專利名稱：：活性細(xì)胞分裂素合成酶基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及活性細(xì)胞分裂素合成酶基因的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及使用具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素(nucleotidecytokinin)合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的酶基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物的方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞分裂素具有多種類型的生理活性，例如促進(jìn)細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、延遲衰老或激活腋芽生長(zhǎng)，因此其是用于控制農(nóng)作物的數(shù)量生產(chǎn)率的非常重要的植物激素。作為細(xì)胞分裂素的基本結(jié)構(gòu)在腺嘌呤6位氮原子上具有含有5個(gè)碳原子的異戊二烯基。根據(jù)測(cè)鏈結(jié)構(gòu)的不同，細(xì)胞分裂素包括反式玉米素(tZ)、異戊烯基腺嘌呤(iP)等?；谝酝P(guān)于細(xì)胞分裂素-代謝系統(tǒng)的常規(guī)研究，認(rèn)為活性細(xì)胞分裂素(堿基形式(baseform))的合成是通過(guò)至少下列3個(gè)反應(yīng)步驟進(jìn)行的。首先，在細(xì)胞分裂素合成的第一反應(yīng)中，通過(guò)腺噤呤核苷酸和二曱基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)之間縮合反應(yīng)生成核苷酸型細(xì)胞分裂素。這種核苷酸形式不具有作為細(xì)胞分裂素的活性。然而，在第二反應(yīng)中，這種核苷酸形式通過(guò)去磷酸化酶的作用轉(zhuǎn)化為核苷細(xì)胞分裂素。之后，通過(guò)核苷酶的作用核苷解離，由此轉(zhuǎn)化成堿基形式的活性細(xì)胞分裂素分子(非專利文獻(xiàn)1;綜述Sakakibara，H.(2006)Cytokinins:Activity，biosynthesisandtranslocation.A醒.Rev.PlantBiol.57:431-449.)。事實(shí)上，在20世紀(jì)80年代的酶水平的研究中，已經(jīng)暗示了催化前述每種反應(yīng)的酶。在2001年鑒定了催化第一反應(yīng)(縮合反應(yīng))即核苷酸型細(xì)胞分裂素合成反應(yīng)的酶基因(IPT)(專利文獻(xiàn)1:WO2002/072818)。然而，催化由剩余2個(gè)步驟構(gòu)成的第二反應(yīng)(激活反應(yīng))的酶基因還未被鑒定。即使鑒定了這些基因的實(shí)體，為了人工調(diào)節(jié)所產(chǎn)生堿基形式的細(xì)胞分裂素的量，將核普酸形式轉(zhuǎn)化為核苷形式的步驟和將核苷形式轉(zhuǎn)化為堿基形式的步驟，這兩個(gè)步驟必須同時(shí)被修飾。因此，有必要鑒定催化這兩種反應(yīng)的酶基因，并同時(shí)調(diào)節(jié)所鑒定的酶基因。這種操作不容易。5另一方面，也可能通過(guò)調(diào)節(jié)催化細(xì)胞分裂素降解反應(yīng)的酶基因(CKX)調(diào)節(jié)活性細(xì)胞分裂素的量(非專利文獻(xiàn)2:WernerT,MotykaV，StrnadM,SchmullingT.(2001)Regulationofplantgrowthbycytokinin.ProcNatlAcadSciUSA98:10487-10492.;非專利文獻(xiàn)3:Ashikari,M.,Sakakibara，H.，■Lin，S.-Y.,Yamaraoto,T.,Takashi,T.,Nishimura,A.，Angeles,E.R.，Qian,Q.,,Kit.an6,H.andMatsuoka,M.(2005)Cytokininoxidaseregulatesricegrainproduction,Science,309:741-745.)。然另外，通過(guò)過(guò)表達(dá)IPT堿:形式的量得以提高，但這種方法也存在問(wèn)題，因?yàn)檫^(guò)表達(dá)IPT使細(xì)胞分裂素的總量極度提高，但同時(shí)植物體的形式也^皮顯著？文變(非專利文獻(xiàn)4:ZubkoE,AdamsCJ，Machaekova.I，MalbeckJ，ScollanC，MeyerP.2002.ActivationtaggingidentifiesagenefromPetuniahybridaresponsiblefortheproductionofactivecytokininsinplants.PlantJ.29:797-808.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是闡明能夠直接調(diào)節(jié)所合成的活性細(xì)胞分裂素的量的酶基因，并提供利用前述基因轉(zhuǎn)化的植物，其具有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂素的量。本發(fā)明的發(fā)明人為達(dá)到前述目的進(jìn)行了深入的研究。發(fā)明人著重于在水稻莖端分生組織中的基因表達(dá)，并且已經(jīng)分析了其結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)，已經(jīng)預(yù)期前面所提到的酶基因與賴氨酸的脫羧作用相關(guān)。然而，作為分析結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述基因不具有賴氨酸脫羧酶活性，而具有催化從核苦酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性(細(xì)胞分裂素活化反應(yīng))。而且，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)前述的酶基因能夠通過(guò)一步進(jìn)行這種細(xì)胞分裂素活化反應(yīng)，而之前認(rèn)為需要通過(guò)2步進(jìn)行?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。，即，本發(fā)明包括下列特征。(1)轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入了下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因(a)由SEQIDNO:1，3，5,7,9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苦酸序列組成的DNA所組成的基因；NO:1,3,5,7,9，11,13,15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4,6，8,10，12,14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。(2)根據(jù)上述(l)的轉(zhuǎn)化體(l),其中，所述的轉(zhuǎn)化體是轉(zhuǎn)化植物。(3)根據(jù)上述(2)的轉(zhuǎn)化體(2)，其中所述植物是植物體、植物器官、植物組織或經(jīng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞。(4)重組載體，其包含下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因(a)由SEQIDNO:1,3，5，7，9,11,13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3，5，7,9，11，13,15中任一項(xiàng)所示的核苦酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核普酸序列所組成分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNiT所:且成的基因；'、(c)編碼SEQIDNO:2，4，6,8，10,12,14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6，8，10,12，14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。(5)制備轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于，其包括將下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因或者上述(4)的重組載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，以及從所述植物細(xì)胞再生植物體(a)由SEQIDNO:1,3，5,7，9，11,13,15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11，13，157中任一項(xiàng)所示的核香酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4,6，8，10,12，14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6,8,10，12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核香酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。(6)調(diào)節(jié)植物中活性細(xì)胞分裂素的量的方法，其特征在于其包括調(diào)控下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因在植物中的表達(dá)水平(a)由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11，13，15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4，6,8，10,12,14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6，8，10，12,14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。(7)制備活性細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于其包括在添加了作為底物的核苷酸型細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(l)的轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中收集活性細(xì)胞分裂素。(8)通過(guò)在植物體中過(guò)量表達(dá)下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因改變植物特征的方法(a)由SEQIDNO:1，3，5，7,9，11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3，5，7，9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4,6，8，10,12,14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。(9)根據(jù)上述(8)的方法，其中植物特征的改變包括花莖數(shù)目的增加、形成大種子、形成厚葉脈或花序的改變。圖1為L(zhǎng)OG蛋白質(zhì)純化樣品的電泳圖(泳道l:分子量標(biāo)記；泳道2:LOG蛋白質(zhì)的純化樣品(3pg蛋白質(zhì)))。圖2A顯示各底物樣品混合物的色譜圖；圖2B,2C和2D分別顯示通過(guò)將iPRMP(2B),tZRMP(2C)和tZ(2D)用作底物與純化的LOG蛋白質(zhì)反應(yīng)所得的反應(yīng)產(chǎn)物的色語(yǔ)圖(上面僅底物；下面反應(yīng)產(chǎn)物)。圖3A顯示尸胺樣品的色譜圖；圖3(B)顯示采用L-賴氨酸作為底物與純化的LOG蛋白反應(yīng)所獲得的反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖((B)-1:僅底物；(B)-2:反應(yīng)產(chǎn)物)。圖4顯示LOG蛋白的底物特異性。(將iPRMP作為底物時(shí)所獲得的活性定義為1，在相同的條件下，各化合物與LOG蛋白反應(yīng)所得到的活性以相對(duì)值表示)圖5顯示LOG蛋白催化的從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的合成反應(yīng)式。圖6顯示通過(guò)對(duì)純化的樣品AtLOG1,2,3,4，5，7和8蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳所獲得的結(jié)果(最左泳道分子量標(biāo)記；每條泳道在分子量31kDa附近所觀察到的帶都是AtLOG蛋白衍生的帶)。圖7顯示AtLOGl,2，3,4，5,7和8蛋白的底物特異性。(將iPRMP作為底物時(shí)所獲得的活性定義為100%,在相同條件下，各化合物與前述各蛋白質(zhì)反應(yīng)所獲得的活性以相對(duì)值表示。誤差條顯示基于在相同條件下進(jìn)行3次操作所獲得的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差)圖8顯示在35S::AtLOG4和35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體中AtLOG4和7基因的半定量RT-PCR分析結(jié)果。圖9顯示在35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體中所觀察到的蓮座葉(rosetteleaves)的異常。在立體顯微鏡下觀察，在萌芽后1.5個(gè)月時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體(譜系#6;Tl代)的蓮座葉(標(biāo)尺lmm)圖IO顯示在35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體中所觀察到的蓮座葉的異常。將在萌芽后1.5個(gè)月時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體(譜系#26;Tl代)的蓮座葉進(jìn)行脫色并使用70%乙醇固定，接著在立體顯微鏡下進(jìn)行觀察。(標(biāo)尺左0.5cm;右2mm)。圖11顯示35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體的維管束的畸形。將在萌芽后1個(gè)月時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體(譜系#26;T2代)進(jìn)行脫色并使用70%乙醇固定，接著使用Technovit樹(shù)脂固定，隨后使用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，以便產(chǎn)生橫斷切片。使用曱苯胺藍(lán)對(duì)橫斷切片進(jìn)行染色，接著在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。在暗視野下變成白色的部分表示維管(標(biāo)尺50|im)。圖12顯示35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體葉子老化的延遲。使用在萌芽后70天時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體(譜系#6;Tl代)的蓮座葉沐尺lcm)。圖13顯示促進(jìn)35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體側(cè)芽的形成。在立體顯微鏡下觀察在萌芽后3星期時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體(譜系#13;T2代)的于地面之上部分。(箭頭長(zhǎng)花莖；三角發(fā)育的側(cè)芽；標(biāo)尺1mm)。圖14顯示35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體花序的異常。觀察在萌芽后3周時(shí)的野生型植物和35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體(譜系#6;Tl代)的花序(標(biāo)尺1cm)。圖15顯示35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體種子大小的增加。在立體顯微鏡下觀察野生型植物和35S::AtLOG4轉(zhuǎn)化體(譜系#26;T2代)的種子(標(biāo)尺左1cm;右0.2mm)。圖16顯示35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體種子重量的增加。測(cè)量來(lái)自野生型植物和35S::AtLOG7轉(zhuǎn)化體(譜系#6;T2代)的各100顆種子的10重量，計(jì)算每個(gè)顆粒的重量。誤差條表示基于3種不同類型的種子集合所獲得的結(jié)果而計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差。本申請(qǐng)要求2006年9月4日提交的日本專利申請(qǐng)No.2006-238691的優(yōu)先權(quán)；通過(guò)參照將其描述的公開(kāi)內(nèi)容并入本文。下面詳細(xì)描述本發(fā)明。(1)活性細(xì)胞分裂素合成酶基因分裂素的反應(yīng)的活性的酶蛋白的基因^的應(yīng)用。、'上述編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的酶蛋白的基因(以下稱作"LOG基因，，)是由具有如SEQIDNO:1所示的核普酸序列的DNA組成的基因，或者編碼SEQIDNO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因。LOG基因的序列信息在國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已有報(bào)道(索取號(hào)AK071695)(核苷酸)；BAD52880(蛋白質(zhì))；Tigr位置(locus):LOC—Os01g40630;RAP位置Os01g0588900)。由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)具有賴氨酸脫羧酶的功能。然而，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，由于LOG基因是在位于水稻莖端分生組織尖端、稱作干細(xì)胞的未分化細(xì)胞群及其周邊組織所表達(dá)的，因此其可能與水稻莖端分生組織的維持相關(guān)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人分析了該基因的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前述的基因不具有賴氨酸脫羧酶活性，而具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。在本發(fā)明中所使用的LOG基因可以是編碼下述蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列組成，只要其保持催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性即可。可以被缺失、替代或添加的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選是1~多個(gè)。例如，可以從SEQIDNO:2中所示氨基酸序列缺失1~10個(gè)，并優(yōu)選1~5個(gè)氨基酸；可以向SEQIDNO:2中所示氨基酸序列添加1~10個(gè)，并優(yōu)選15個(gè)氨基酸；或者SEQIDNO:2中所示氨基酸序列中110個(gè)，并優(yōu)選1~5個(gè)氨基酸可以被其他氨基酸替代。另外，本發(fā)明中所使用的LOG基因可以是編碼下述蛋白質(zhì)的基.gov)預(yù)測(cè),本發(fā)明的基因所編碼的、由242ii因，該蛋白質(zhì)由與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列具有80%或更高同源性的氨基酸序列組成、且具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。前述80%或更高同源性優(yōu)選指90%或更高的同源性，更優(yōu)選指95%或更高的同源性。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性"是指"催化從核苦酸型細(xì)胞分裂素除去5，-單磷酸并合成堿基形式的活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性"。在本發(fā)明中，"核苷酸型細(xì)胞分裂素"包括異戊烯基腺嘌呤核苷5，-單磷酸(iPRMP)、反式玉米素核苷5'-單磷酸(tZRMP)、二氫玉米素核苷5'-單磷酸(DZRMP)和順式玉米素核苷5'-單磷酸(cZRMP)。另一方面，"活性細(xì)胞分裂素"包括從上述各核苷酸型細(xì)胞分裂素除去5，-單磷酸而產(chǎn)生的、N氣(a-2-異戊烯基)腺嘌呤(iP)、反式玉米素(tZ)、二氬玉米素(DZ)和順式玉米素(cZ)。用語(yǔ)"具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性"用于表示前述活性基本上與具有SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的活性等價(jià)。本發(fā)明的LOG基因也可以是編碼與SEQIDNO:1所示的核苷酸裂素的反交、且編應(yīng)活性的蛋白質(zhì)的基因。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"是指形成特異性雜交但不形成非特異性雜交的條件。這些嚴(yán)格條件的例子包括由與SEQIDNO:1中所示核苷酸序列高度同源的核酸(即表現(xiàn)出80%或更高，優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高同源性)組成的DNA的互補(bǔ)鏈雜交，與具有低于前述水平同源性的核酸不雜交的條件。更具體的條件有鈉鹽濃度為15mM750mM,優(yōu)選50mM~750mM,更優(yōu)選300mM750mM;溫度為25。C70。C,優(yōu)選50。C70。C，更優(yōu)選55。C65。C;曱酰胺濃度為0%~50%,優(yōu)選20%~50%,更優(yōu)選35%45%。而且，在更嚴(yán)格的條件下，例如在雜交后清洗過(guò)濾器的條件，鈉鹽的濃度為15mM600mM,優(yōu)選50mM600mM,更優(yōu)選300mM600mM，溫度為50。C70。C,優(yōu)選55。C70。C,更優(yōu)選60。C65°C?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以核酸片段的形式獲得本發(fā)明中所使用的LOG基因，其中所述PCR擴(kuò)增使用基于SEQIDNO:1或2中所示序列設(shè)計(jì)的引物，用來(lái)自cDNA文庫(kù)、基因組DNA文庫(kù)等的核酸作為模板。還可以通過(guò)進(jìn)行雜交以核酸片段的形式獲得LOG基因，其中所述雜交使用來(lái)自前述文庫(kù)等的核酸作為模板，用LOG基因的一部分的DNA片段作為探針。另外，還可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的各種核酸序列合成方法，例如化學(xué)合成方法以核酸片段的形式合成LOG基因?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)修飾前述編碼蛋白質(zhì)的基因來(lái)進(jìn)行前述氨基酸的缺失、添加和替代。通過(guò)常規(guī)技術(shù)，例如Kunkel法或Gappedduplex法或通過(guò)與其等價(jià)的技術(shù)向基因引入突變。例如，使用利用定點(diǎn)誘變的誘變?cè)噭┖?例如Mutant-K(TAKARA制)或Mutant畫G(TAKARA制))或TakaraLAPCR體外誘變系列試劑盒引入突變?？梢杂糜诒景l(fā)明的LOG基因還包括下面幾組被認(rèn)為與前述LOG基因(索取號(hào)AK071695)屬于相同的基因家族的基因。這些基因也包括在本發(fā)明的LOG基因中。擬南齊(^4raZ^V/o戸/51//^/^wa)AGI編號(hào)Nuc索取號(hào)Atlg50575NM一103939At2g28305NM」28389At2g35990NM—129158At2g37210NNL129277At3g53450NM—115205At5g03270NM一120405At5g06300NM—120713At5gl1950NM—203039At4g35190畫—119685At5g26140NM一122515牙舀fOyzasa"vaJ(7K牙舀)tigr位置NUC索取號(hào)L0CJ)s01g40630AP003243L0C—Os01g51210AP003273蛋白質(zhì)索取號(hào)BAD52880NP一91657213L0CJ)s02g41770AP005000XP__473199L0CJ)s03g018.80XM—468563XP—_468563LOC_Os03g49050AC123974XP——469379L0C一0s03g64070AC096690XP__47Q489LOC—0s04g43840AL731629XP——473199LOC一Os05g51390AC136216XP_陽(yáng)476015LOC—0s05g46360AC104713XP_.475809L0C_Os09g3754OAP005862BAD46468LOC—0sl0g33900AC037425NP一—922006LOC—Os03g39010AC133003AAT76323在前述組基因中，7個(gè)基因,即At2g28305，At2g35990,At2g37210,At3g53450，At4g35190,At5g06300和At5gl1950是編碼與前述稻(OyzflM"va)LOG蛋白具有高度同源性的氨基酸序列的、擬南芥LOG同源基因(其分別被稱作AtLOG1，2,3，4,5，7和8)。正如在后面實(shí)施例中所示的、與前述稻("Oyza^"vaJLOG蛋白一樣，這些擬南芥LOG同源基因具有催化從核普酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。而且在過(guò)表達(dá)前述基因的植物中，觀察到了由于所合成的活性細(xì)胞分裂素的量提高而引起的植物特征的變化，例如促進(jìn)側(cè)芽延伸。AtLOG1,2,3,4,5，7和8基因的核普酸序列分別示于SEQIDNO:3,5,7，9,11,13和15中。其編碼分別示于SEQIDNO:4,6，8,10,12,14和16中的氨基酸序列。另夕卜，這些擬南芥LOG同源基因還可以是突變基因，只要它們具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性即可。序列同源性的范圍，以及所缺失、替代或添加的氨基酸數(shù)目的范圍如上所述。(2)植物轉(zhuǎn)化中所使用的重組載體用于植物轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的重組載體可以通過(guò)將前述LOG基因引入適當(dāng)?shù)妮d體構(gòu)建。例如，優(yōu)選能夠通過(guò)農(nóng)桿菌將靶基因引入到植物中的pBI，pPZP和pSMA載體。pBI雙元載體或中間載體是特別優(yōu)選的，例如pBI121，pBI101，pBI101.2和pBI101.3等。雙元載體是能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制的穿梭載體。當(dāng)將含有雙元載體的農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，在載體上夾在由LB序列和RB序列構(gòu)成的邊界序列14之間的DNA可以被摻入到植物細(xì)胞核DNA中。pUC載體能夠直接將基因引入到植物中。其例子包括pUC18,pUC19和pUC9載體。也可以使用植物病毒載體，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)、菜豆金花葉病毒(BGMV)和煙草花葉病毒(TMV)載體。當(dāng)使用雙元載體質(zhì)粒時(shí)，靶基因被插入到雙元載體的邊界序列(LR和RB序列)之間，接著在大腸桿菌中擴(kuò)增該重組載體。隨后，通過(guò)電穿孔或其他手段將所擴(kuò)增的重組載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌(力graki["m'謂咖e/編'冊(cè))C58，LBA4404，EHA101,EHA105,發(fā)根農(nóng)桿菌(」gn6a"en'cw2r/^zogew^)LBA1334等中，并將前述農(nóng)桿菌用于植物的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了將靶基因插入到載體中，首先將純化的DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈?，并將切割片段插入到適當(dāng)載體DNA的限制性位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)，將其連接到載體上。需將靶基因以可發(fā)揮其基因功能的形式插入到載體中。因此，在載體中可以在耙基因的上游、內(nèi)部或下游位點(diǎn)被連接啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、對(duì)于使用雙元載體必要的復(fù)制起點(diǎn)(來(lái)自Ti或Ri質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)等)、選擇性標(biāo)記基因等。"啟動(dòng)子"可能并非來(lái)自植物，只要其是能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用，并且能夠在特定的植物組織或特定的生長(zhǎng)階段誘導(dǎo)表達(dá)的DNA即可。其具體的例子包括水稻LOG基因自身的啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、胭脂^威合成酶基因啟動(dòng)子(Pnos)、玉米遍在蛋白啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及煙草PR蛋白質(zhì)啟動(dòng)子。作為增強(qiáng)子，例如用于提高靶基因表達(dá)效率的、包含CaMV35S啟動(dòng)子中的上游側(cè)序列的增強(qiáng)子區(qū)域等?？梢允褂萌魏谓K止子，只要其能夠終止啟動(dòng)子所轉(zhuǎn)錄的基因的轉(zhuǎn)錄。例如胭脂堿合成酶(NOS)基因終止子、章魚堿合酶(OCS)基因終止子以及CaMV35SRNA基因終止子。選擇性標(biāo)記基因的例子包括氨千青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、除草肽(bialaphos)抗性基因以及二氫葉酸還原酶基因。選擇性標(biāo)記基因和把基因可以連接到相同的質(zhì)粒以制備重組載體?？蛇x擇地，分別制備將選擇性標(biāo)記基因連接到質(zhì)粒而獲得的重組載體，以及將靶基因連接到質(zhì)粒而獲得的重組載體。當(dāng)分別制備重組載體時(shí)，將兩種載體共轉(zhuǎn)染到宿主內(nèi)。(3)轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法可以通過(guò)將前述基因或重組載體引入到靶植物中制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。術(shù)語(yǔ)"基因...導(dǎo)入"在本發(fā)明中指應(yīng)用，例如已知的基因工程技術(shù)，將靶基因以可表達(dá)的形式導(dǎo)入到前述宿主植物的細(xì)胞中。所引入的基因可以摻入到宿主才直物的基因組DNA中，也可以以包含在外源載體中的形式存在。適當(dāng)?shù)?，可以使用多種已報(bào)道和已建立的方法將前述基因或重組載體引入到植物中。這些方法的例子包括農(nóng)桿菌法、PEG-磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、微粒槍法以及微注射法等。農(nóng)桿菌法可以采用原生質(zhì)體、組織切片或植物體本身(inplanta法)。當(dāng)采用原生質(zhì)體時(shí)，將原生質(zhì)體連同具有Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒(分別為根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌所具有)的農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，或者將其與原生質(zhì)球化的農(nóng)桿菌融合(原生質(zhì)球法)。當(dāng)采用組織切片時(shí)，用農(nóng)桿菌感染對(duì)象植物的無(wú)菌培養(yǎng)葉片(葉盤)或胼胝體(callus)(未分化的培養(yǎng)細(xì)胞)。在采用利用種子或植物的inplanta法(即不是通過(guò)加入植物激素的組織培養(yǎng)而進(jìn)行的方法)時(shí)，農(nóng)桿菌可以被直接應(yīng)用于吸水種子、新生幼苗(秧苗)、盆栽植物等中?？梢愿鶕?jù)通用的教科書例如"Newedition,Experimentalprotocolsofmodelplants,Fromgeneticengineeringtogenomeanalysis(2001)，editedbyIsaoShimamoto&KiyotakaOkada，Shujunsha的描述進(jìn)行這些植物轉(zhuǎn)化方法?？梢酝ㄟ^(guò)PCR、Southern雜交、Northern雜交、Western印跡或其他方法確認(rèn)是否基因已經(jīng)摻入到植物中。例如，從轉(zhuǎn)基因植物制備DNA，設(shè)計(jì)LOG基因-特異性引物，接著進(jìn)行PCR。在進(jìn)行PCR之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳，并使用溴化乙錠、SYBRGreen溶液等進(jìn)行染色，由此4全測(cè)作為擴(kuò)增產(chǎn)物的帶，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化。可選擇地，可以使用預(yù)先經(jīng)熒光染料等標(biāo)記的引物的PCR檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。另夕卜，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到固相，例如微孔板上，以通過(guò)熒光或酶反應(yīng)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，從植物細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，通過(guò)二維電泳對(duì)其進(jìn)行分級(jí)。通過(guò)檢測(cè)LOG基因編碼的蛋白質(zhì)帶，以確認(rèn)被引入到植物細(xì)胞中的LOG基因已經(jīng)得到表達(dá)，即植物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。接著，通過(guò)Edman降解等確定所檢測(cè)蛋白質(zhì)N-末端的氨基酸序列。之后，確認(rèn)是否所測(cè)定的氨基酸序列與SEQIDNO:2N-末端的序列相同，這樣進(jìn)一步證明了植物細(xì)月包的轉(zhuǎn)化?？蛇x擇地，將多種報(bào)告基因，例如(3-葡糖苷酸酶(GUS)、熒光素酶(LUC)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)或p-半乳糖苷酶(LacZ)連接到靶基因的下游區(qū)以制備載體。將已導(dǎo)入了上述載體的農(nóng)桿菌以與上述相同的方式轉(zhuǎn)化植物，并檢驗(yàn)報(bào)告基因的表達(dá)。由此可以確認(rèn)基因摻入植物中。在本發(fā)明中，可以使用單子葉植物或者雙子葉植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這類才直物的例子包括術(shù)語(yǔ)下列的十字花科(Bra^/cace"e)(例如擬南芥f^ra脇o拜、^a"朋a，、甘藍(lán)或油菜籽)、禾本科(O扁z."eae)(例如水稻、玉米、大麥或小麥)、茄科(So/"mzceae)(例如番茄、茄子、馬鈴薯或煙草)以及豆科(Z^gwm!'wosae)(例如大豆、豌豆或矮菜豆(bushbean),但不限于此。在本發(fā)明中，待轉(zhuǎn)化的植物材料的例子包括植物器官，例如莖、葉、種子、胚、胚珠、子房或莖尖；植物組織例如花粉嚢或花粉或其切片；未分化的胼胝體；以及培養(yǎng)的植物細(xì)胞，例如從未分化的胼胝體通過(guò)酶處理除去細(xì)胞壁而制備的原生質(zhì)體。當(dāng)采用inplanta法時(shí)，還可以使用吸水種子或整個(gè)植物體。本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因植物"的是指整個(gè)植物體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根或種子)、植物組織(例如表皮、韌皮部、軟組織、木質(zhì)部或維管束)以及培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如胼胝體)的任一種。在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的植物細(xì)胞時(shí)，為了從所獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體，可以通過(guò)傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)技術(shù)從所獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生器官或者個(gè)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)已知作為從植物細(xì)胞再生植物的公知方法容易地進(jìn)行。例如，可以下面的方式從植物細(xì)胞再生植物。首先，在將植物組織或原生質(zhì)體用作進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物材料時(shí)，它們可以培養(yǎng)在經(jīng)滅菌并加入例如無(wú)機(jī)元素、維生素、>碳源、作為能源的糖或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(植物激素例如苗長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯或油菜素類固醇)的形成胼胝體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并使17得形成無(wú)限增殖的去分化胼胝體(后面，該過(guò)程被稱作"驕胝體誘導(dǎo)")。將這樣所形成的胼胝體轉(zhuǎn)移到含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑例如茁長(zhǎng)素的新培養(yǎng)基中，進(jìn)一步增殖(傳代培養(yǎng))。在固體培養(yǎng)基例如瓊脂上進(jìn)行胼胝體誘導(dǎo)，并在例如液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。這能夠有效并大量進(jìn)行兩種培養(yǎng)。之后，在適于誘導(dǎo)器官再分化的適當(dāng)條件下通過(guò)前述傳代培養(yǎng)使得胼胝體增殖(后面稱作"誘導(dǎo)再分化")，并且最終再生完整的植物。再分化誘導(dǎo)可以通過(guò)適當(dāng)確定培養(yǎng)基中茁長(zhǎng)素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源等各種成分的種類和量和、光線、溫度和其他條件進(jìn)行。這種誘導(dǎo)再分化導(dǎo)致形成不定胚、不定根、不定芽以及不定莖葉等，這可以導(dǎo)致生長(zhǎng)成完整的植物。作為選擇，保存它們變成完整的植物之前的適合的狀態(tài)(例如封裝人造種子、干胚或凍干細(xì)胞和組織等)。性繁殖或無(wú)性繁殖而獲得的后代植物體，以及后代植物的部分組織或器官(種子、原生質(zhì)體等)?？梢杂蓪?dǎo)入了LOG基因的轉(zhuǎn)基因植體的種子或原生質(zhì)體等繁殖材料進(jìn)行栽培并培養(yǎng)量化生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。在所獲得的轉(zhuǎn)基因植物中，活性細(xì)胞分裂素的量由于LOG基因的表達(dá)而局部或系統(tǒng)性提高。結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因植物中，觀察到了由于細(xì)胞分裂素的作用所導(dǎo)致的側(cè)芽延長(zhǎng)的促進(jìn)(抑制頂端優(yōu)勢(shì))、促進(jìn)種子萌發(fā)、打破休眠、促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)葉綠素合成、防老化、促進(jìn)果實(shí)增大、柄節(jié)數(shù)目的增加、大種子的形成、厚葉脈的形成、葉子老化的延遲、花序的改變等。而且，由目前的研究結(jié)果已知LOG基因在莖端分生組織的有限區(qū)域中表達(dá)，LOG基因破壞抹中水稻顆粒數(shù)目顯著降低，花分化階段的莖端分生組織中細(xì)胞分裂素的含量與谷類粒數(shù)目之間存在關(guān)聯(lián)。因此，可期待，例如LOG基因在莖端分生組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)化水稻中谷粒的數(shù)目得到提高。而且，植物體中LOG基因的表達(dá)水平可使用啟動(dòng)子例如LOG啟動(dòng)子、細(xì)胞分裂素氧化酶2(OsCKX2)啟動(dòng)子或者衰老相關(guān)基因(SAG)啟動(dòng)子局部地或系統(tǒng)性調(diào)節(jié)(促進(jìn)或抑制)，由此可以調(diào)節(jié)植物中活性細(xì)胞分裂素的量。結(jié)果，可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞分裂素相關(guān)的多種植物生長(zhǎng)和生理活動(dòng)，例如谷粒的數(shù)目、側(cè)芽(腋芽)的形成和延長(zhǎng)、老化、休眠、落果、細(xì)胞周期、光合作用量或蒸騰作用。(4)制備酶蛋白可以通過(guò)使用導(dǎo)入了前述LOG基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，接著從培養(yǎng)物中獲得前述LOG基因編碼的蛋白質(zhì)。本文中使用的"培養(yǎng)物，，是指培養(yǎng)上清、培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞群以及所培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞群的破碎產(chǎn)物的任何一種。這里，可以使用任何類型的重組載體，只要其能夠在宿主中復(fù)制即可。所述重組載體的例子包括質(zhì)粒DNA和噬菌體DNA。所述質(zhì)粒DNA的例子包括來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322,pBR325，pUC118，pUC119,pUC18,pUC19，pBluescript等)、來(lái)自枯草芽孢桿菌(5鎖.〃附"Mto)的質(zhì)粒(例如pUB110,pTP5等)以及來(lái)自酵母的質(zhì)粒(例如YEpl3,Yep24,YCp50等)。噬菌體DNA的例子包括i嗟菌體(例如Charon4A,Charon21A，EMBL3,EMBL4，人gtlO,Xgtll,人ZAP等)。進(jìn)一步地，還可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒和牛痘病毒之類的動(dòng)物病毒載體，以及昆蟲(chóng)病毒載體，例如桿狀病毒。前述載體可以包含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子以及選擇性標(biāo)記物。如果必要，載體還可以包含增強(qiáng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多聚腺苷酸信號(hào)等。作為復(fù)制起點(diǎn)，例如可以在大腸桿菌載體中使用來(lái)自ColEl、R因子或F因子的復(fù)制起點(diǎn)。例如，可以在酵母載體中來(lái)自2iamDNA或ARS1的復(fù)制起點(diǎn)。例如可以在動(dòng)物載體中使用來(lái)自SV40或腺病毒的復(fù)制起點(diǎn)。作為啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、cspA啟動(dòng)子等可以用于大腸桿菌載體中。gall啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子等可以用于酵母載體中。SRoc啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子等可以用于動(dòng)物細(xì)胞的載體。作為選擇性標(biāo)記，卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等可以用于大腸桿菌載體中。Leu2、Trpl或Ura3基因等可以用于酵母載體中。新霉素抗性基因，胸苷激酶基因、二氫葉酸還原酶基因等可以用于動(dòng)物細(xì)胞載體中。作為宿主，可以使用原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。這類原核細(xì)胞的例子19包括屬于埃希氏菌屬例如大腸桿菌，芽孢桿菌屬，例如枯草桿菌，以及假單胞菌屬，例如惡臭假單胞菌(尸"w^mo"w;w"^)。另一方面，真核細(xì)月包的例子包4舌酵母，例如p卑酒酵母(iSaccAaram;;cMce^v/w'ae)或裂殖酵母(5W^cwzcc/^n附);cespcw6e);動(dòng)物纟田胞，例如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Vero或C123細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如Sf9或SF12。通過(guò)在宿主培養(yǎng)中通常采用的方法培養(yǎng)前述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。作為培養(yǎng)從微生物宿主例如大腸桿菌或酵母所獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用天然或合成培養(yǎng)基，只要其含有能被微生物體吸收的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，并且能夠有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物即可。碳源的例子包括糖類，例如葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉；有機(jī)酸，例如醋酸和丙酸；以及醇類，例如乙醇和丙醇。氮源的例子包括氨；無(wú)才幾酸或有才幾酸的銨鹽，例如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨；其他含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；以及玉米漿。無(wú)機(jī)物質(zhì)的例子包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣。通常在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，例如于25。C35。C下進(jìn)行約12~48小時(shí)。使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等調(diào)節(jié)pH。如果必要，在培養(yǎng)過(guò)程中，可以向培養(yǎng)基中加入抗生素，例如氨芐青霉素或四環(huán)素。如果耙蛋白是在相關(guān)的細(xì)胞群或細(xì)胞中產(chǎn)生的，則通過(guò)超聲處理、重復(fù)凍融循環(huán)或使用勻漿器處理破碎所培養(yǎng)的微生物體或細(xì)胞而提取靶蛋白質(zhì)。如果靶蛋白被分泌到微生物體或細(xì)胞外，則可以使用該培養(yǎng)液本身，或者通過(guò)離心或其他程序除去微生物體或細(xì)胞。之后，獨(dú)立地或者以適當(dāng)?shù)亟M合應(yīng)用傳統(tǒng)的分離/純化蛋白質(zhì)的生化技術(shù)，例如硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析或親和層析從上述培養(yǎng)物產(chǎn)品中分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)。(5)活性細(xì)胞分裂素的合成在本發(fā)明中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)含有前述LOG基因的重組載體轉(zhuǎn)化而獲得的轉(zhuǎn)化體時(shí)，向培養(yǎng)基中加入核苷酸型細(xì)胞分裂素作為底物，以在培養(yǎng)物中合成活性細(xì)胞分裂素。用作底物的核普酸型細(xì)胞分裂素如上所述。此外，使用具有高增殖能力的轉(zhuǎn)化體可提供每單位培養(yǎng)物溶液和每單位時(shí)間更高的活性細(xì)胞分裂素產(chǎn)量。因此，優(yōu)選首先通過(guò)預(yù)培養(yǎng)20激活轉(zhuǎn)化體，接著將其接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行用于生產(chǎn)活性細(xì)胞分裂素的主要培養(yǎng)(mainculture)。預(yù)培養(yǎng)以及主要培養(yǎng)用培養(yǎng)基中底物的含量以培養(yǎng)基中固形物換算，為大約0.1%~1.0%。例如，在其中接種細(xì)胞群時(shí)，在培養(yǎng)基中所使用的轉(zhuǎn)化體的量可以大約是每1L培養(yǎng)基大約1100mg。如果適合，根據(jù)底物的含量，轉(zhuǎn)化體的量可以提高或降低。這類底物可以在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)一次性加入，也可以在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)或間歇地加入。此外，可以在完成培養(yǎng)后一次性收集再生的活性細(xì)胞分裂素，也可以在培養(yǎng)的過(guò)程中連續(xù)或間歇地收集。當(dāng)培養(yǎng)物溶液中所產(chǎn)生的期望活性細(xì)胞分裂素的量達(dá)到最大值時(shí)，終止培養(yǎng)。在完成培養(yǎng)后，根據(jù)公知方法純化培養(yǎng)物溶液中所包含的活性細(xì)胞分裂素?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的^^知手段進(jìn)行純化，例如過(guò)濾、離心、離子交換或吸附層析或溶劑萃取。必要時(shí)這些操作可以適當(dāng)組合。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式通過(guò)下述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的描述。但這些實(shí)施例并非旨在限制本發(fā)明的范圍。(實(shí)施例l)在大腸桿菌中大量表達(dá)重組LOG蛋白并純化預(yù)計(jì)LOG基因(索取號(hào)AK071695(核普酸)；BAD52880(蛋白質(zhì))；Tigr位置(locus):LOC—Os01g40630;RAP位置Os01g0588900)編碼由242個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，并且通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)0lttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)具有賴氨酸脫羧酶的功能。然而，顯示與LOG基因具有同源性的基因，在束紅球菌(i^odococa^/"5^'ew)的fas^f立置或者在發(fā)才艮農(nóng)4干菌(^gro^a"en'owW^'zogewe5^的Ri質(zhì)粒上，位于非?？拷呋?xì)胞分裂素生物合成的起始反應(yīng)的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)的位置。因此，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以分析LOG蛋白的功臺(tái)匕首先，將LOG基因cDNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域插入到pCOLD-I(TaKaRa)(—種在大腸桿菌中使用的His-標(biāo)簽蛋白質(zhì)表達(dá)載體)，以構(gòu)建質(zhì)粒(pCOLD-LOG)。之后，使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡.co")BL21(DE3)[pG-Tf2]，再將其涂布于含有50(ig/ml氨千青霉素和20|ug/ml氯霉素的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基上，以獲得轉(zhuǎn)化的大腸桿菌集落。將該大腸桿菌集落在含有50pg/ml氨節(jié)青霉素和20pg/ml氯霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基中于37。C下培養(yǎng)過(guò)夜。之后，將30ml過(guò)夜培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物溶液加入到270ml含有100pg/ml氨芐青霉素、20|ag/ml氯霉素和1ng/ml四環(huán)素的改良M9培養(yǎng)基(M9鹽，1M山梨醇，1%酪蛋白水解物、2%蔗糖、lmMMgS04、0.1mMCaCl2、10fig/mL硫胺素-HCl和2.5mM甜菜堿)中，接著在37。C下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，直到OD600達(dá)到約0.5。將液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15。C水浴中，靜置30分鐘。之后，以0.5mM終濃度加入1MIPTG到培養(yǎng)基中，并接著將所獲得的混合物進(jìn)一步在15。C下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)25小時(shí)。之后，通過(guò)離心回收大腸桿菌細(xì)胞。通過(guò)下列方法從大腸桿菌提取蛋白質(zhì)，通過(guò)鎳NTA頂流(superflow)樹(shù)脂純化LOG蛋白。首先，將大腸桿菌沉淀懸浮在6ml裂解緩沖液[50mMNaHP04,300mMNaCl，10mM咪唑，1mMMgCl2，0.5mM二硫蘇糖醇(DTT),pH8.0]中。之后，將60jal蛋白酶抑制劑混合物(XIOO,Sigma)和6mg氯化溶菌酶加入到懸浮液中，于水上靜置30分鐘。其后將大腸桿菌細(xì)胞用超聲粉碎器(TIETECHCo.,Ltd.)進(jìn)行破碎。破碎條件為微芯片20秒x8次，工作循環(huán)(dutycycle)為50%,輸出為5。將經(jīng)破碎的溶液在4。C下30,000g離心50分鐘。將上清液通過(guò)由預(yù)先已經(jīng)裂解緩沖液(柱體積1ml)平衡的鎳NTA頂流樹(shù)脂(Qiagen)形成的柱。再使用20ml清洗緩沖液[50mMNaHP04,300mMNaCl，20mM咪唑，lmMMgCl2，0.5mMDTT,15%(w/v)甘油，pH8.0]清洗柱子2次，并使用洗脫緩沖液[50mMNaHP04,300mMNaCl，250mM咪哇，lmMMgCl2,0.5mMDTT，15%(w/v)甘油，pH8.0]洗脫His-標(biāo)簽LOG蛋白。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺電泳確認(rèn)最終純化的樣品的純度(圖1)，將該樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。(實(shí)施例2)4全測(cè)重組LOG蛋白的酶活性將實(shí)施例1中獲得的3(ig重組LOG蛋白與用作底物的各種類型的細(xì)胞分裂素進(jìn)行反應(yīng)。使用下列8類細(xì)胞分裂素底物N、(5-2-異戊烯基)腺嘌呤(iP)、反式玉米素(tZ)、順式玉米素(cZ)、iP核苷(iPR)、tZ核苷(tZR)、cZ核苷(cZR)、iPR5，-單磷酸(iPRMP)和tZR5，-單磷酸(tZRMP)。反應(yīng)條件為，將lOOpl含有50mMTris-HCl、1mMMgCl222和50(iM底物，pH7的反應(yīng)溶液在30。C下孵育2小時(shí)。之后，將1020%醋酸加入到反應(yīng)溶液中終止反應(yīng)，接著在室溫下以15,000rpm將反應(yīng)溶液離心20分鐘。再利用HPLC(WatersAlliance2695/PDA探測(cè)器2996)通過(guò)液相色譜對(duì)20(il上清液進(jìn)行分析。使用SymmetryC18,3.5iam,2.1x100mm筒(Waters)柱。使用溶劑C(100%乙腈)和溶劑D(2。/。醋酸)進(jìn)行洗脫。洗脫條件和溶劑濃度梯度程序如表1所示。表l時(shí)間(分鐘)流速(ml/分鐘)Aft)BOt)c(wD04)曲線0.25001的i0.2500199630.25007936.90.250010906250.250040606260.250060柏6320.250060406330.25001的6400.25001996根據(jù)270nm的吸收監(jiān)控底物和反應(yīng)產(chǎn)物。分析的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用iP,tZ,cZ，iPR，tZR或cZR作為底物時(shí)，沒(méi)有觀察到與底物的反應(yīng)性，但使用iPRMP或tZRMP作為底物時(shí)，各底物均完全分別轉(zhuǎn)化成iP或tZ。圖2顯示各底物樣品混合物的色譜圖，以及在使用tZ,iPRMP或tZRMP作為底物時(shí)獲得的反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖。在使用iP,cZ，iPR，tZR或cZR作為底物時(shí)所獲得的結(jié)果與使用tZ時(shí)獲得的結(jié)果相同。因此，省略了這些結(jié)果。(實(shí)施例3)L0G蛋白對(duì)賴氨酸的反應(yīng)性之前預(yù)計(jì)LOG蛋白為賴氨酸脫羧酶。因此，檢測(cè)了其對(duì)賴氨酸的反應(yīng)性。在40。C下，將3(ig重組LOG蛋白于100|il，pH6.0的由500mM醋酸鈉緩沖液和5mML-賴氨酸構(gòu)成的反應(yīng)溶液中溫育60分鐘。之后，將34|il20%三氯醋酸加入到反應(yīng)溶液中，并10,000g離心20分鐘。再將lOOial上清液用于苯甲?；?。具體的操作如下所述。將100ial的2NNaOH加入到100nl反應(yīng)溶液中，并進(jìn)一步向其加入0.5)il苯甲酰氯。在室溫下靜置20分鐘。之后，將200^d飽和NaCl溶液和200fil二乙醚加入到反應(yīng)溶液中，將所獲得的混合物攪拌、離心，回收上清。將其減壓干燥后溶解在100pl甲醇中，接下來(lái)利用23HPLC(WatersAlliance2695/PDA探測(cè)器2996)通過(guò)液相色鐠進(jìn)行分析。使用SymmetryCI8，3.5(im，2.1x100mm筒(Waters)柱。使用溶劑A(MilliQ水)和溶劑B(100%曱醇)進(jìn)行洗脫。洗脫條件和溶劑濃度梯度程序如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>根據(jù)226nm的吸收監(jiān)控底物和反應(yīng)產(chǎn)物。由賴氨酸脫羧酶產(chǎn)生的純化的物質(zhì)估計(jì)為尸胺。因此，分別注射1nmol尸胺樣品，并確定反應(yīng)產(chǎn)物的洗脫時(shí)間。如圖3所示，LOG蛋白未顯示出對(duì)賴氨酸的反應(yīng)性。因此，確定LOG蛋白不具有賴氨酸脫羧酶的功能，這與基于數(shù)據(jù)庫(kù)的估計(jì)是不同的。(實(shí)施例4)針對(duì)核苷酸型細(xì)胞分裂素的底物特異性有無(wú)的分析分析LOG蛋白對(duì)核苷酸型細(xì)胞分裂素形式的反應(yīng)特異性。同時(shí)，還分析了對(duì)AMP有無(wú)反應(yīng)性。使用下列7類底物iPRMP、tZRMP、二氫玉米素核苷5，-單磷酸(DZRMP)、cZR5，-單磷酸(cZRMP)、iPR5，-二磷酸(iPRDP)、iPR5，-三磷酸(iPRTP)和AMP。反應(yīng)條件如下將0.02貼LOG蛋白用于單次反應(yīng)，在200pl含有50mMTris-HCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH6.5的反應(yīng)溶液中，與100^M底物反應(yīng)。在開(kāi)始反應(yīng)后0分鐘和4分鐘，將600iil冷丙酮加入到反應(yīng)溶液中終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液于-80。C下靜置30分鐘，接著在15，000rpm下離心20分鐘。用離心濃縮機(jī)干燥上清。將生成物溶解在100(il、2%的醋酸中，接著在與實(shí)施例2的液相色譜中相同的條件下對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行沖全測(cè)和定量。只是注射量變?yōu)?0nl。在iPRDP和iPRTP的情況中，反應(yīng)溶液的量為100|Lll，所使用的蛋白質(zhì)的質(zhì)量為O.Ol)Llg,反應(yīng)時(shí)間為2分鐘。圖4中所示的結(jié)果顯示LOG蛋白以細(xì)胞分裂素核苷5，-單磷酸，例如tZRMP、DZRMP或cZRMP以及iPRMP作為底物。然而，LOG蛋白對(duì)AMP、iPRDP和iPRTP沒(méi)有反應(yīng)性。上述結(jié)果顯示，盡管在數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)計(jì)LOG蛋白具有賴氨酸脫羧酶的功能，但實(shí)際上，其是催化完全新型的、從核苷酸型細(xì)胞分裂素除去核糖5，-單磷酸并產(chǎn)生堿基形式活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的酶。圖5中顯示了LOG蛋白所催化的反應(yīng)。從這些結(jié)果可以說(shuō)，將LOG蛋白的俗名稱作細(xì)胞分裂素核苷5，-單磷酸磷酸核糖水解酶是適當(dāng)?shù)摹?實(shí)施例5)測(cè)定LOG蛋白對(duì)iPRMP和tZRMP的Km值為了獲得LOG蛋白對(duì)典型的底物iPRMP和tZRMP的Km值，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。將0.02jigLOG蛋白用于單次反應(yīng)，并將其在200nl含有50mMTris-HCl，1mMMgCl2,1mMDTT，pH6.5的反應(yīng)溶液中與底物濃度為5，8,15,30和100iiM的底物反應(yīng)。在開(kāi)始反應(yīng)后0分鐘、2分鐘、4分鐘，將600|al冷丙酮加入到反應(yīng)溶液中終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液于-80。C下靜置30分鐘，接著在15,000rpm下離心20分鐘。之后，用離心濃縮機(jī)干燥上清。將生成物溶解在100^1、2%的醋酸中，接著在與實(shí)施例2的液相色譜中相同的條件下對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和定量。只是注射量變?yōu)?0]il。進(jìn)行前述實(shí)驗(yàn)3次，并計(jì)算Km值。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)iPRMP的Km值為11.7±1.4|iM，比活性為5.6pmolmin".mg"蛋白質(zhì)。對(duì)tZRMP的Km值為22.0±3.6|aM,其比活性為4.2(imol.min".mg"蛋白質(zhì)。(實(shí)施例6)分離擬南芥LOG同源基因(AtLOGs)的cDNA檢驗(yàn)是否具有與LOG蛋白相同功能的細(xì)胞分裂素-激活酶不僅存在于水稻而且存在于擬南芥中。首先，根據(jù)LOG蛋白的氨基酸序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行蛋白質(zhì)BLAST檢索，以便在擬南芥中檢索其同源基因。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)編碼顯示與LOG蛋白高度同源的蛋白質(zhì)的9種擬南芥基因AtLOG1-9GiraZ^op^^/^"朋aLOG1-9;表3)。檢驗(yàn)是否這些基因在擬南芥植物體中被轉(zhuǎn)錄為在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.arabidopsis.org/)中預(yù)測(cè)的mRNA序列。即，從擬南芥植物體中提取mRNA，并使用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA作為模板、使用為擴(kuò)增推測(cè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)而設(shè)計(jì)的引物1，2,3,4，5，7和8，成功獲得了具有與在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的cDNA序列相同序列的擴(kuò)增片段。如同水稻LOG蛋白，預(yù)測(cè)這7種基因產(chǎn)物具有作為細(xì)胞分裂素-激活酶的功能。因此，關(guān)于這7種基因的cDNA序列，通過(guò)與水稻LOG蛋白相同的方法在大腸桿菌中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并純化。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺電泳確定最終純化的樣品的純度(圖6),并將產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。表3顯示與LOG蛋白高度同源的擬南芥基因組中的基因推測(cè)分子量與L0G的基因名稱AGICode推測(cè)氨基酸長(zhǎng)度(kDa)同源性(WAtLOG1At2g2830521323.276.1AtLOG2At2g3599021325.370.6AtL0G3At2g3721021523.679.9AtLOG4At3g5345021523.581.0AtLOG5At4g351抑22825.267.4AtL'OG6At5g0327022925.067.6AtLOG7At5g0630021723.972.2AtLOG8At5g1195021623.B65.6AtLOG9At5g2614014316.163.7(實(shí)施例7)確定擬南芥LOG同源蛋白(AtLOGs)的LOG酶活性在與實(shí)施例2相同的反應(yīng)條件下，評(píng)估每種純化的AtLOG蛋白的酶活性。結(jié)果，與在LOG蛋白的情況相同，AtLOG蛋白也以細(xì)胞分裂素核苷5，-單磷酸，例如iPRMP，tZRMP,DZRMP或cZRMP作為底物(圖7)。進(jìn)一步，與LOG蛋白相同地，這類AtLOG蛋白顯示對(duì)AMP、iPRDP和iPRTP幾乎沒(méi)有反應(yīng)性。此外，以與實(shí)施例5相同的方式測(cè)定每種AtLOG蛋白對(duì)iPRMP的酶性質(zhì)(表4)。在表4中，根據(jù)在每種AtLOG蛋白的最適pH條件下的反應(yīng)計(jì)算Km、Vmax和Kcat值。符號(hào)"士"顯示基于在相同條件下進(jìn)行3次操作所獲得的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。表426具有iPRMP作為底物的AtLOG1,2，3，4，5,7和8蛋白的酶性質(zhì)酵Km最適pHymol分鐘-W，蛋白質(zhì)分鐘—'分鐘—'M"1PHAtLOG116±22.1±0.154±43.5x1。，6.5AtLOG2126±16.6.1±2.0166±551.3x1Qs6.5AtLOG314±21.5±0.037±12.8x10s6.5AtLOG48.6±0.64,4±0.2"3±66.5AtLOG511±1OJ340.0320±11.8x10s5.4AtLOG76.7±0.8'3，8±0.2訴±61.5x10T6.5AtLOG817±10.053±0.0091.4±028.3x1047.0(實(shí)施例8)制備過(guò)表達(dá)擬南芥LOG同源基因(AtLOGs)的轉(zhuǎn)化體檢驗(yàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)細(xì)胞分裂素-激活酶基因AtLOG對(duì)植物體的影響。關(guān)于已經(jīng)確認(rèn)存在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的酶活性的AtLOG1,2，3,4,5，7和8基因中的AtLOG4和7，將根據(jù)酶活性分離的cDNA插入到已經(jīng)去除GUS基因的質(zhì)粒pBI121(Ckmtech)煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子的下游位點(diǎn)。將合成的質(zhì)粒導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌中，接著使用已經(jīng)通過(guò)PCR確認(rèn)導(dǎo)入了質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌感染野生型擬南芥。將所收集的種子接種到含有50ng/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基中。利用存在于pBI121的T-DNA區(qū)的卡那霉素抗性基因(NPTII)選擇表現(xiàn)出對(duì)卡那霉素抗性的個(gè)體。選擇26個(gè)成功導(dǎo)入了基因的卡那霉素抗性語(yǔ)系(后面稱作35S::AtLOG4和35S::AtLOG7)。所選擇的Tl代35S::AtLOG4和35S:丄OG7轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出彼此相似的表型。將從蓮座葉提取的、Tl代35S::AtLOG4(諳系#6和#26)和35S::AtLOG7(語(yǔ)系#3和#26)轉(zhuǎn)化體mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板、使用用于擴(kuò)增AtLOG4,7基因以及肌動(dòng)蛋白2(Actin2)基因的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)。使用來(lái)自野生型蓮座葉的cDNA(WT)作為對(duì)照。在RT-PCR反應(yīng)中，對(duì)AtLOG4進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，對(duì)肌動(dòng)蛋白2和AtLOG7則進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。結(jié)果，在2個(gè)鐠系的植物體中，確認(rèn)了AtLOG4和AtLOG7基因的過(guò)表達(dá)(圖8)。石^認(rèn)35S::AtLOG4^35S::I^:、7轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出彼此相似的表型，這些表型從Tl代遺傳到T2代。直到萌芽之后大約1周，35S::AtLOG4和35S::LOG7轉(zhuǎn)化體未表現(xiàn)出與野生型植物相比顯著的形態(tài)異常。然而，從形成并生長(zhǎng)許多蓮座葉的萌芽后大約2星期開(kāi)始，觀察到顯著的形態(tài)異常。35S::AtLOG4和35S::LOG7轉(zhuǎn)化體沿著葉脈形成深綠色蓮座葉(圖9)。在使用70%乙醇固定葉子并進(jìn)行脫色時(shí)，觀察到，與野生型植物相比葉子上維管束顯著發(fā)達(dá)(圖10)。觀察了這類葉子的橫斷面。結(jié)果，在維管束系統(tǒng)中觀察到了顯著的形態(tài)異常，例如維管的異位形成(圖11)。而且，還觀察到了葉子老化延遲的現(xiàn)象(圖12)。在野生型植物中，在伸出柄節(jié)之后，暫時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生側(cè)芽。然而，在35S::AtLOG4和35S::LOG7轉(zhuǎn)化體中，產(chǎn)生了多個(gè)側(cè)芽，并且在伸出柄節(jié)之后立即產(chǎn)生了葉子(圖13)。而且，擬南芥通常表現(xiàn)出總狀花序形式。然而，在35S::AtLOG4，35S::LOG7轉(zhuǎn)化體中，花序的軸不成直線，而是表現(xiàn)出蝎尾狀聚傘花序類形式(圖14)。此外，將這類轉(zhuǎn)化體中所包含的種子的大小和重量與野生型植物進(jìn)行比較，結(jié)果，確認(rèn)這類轉(zhuǎn)化體的種子的大小和重量比野生型植物顯著增加(圖15和16)。通過(guò)參照將本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以其整體并入本文中。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明明確了之前被認(rèn)為是編碼賴氨酸脫羧酶蛋的基因的水稻基因具有在細(xì)胞分裂素的生物合成途徑中催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的功能(細(xì)胞分裂素激活反應(yīng))。因此，使用本發(fā)明的基因能夠指導(dǎo)原先僅是通過(guò)細(xì)胞分裂素分解反應(yīng)的修飾而實(shí)現(xiàn)的活性細(xì)胞分裂素(堿基形式)的量的調(diào)節(jié)。而且，在過(guò)表達(dá)本發(fā)明基因的植物體中，觀察到了植物的特征發(fā)生了改變，例如柄節(jié)數(shù)目的增加、大種子的形成、厚葉脈的形成或花序的改變。因此，可以預(yù)見(jiàn)使用本發(fā)明的基因使得谷物商業(yè)價(jià)值提高，例如谷物產(chǎn)率的提高，或者剪下的花(cutflower)或葉子植物(foliageplants)的特征的多樣化。28權(quán)利要求1.導(dǎo)入了下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因的轉(zhuǎn)化體(a)由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化體，其中，所述的轉(zhuǎn)化體是轉(zhuǎn)化植物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化體，其中所述植物是植物體、植物器官、植物組織或經(jīng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞。4.重組載體，其包含下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因(a)由SEQIDNO:1,3，5，7,9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4,6,8，10,12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6，8,10,12，14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。5.制備轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于，其包括將下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因或權(quán)利要求4的重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及從所述才直物細(xì)力包再生纟直物體(a)由SEQIDNO:1，3,5，7，9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3，5，7,9,11，13，15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核香酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4，6,8，10,12，14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6，8，10，12,14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。6.調(diào)節(jié)植物中活性細(xì)胞分裂素的量的方法，其特征在于，包括調(diào)控下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因在植物中的表達(dá)水平(a)由SEQIDNO:1，3,5，7,9，11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11,13,15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2，4，6,8，10,12,14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2，4，6，8,10，12,14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。7.制備活性細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于其包括在添加了作為底物的核普酸型細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中收集活性細(xì)胞分裂素。8.通過(guò)在植物體中過(guò)表達(dá)下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因改變才直物特征的方法(a)由SEQIDNO:1,3，5,7,9,11，13，15中任一項(xiàng)所示的核普酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO:1，3，5，7,9,11，13，15中任一項(xiàng)所示的核苦酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO:2,4,6,8，10，12,14,16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO:2,4,6,8，10,12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中植物特征的改變包括花莖數(shù)目的增加、形成大種子、形成厚葉脈或花序的改變。全文摘要本發(fā)明的目的是闡明一種酶基因，其能夠直接調(diào)節(jié)合成的活性細(xì)胞分裂素的量，并提供利用前述基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂素量的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)化植物中導(dǎo)入了在下列(a)-(d)中任一項(xiàng)的基因(a)由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA所組成的基因；(b)在嚴(yán)格條件下與由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一項(xiàng)所示的核苷酸序列組成的DNA相互補(bǔ)的核苷酸序列所組成的DNA雜交、且編碼具有催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA所組成的基因；(c)編碼SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因；或者(d)編碼通過(guò)在SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸所得的序列所組成、且具有下述活性的蛋白質(zhì)的基因，所述的活性為催化從核苷酸型細(xì)胞分裂素合成活性細(xì)胞分裂素的反應(yīng)的活性。文檔編號(hào)C12N15/09GK101511999SQ200780032158公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年9月4日優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日發(fā)明者上田七重,榊原均,黑羽剛申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所