(紅色部分);3WJ-探針上的區(qū)域II (橙色部分)與primerl和primer2上的區(qū)域VII (棕色部分)分別只有7個bp與5個bp的互補序列；3WJ引物上區(qū)域IV的兩個堿基與端粒酶底物3’端的兩個堿基互補(黃色部分);3WJ引物的區(qū)域V含有3個TCCCAA重復序列，可與端粒酶逆轉錄合成的，Btt連端粒酶底物3’端的3個AGGGTT序列雜交(綠色部分)；3WJ模板上的區(qū)域III(藍色部分)與引物2上的區(qū)域VIII (粉色部分)為DNA分子機器的模板序列，含有Nt. BbvCI識別雙列序列中，不被切割的單列序列3’ -GGAGTCG-5’。3WJ引物的3’端修飾磷酸基團。上述方法對Hela細胞中端粒酶活性進行檢測，具體操作為I) Hela細胞中端粒酶的提取將含有IX IO6個指數(shù)生長階段的Hela細胞的培養(yǎng)液轉移到I. 5mL離心管中，用磷酸緩沖液(pH=7. 4)洗滌兩次(4° C，2000rpm，離心lOmin)。細胞沉積物重懸浮于200 μ L預冷的I X CHAPS細胞裂解緩沖液中(含有200U/mL)的RNA酶抑制劑，冰浴30min后于4° C，12000rpm離心20分鐘，收集180 μ L的上清液，于-80° C溫度下儲存。2)端粒酶逆轉錄延長底物反應利用I X CHAPS細胞裂解緩沖液稀釋Hela細胞端粒酶提取物，將2 μ L稀釋的Hela細胞端粒酶提取物加入到含有150ηΜ端粒酶底物(端粒酶引物)和O. 2mM dNTPs的10 μ L端粒酶逆轉錄緩沖液中(20mM Tris-HCl, I. 5mMMgCl2, ImM EGTA, 63mM KCl, 0. 05%Tween20,pH=7. 9)在30度下反應60min。3)等溫級聯(lián)核酸擴增放大熒光檢測信號將10 μ L上述反應液轉移到含有10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nMprimerl, 50nMprimer2, IOOnM 分子信標探針，O. IU/ μ L Klenow fragment 聚合酶，0. 2U/ μ L Nt. BbvCI核酸切口酶，以及 O. 2mM dNTPs 的 IXNEB buffer2 (IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmMMgC12, ImM dithiothreitol, pH=7. 9)中，總體積為 100 μ L,于 37 度下反應，IOOmin 后進行
熒光檢測。具體檢測結果如圖2所示,其中圖2-1為不同數(shù)量Hela細胞端粒酶提取物對應的熒光發(fā)射光譜，隨著細胞數(shù)量的增加，熒光強度也相應的增加；利用熒光儀檢測熒光信號的強度，根據(jù)熒光信號的檢測結果與細胞數(shù)量來繪制標準曲線，其中，橫坐標為細胞數(shù)量的對數(shù)，縱坐標為相對熒光增強倍數(shù)(F-Ftl)/Ftl, F為熒光檢測強度，F(xiàn)0為細胞數(shù)量為零時的背景熒光強度；圖2-2為518nm處熒光增強倍數(shù)與Hela細胞數(shù)量的關系及標準曲線；可以看到，518nm處熒光增強倍數(shù)隨Hela細胞數(shù)量增加而增加，利用該方法可以檢測3 5000數(shù)量范圍內(nèi)的Hela細胞端粒酶活性,其線性范圍內(nèi)的標準曲線為Y=A logX+B,具體為Y=2. 45Χ-1. 52 (Y表示相對熒光增強倍數(shù)，X表示細胞數(shù)量)。標準曲線中Y表示相對熒光增強倍數(shù)，由檢測結果而獲得，X表示細胞數(shù)量在檢測前可知，而所生成的Α、B與待測細胞相關；對于同種細胞來說，可以設定腫瘤或非腫瘤的細胞來對照，端粒酶活性高則Y值高，標準曲線斜率較大；也可以采用標準定量方法，比如以Hela細胞作為基準，根據(jù)Hela細胞和待測細胞各自的標準曲線，以選定的熒光強度為基準，從而將待測細胞的端粒酶的活性定量為Hela細胞端粒酶的活性的某個系數(shù)，從而達到對其進行定量。方法的重復性考證對檢測范圍內(nèi)78個和625個Hela細胞端粒酶提取物分別進行三次重復測量，其測量結果的標準偏差分別為4. 76%與3. 15%，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。方法的選擇性與普遍適用性利用該方法分別對六種相同細胞個數(shù)的不同細胞系(兩個體細胞H9C2, 293Α,四個腫瘤細胞Hela，PC3, LINCaP, H印G2)的端粒酶提取物(2500個細胞)進行檢測，結果如圖3所示，其中縱坐標為檢測熒光強度?？梢钥闯觯膫€腫瘤細胞的端粒酶提取物均引起顯著的熒光增強，而兩個體細胞的端粒酶提取物僅產(chǎn)生微弱的熒光增強。說明該方法能夠選擇性地區(qū)分腫瘤細胞與體細胞端粒酶的活性，并對各種瘤細胞端粒酶活性的檢測具有普遍適用性?；诘葴丶壜?lián)核酸擴增放大熒光信號的腫瘤細胞中端粒酶活性檢測方法，對AZT抑制Hela細胞端粒酶活性進行檢測，具體操作為I) Hela細胞中端粒酶的提取將含有IX IO6個指數(shù)生長階段的Hela細胞的培養(yǎng)液轉移到I. 5mL離心管中，用磷酸緩沖液(pH=7. 4)洗滌兩次(4° C，2000rpm，離心lOmin)。細胞沉積物重懸浮于200 μ L預冷的I X CHAPS細胞裂解緩沖液中(含有200U/mL的RNA酶抑制劑)，冰浴30min后于4° C，12000rpm離心20分鐘，收集180 μ L的上清液，于-80° C溫度下儲存。2) AZT抑制端粒酶活性利用I XCHAPS細胞裂解緩沖液稀釋Hela細胞端粒酶提取物，將2 μ L含有2500個Hela細胞端粒酶提取物加入到含有150ηΜ端粒酶底物和O. 2mM dNTPs的10 μ L端粒酶逆轉錄緩沖液中(20mM Tris-HCl, I. 5mM MgCl2, ImM EGTA, 63mM KCl, 0. 05%Tween20,pH=7. 9)，在30度下反應120min。同時,在反應的第Omin, 60min,和90min向體系中分別加入2mM, IOmM,以及50mM濃度的AZT (每個時間點對應三個濃度，共9組)，對照組不加AZT。3)等溫級聯(lián)核酸擴增放大熒光檢測信號將上述10組反應液分別轉移到含有10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nM弓丨物 1，50nM 引物 2，IOOnM 分子信標探針，O. IU/ μ L Klenow fragment 聚合酶，O. 2U/μ L Nt. BbvCI 核酸切口酶，以及 0.2mM dNTPs 的 IXNEB buffer2 (IOmM Tris-HCl, 50mMNaCl, IOmM MgC12, ImM dithiothreitol, pH=7. 9)中，總體積為 100 μ L,于 37 度下反應，IOOmin后進行突光檢測。具體檢測結果如圖4所示，可以看到，2500個Hela細胞端粒酶提取物誘導產(chǎn)生的熒光信號強度隨AZT濃度的上升與作用時間的增加均呈下降趨勢，與端粒酶活性的變化相一致，說明了該方法可用于抗腫瘤藥物抑制端粒酶活性的檢測。
權利要求
1.一種端粒酶活性檢測試劑盒，其特征在于，包括端粒酶底物，能夠被端粒酶識別并進行延長反應；端粒酶逆轉錄緩沖液，用于延長端粒酶底物的反應；DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；觸發(fā)DNA分子機器工具的探針，包括3WJ模板、3WJ引物、primer I和primer 2 ；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩爾比為1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端開始包括三部分第一部分與端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互補，第二部分與3WJ引物3'端5 Sbp的堿基互補，第三部分是用于一級擴增的模板， 包含一個核酸切口酶的識別位點；3WJ引物由3'端開始包括三部分，第一部分與3WJ模板的第二部分相互補的序列，第二部分與端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互補，第三部分與端粒酶底物的延長部分的序列相互補；端粒酶底物primer I primer 2的摩爾比為I :5 10:5 10 ; primer I包括兩部分,3'端第一部分與primer 2的3’端互補,其長度為5 8個bp ; 第二部分是與一級擴增產(chǎn)物相互補的序列；primer 2包括兩部分,3'端第一部分與primer I的第一部分互補；第二部分是用于二級擴增的模板，其長度為15 21bp ；分子信標探針包括一個莖環(huán)結構，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，其環(huán)狀部分序列與二級擴增產(chǎn)物的序列相互補，分子信標探針的摩爾濃度為primer 2的3 6倍； DNA 分子機器擴增反應緩沖液10mM Tris-HCl, 50mM NaCl，IOmMMgCl2 和 ImM DDT, pH=7. 9。
2.如權利要求I所述的端粒酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的DNA分子機器工具由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶組成，端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示； primer I的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； primer 2核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；分子信標探針的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。
3.如權利要求I所述的端粒酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的3WJ模板的3'端還被磷酸化。
4.一種端粒酶活性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)將待測細胞裂解后離心，分離得到含有端粒酶的上清液；2)將含有端粒酶的上清液與端粒酶底物混合，在端粒酶逆轉錄緩沖液中利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物，生成端粒酶延長產(chǎn)物；3)端粒酶底物延長反應完成后，加入觸發(fā)DNA分子機器工具的探針、DNA分子機器工具、作為底物的dNTPs，以及信號轉化分子，在DNA聚合酶與核酸切口酶所要求的溫度下進行擴增反應，最終形成的二級擴增產(chǎn)物與信號轉化分子作用產(chǎn)生放大的熒光檢測信號；所述的DNA分子機器工具包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；所述的探針包括3WJ模板、3WJ引物、primer I和primer 2 ;所述的信號轉化分子為分子信標探針；其中，端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩爾比為1:0. 5 1.5:0. 5 1.5 ;3WJ模板由3'端開始包括三部分第一部分與端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互補，第二部分與3WJ引物3'端5 Sbp的堿基互補，第三部分是用于一級擴增的模板， 包含一個核酸切口酶的識別位點；3WJ引物由3'端開始包括三部分，第一部分與3WJ模板的第二部分相互補的序列，第二部分與端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互補，第三部分與端粒酶底物的延長部分的序列相互補；端粒酶延長產(chǎn)物、3WJ模板和3WJ引物混合形成便于DNA聚合酶擴增的三元連接結構； 三元連接結構在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs的存在下啟動DNA分子機器擴增反應，產(chǎn)生一級放大產(chǎn)物；primerl和primer2是針對一級放大產(chǎn)物設計的兩個探針，端粒酶底物primerl primer2的摩爾比為I :5 10:5 10 ;primerl包括兩部分,3'端第一部分與primer2的3’端互補,其長度為5 8個bp ; 第二部分是與一級擴增產(chǎn)物相互補的序列；primer2包括兩部分,3'端第一部分與primerl的第一部分互補；第二部分是用于二級擴增的模板，其長度為15 21bp ；一級放大產(chǎn)物與primerl和primer2形成堿基堆積結構,在DNA聚合酶、核酸切口酶， dNTPs作用下觸發(fā)DNA分子機器，產(chǎn)生二級放大產(chǎn)物；分子信標探針包括一個莖環(huán)結構，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，其環(huán)狀部分序列與二級擴增產(chǎn)物的序列相互補，分子信標探針的摩爾濃度為primer2的3 6倍； 生成的二級放大產(chǎn)物與分子信標雜交形成雙鏈，破壞其穩(wěn)定的莖環(huán)結構，導致熒光基團與猝滅基團分開，產(chǎn)生熒光信號；4)待反應完成后，利用熒光儀檢測熒光信號的強度，根據(jù)熒光信號的檢測結果與細胞數(shù)量來繪制標準曲線，其中，橫坐標為細胞數(shù)量的對數(shù)，縱坐標為相對突光增強倍數(shù) (F-F0) AVF為熒光檢測強度，F(xiàn)tl為細胞數(shù)量為零時的背景熒光強度，根據(jù)標準曲線反映的線性關系來判斷待測細胞中端粒酶的活性。
5.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述的標準曲線表示為Y=A logX+B, Y表示相對熒光增強倍數(shù)(F-Ftl) /F0, X表示細胞數(shù)量，A與B由標準曲線來確定。
6.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述的端粒酶逆轉錄緩沖液包括20mM Tris-HCUl. 5mM MgCl2UmM EGTA、63mMKCl、0. 2mM dNTPs 和體積分數(shù)為O.05% 的 Tween20, pH=7. 9 ；利用端粒酶的逆轉錄活性延長端粒酶底物時，端粒酶底物濃度為150nM，反應溫度為 30oC，反應時間為60min。
7.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述的端粒酶延長產(chǎn)物、 3WJ模板和3WJ引物形成的三元連接結構后，首先在DNA聚合酶作用下由3WJ引物的3'端進行擴增，與3WJ模板的第三部分的序列形成含有核酸切口酶識別的雙鏈序列；核酸切口酶識別并切割單鏈后形成可再次被DNA聚合酶作用的缺口，從而引發(fā)擴增_置換_切割循環(huán)的DNA分子機器，產(chǎn)生一級放大產(chǎn)物；一級放大產(chǎn)物與primerl和primer2形成的堿基堆積結構，在DNA聚合酶作用下， primerl和primer2的3'端均進行擴增；primerl擴增后與primer2的第二部分形成含有核酸切口酶識別的雙鏈序列；核酸切口酶識別并切割單鏈后可再次形成被DNA聚合酶作用的缺口，從而引發(fā)擴增_置換_切割循環(huán)的DNA分子機器，形成二級放大產(chǎn)物；primer2擴增后導致一級放大產(chǎn)物被置換下來,與其他的primerl和primer2形成的新的堿基堆積結構，從而觸發(fā)多個擴增_切割循環(huán)的DNA分子機器，進一步放大檢測信號。
8.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述的DNA分子機器為由 KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶組成的DNA分子機器，其反應溫度為37度，要求的反應體系包括 IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmMMgCl2, ImM DDT，10nM3WJ 引物，10nM3WJ 模板，50nM primerl, 50nM primer2，IOOnM 分子信標探針，0· I U/μ L KF 聚合酶，O. 2U/μ LNt. BbvCI 和O.2mM dNTPs, pH=7. 9 ;反應時間為 90 120min。
9.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述的3WJ模板的第二部分的A-T比例大于75% ；所述的3WJ模板的3 ^端還被磷酸化；所述的分子信標探針其5'與3'端分別標記有熒光基團FAM和猝滅基團DABCYL。
10.如權利要求4所述的端粒酶活性檢測試方法，其特征在于，所述的端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示； primerl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； primer2核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；分子信標探針的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種端粒酶活性檢測試劑盒及其檢測方法，通過三元連接結構探針識別端粒酶產(chǎn)物，并結合三元連接結構觸發(fā)的DNA分子機器與堿基堆積觸發(fā)的DNA分子機器實現(xiàn)等溫級聯(lián)核酸擴增，將腫瘤細胞提取物中端粒酶的逆轉錄事件轉化為顯著放大的熒光檢測信號，從而精確測定痕量腫瘤細胞中端粒酶的活性，并實現(xiàn)對化學藥物抑制腫瘤細胞端粒酶活性的檢測。
文檔編號C12Q1/48GK102925546SQ20121024741
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權日2012年7月17日
發(fā)明者趙永席, 齊林, 陳鋒, 趙越, 張青 申請人:西安交通大學