專利名稱：分離肝祖細(xì)胞的基質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝祖細(xì)胞的體外富集和/或分離和增殖。具體來說， 本發(fā)明涉及細(xì)胞外基質(zhì)組分的識(shí)別和選擇，所述細(xì)胞外基質(zhì)組分能 夠在體外增殖和/或分離肝祖細(xì)胞(包括肝干細(xì)胞)。
背景技術(shù)：
過去十年間，已經(jīng)在臨床研究中試驗(yàn)了原代肝細(xì)胞移植作為整 體器官移植替代的安全性和有效性，證明了其潛力。鑒于絕大部分 從未使用過的供體肝分離的肝細(xì)胞不具有增殖能力，植入有能力原 位形成肝組織的"干"細(xì)胞群的能力將是現(xiàn)有的基于細(xì)胞的療法中 的重要進(jìn)步。肝干細(xì)胞及其子代(例如，肝胚細(xì)胞和定向祖細(xì)胞 ) 具有相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增潛力。為此，這些細(xì)胞群是細(xì)胞療法(包括生物人 工肝或細(xì)胞移植)的理想候選物，并為患者提供了有吸引力的可選 治療選擇。
但是盡管有此希望，但肝細(xì)胞療法的全部潛力依然有待實(shí)現(xiàn)。 首先，肝干細(xì)胞的分離可能是費(fèi)力費(fèi)時(shí)的。這些細(xì)胞經(jīng)常包括少于 5%的總肝細(xì)胞群，并且在許多情況下少于1%。目前方法通常包括使 用可識(shí)別標(biāo)志物(例如，細(xì)胞表面蛋白抗體)正向選擇耙細(xì)胞。這 些方法是昂貴且有時(shí)無效的。
其次，肝干細(xì)胞及其子代的體外增殖已證明是有挑戰(zhàn)性的。當(dāng) 肝干細(xì)胞及其子代成功在體外增殖時(shí)，培養(yǎng)條件對(duì)于從實(shí)驗(yàn)臺(tái)轉(zhuǎn)向 臨床不是最佳的。例如， 一些培養(yǎng)條件極大阻礙細(xì)胞分裂或隨意促進(jìn)細(xì)胞分化，從而降低增殖有效性。而且， 一些培養(yǎng)條件需要添加 因子(例如，血漿或培養(yǎng)細(xì)胞)，這可能引入污染物并從而限制它們 在治療人中的應(yīng)用。
因此，需要選取并分離肝祖細(xì)胞的可選方法。而且，需要能夠 提供增強(qiáng)的肝干細(xì)胞及其子代體外增殖的培養(yǎng)條件，也需要能夠使 限制干細(xì)胞譜系成其適當(dāng)命運(yùn)的條件。最后，需要避免需求培養(yǎng)細(xì) 胞的培養(yǎng)條件。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了體外分離和/或選擇肝祖細(xì)胞的 方法，該方法包括(a)提供干細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液；(b)在包含 聚合形式膠原的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)所述肝細(xì)胞混懸液以獲得分離的 肝祖細(xì)胞群。所述膠原可以是I型膠原，優(yōu)選超過約75%重量的I
型膠原，更優(yōu)選超過約90%重量的1型膠原，甚至更優(yōu)選超過約95%
重量的I型膠原。在本發(fā)明具體實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括超過約
97%重量的I型膠原和/或是商業(yè)可獲得的PUREC0L基質(zhì)。在一些實(shí) 施方案中，所述基質(zhì)可進(jìn)一步包含聚合形式的III型膠原。而且， 肝祖細(xì)胞可以是肝干細(xì)胞。本發(fā)明方法可以進(jìn)一步包括在無血清培 養(yǎng)基中培養(yǎng)肝細(xì)胞混懸液。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含肝祖細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物、 無血清培養(yǎng)基和細(xì)胞外基質(zhì)(其包含聚合形式的膠原)的組合物。 所述膠原可以是I型膠原，優(yōu)選超過約75%重量的I型膠原，更優(yōu)選 超過約90%重量的I型膠原，甚至更優(yōu)選超過約95%重量的I型膠原。 在本發(fā)明具體實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括超過約97%重量的I型膠原 和/或是商業(yè)可獲得的PURECOL基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述基質(zhì) 可進(jìn)一步包含聚合形式的III型膠原。而且，肝祖細(xì)胞可以是肝干 細(xì)胞。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了體外增殖肝祖細(xì)胞的方法， 該方法包括(a)提供干細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液；(b)在包含聚合形式膠原和無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)所述肝細(xì)胞混懸液。肝 祖細(xì)胞可以是肝干細(xì)胞、分離的肝胚細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞或其組合。 進(jìn)一步地，所述膠原可以是I型膠原，優(yōu)選超過約75%重量的I型膠 原，更優(yōu)選超過約90%重量的1型膠原，甚至更優(yōu)選超過約95。/e重量
的I型膠原。在本發(fā)明具體實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括超過約97% 重量的I型膠原和/或是商業(yè)可獲得的PUREC0L基質(zhì)。在一些實(shí)施方
案中，所述基質(zhì)可進(jìn)一步包含聚合形式的ni型膠原。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了用于增殖肝祖細(xì)胞的容器， 該容器包括容器和不溶性物質(zhì)，所述不溶性物質(zhì)包括至少一種聚合 形式的膠原，其中不溶性物質(zhì)大體上包裹容器的至少一個(gè)表面。容 器可以是組織培養(yǎng)板、生物反應(yīng)器、實(shí)驗(yàn)室單元或?qū)嶒?yàn)室芯片。


圖1顯示衍生自新生肝的干細(xì)胞集落在本發(fā)明創(chuàng)造性基質(zhì)上分 離后兩周的形態(tài)。
圖2顯示圖1集落是EpCAM陽性(肝干細(xì)胞標(biāo)志物)。
圖3顯示衍生自胎兒肝的干細(xì)胞集落在本發(fā)明創(chuàng)造性基質(zhì)上分 離后兩周的形態(tài)。
圖4顯示在根據(jù)本發(fā)明的PureCor基質(zhì)上生長的細(xì)胞的選擇標(biāo) 志物的RNA表達(dá)。cDNA產(chǎn)生自細(xì)胞溶解產(chǎn)物，然后為下述標(biāo)志物經(jīng) 受PCR:泳道1， EpCAM; 2，白蛋白；3， A胎兒蛋白;4， CK19; 5， CYP3A4; 6，運(yùn)鐵蛋白；7， a-l-抗胰蛋白酶；8， 二肽基肽酶4 (Dip印tylp印tidase 4); 9，水通道蛋白4; 10, GAPDH。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明實(shí)施方案詳述
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)識(shí)別了細(xì)胞外基質(zhì)組分，其 促進(jìn)肝干細(xì)胞及其子代的附著、存活和體外增殖。本文使用的術(shù)語 "肝祖細(xì)胞"被廣泛定義為包括肝干細(xì)胞及其子代。"子代"可以 包括自我復(fù)制的肝干細(xì)胞、肝胚細(xì)胞、其多潛能祖細(xì)胞，以及定向分化為特定細(xì)胞類型(例如，肝細(xì)胞或膽細(xì)胞)的祖細(xì)胞。"多潛能" 表明細(xì)胞能夠形成超過一種命運(yùn)的子細(xì)胞；"單潛能"或"定向祖 細(xì)胞"是具有單一成體命運(yùn)的細(xì)胞。
"無性系擴(kuò)增"指能夠從單細(xì)胞擴(kuò)增并保留母細(xì)胞表型地重復(fù) 次培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞生長性質(zhì)。"集落形成"指能夠在一周或兩周
內(nèi)經(jīng)歷有限次數(shù)的細(xì)胞分裂(通常5-7次細(xì)胞分裂)的二倍體實(shí)質(zhì)細(xì)
胞的性質(zhì)，并包括具有有限的經(jīng)歷次培養(yǎng)或傳代的能力的細(xì)胞。
肝干細(xì)胞是在胎兒肝和新生肝的導(dǎo)管板(也稱為限制板)中和 小兒肝和成體肝的赫林管中發(fā)現(xiàn)的多潛能細(xì)胞，證明了具有端區(qū)酶 表達(dá)的自我復(fù)制并能夠在移植時(shí)形成成熟肝細(xì)胞。這些細(xì)胞是
EpCAM+、 NCAM+、 ALB+、 CK8/18+、 CK19+、 CD133/l+，并且對(duì)所有i式 驗(yàn)造血標(biāo)志物(例如，CD34， CD38, CD45， CD14)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 (CD146, VEGFr， CD31)和P450或a胎兒蛋白表達(dá)呈陰性。已經(jīng)發(fā)
現(xiàn)肝干細(xì)胞產(chǎn)生肝胚細(xì)胞和定向(單潛能)膽祖細(xì)胞。
肝胚細(xì)胞(HB)也是胎兒和新生肝實(shí)質(zhì)各處存在的多潛能細(xì)胞，
并且作為單細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體而集中在赫林管末端。HB衍生自 肝干細(xì)胞。HB分享存在于HSC上存在的許多抗原，但是具有重要差 別。例如，HB不表達(dá)NCAM而是ICAM1，并且它們表達(dá)顯著量的a 胎兒蛋白和胎兒形式的P450。這些HB產(chǎn)生單潛能祖細(xì)胞、定向造血 和膽祖細(xì)胞。
肝定向祖細(xì)胞是肝細(xì)胞和膽譜系之一。它們的抗原特征與HB重 疊；但是，膽定向祖細(xì)胞表達(dá)CK19而非AFP或ALB，而肝細(xì)胞定向 祖細(xì)胞表達(dá)AFP和ALB而非CK19。定向膽祖細(xì)胞直接衍生自肝干細(xì) 胞，也衍生自肝胚細(xì)胞。
間質(zhì)細(xì)胞(MC)包括許多不同間質(zhì)細(xì)胞類型(列為成熟細(xì)胞和括
號(hào)中它們的祖細(xì)胞)的不同譜系階段的細(xì)胞包括間質(zhì)(間質(zhì)干細(xì) 胞)、內(nèi)皮(成血管細(xì)胞)、星狀細(xì)胞(星狀細(xì)胞前體)和各種造血細(xì)胞 (造血干細(xì)胞)。
雖然本文討論和示例的肝祖細(xì)胞的大部分(如果非全部)指人 類衍生的細(xì)胞群，但是本文教導(dǎo)不限于人類。事實(shí)上，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)期應(yīng)用本文教導(dǎo)普遍從哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、 狗等)擴(kuò)增肝祖細(xì)胞。因此，本發(fā)明范圍預(yù)期包括任何和所有哺乳 動(dòng)物的肝祖細(xì)胞。
而且，雖然本發(fā)明在很大程度上描述從肝組織分離肝袓細(xì)胞。 本文描述的方法擴(kuò)展至從其他組織(包括胰腺、腸、肺或骨髓細(xì)胞) 分離祖細(xì)胞細(xì)胞，不限于肝祖細(xì)胞。
還要注意，根據(jù)本發(fā)明適合體外增殖的肝袓細(xì)胞不限于通過任
何特定方法分離或識(shí)別的那些。參見例如美國專利第5,702,881; 5,660,976; 5， 752'929; 5,863,296; 5,855,617; 5,843,024; 5,827,222; 5,723,282; 5， 514， 536;和4， 723， 939號(hào)等，其通過引 用整體結(jié)合入本文。
作為具體實(shí)例，用于分離和識(shí)別肝祖細(xì)胞的方法描述于例如美 國專利第6， 069, 005號(hào)和美國專利申請第09/487， 318; 10/135， 700; 和10/387， 547號(hào)，其公開內(nèi)容也通過引用整體結(jié)合入本文。例如， 肝干細(xì)胞和肝胚細(xì)胞分享多種抗原(例如，細(xì)胞角蛋白8、 18和19， 白蛋白CD133/1，和上皮細(xì)胞粘附分子("EpCAM"))，并且對(duì)造血標(biāo) 志物(例如，血型糖蛋白A， CD34， CD38, CD45， CD14)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo) 志物(例如，CD146， CD31， VEGFr或KDR)呈陰性。肝干細(xì)胞和肝胚 細(xì)胞能夠通過這些標(biāo)志物分離。
可選地，肝干細(xì)胞和肝胚細(xì)胞能夠通過尺寸(干細(xì)胞是7-9 而肝胚細(xì)胞是10-12 ^m)、通過培養(yǎng)物形態(tài)(干細(xì)胞形成密集的、形 態(tài)學(xué)一致的集落，而肝胚細(xì)胞形成由清晰通道、假定小管分散的帶 狀結(jié)構(gòu))、通過某些抗原表達(dá)模式差異(EpCAM在肝干細(xì)胞各處表達(dá)， 但限制在肝胚細(xì)胞的細(xì)胞表面)或通過不同抗原特征(N-CAM存在于 肝干細(xì)胞，而a胎兒蛋白(AFP)和ICAM1由肝胚細(xì)胞表達(dá))而彼此區(qū)分。
在胎兒和新生肝中，肝干細(xì)胞在導(dǎo)管板(還稱為"限制板")中， 而肝胚細(xì)胞是主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞群(〉80%)。在小兒和成體組織中，肝 干細(xì)胞存在于赫林管中，而肝胚細(xì)胞是聚集在赫林管末端的細(xì)胞。 肝胚細(xì)胞由小量正常組織細(xì)胞組成，但大量(例如，小瘤)發(fā)現(xiàn)于患 病肝(例如，肝硬化)中。
8來自胎兒肝的肝細(xì)胞混懸液充滿造血細(xì)胞，特別是類紅細(xì)胞。 事實(shí)上，人類胎兒肝的原始細(xì)胞混懸液平均由僅6-9%實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成， 其余是各種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，特別是類紅細(xì)胞。作為清除類紅細(xì)胞的常 規(guī)方法，例如使用裂解緩沖液，可能對(duì)肝祖細(xì)胞是毒性的，其他方 法可能是優(yōu)選的。例如，類紅細(xì)胞可以通過使用之前公開的方法反
復(fù)慢速離心從實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離(Lilja等，1997; Lilja等，1998)。
一種可選且更有效的方法，補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，可以被用于 使候選干細(xì)胞的損失最小化。膠原酶消化之后，抗人紅細(xì)胞(RBC)抗 體可以用細(xì)胞混懸液(1:5000稀釋)在37t:孵育15分鐘。為了穿刺 和裂解抗體標(biāo)記的紅細(xì)胞，添加(1:3000稀釋)補(bǔ)體(例如，LowTox Guinea豬補(bǔ)體)，在37。C孵育10分鐘。細(xì)胞上清液由于從紅細(xì)胞釋 放的紅色素變成粉紅色。清除了造血細(xì)胞的混懸液由至少80-90%實(shí) 質(zhì)細(xì)胞組成。
然后，得到的、已經(jīng)清除了造血細(xì)胞的混懸液在新鮮膠原酶溶 液中經(jīng)受第二輪酶消化30分鐘，以最小化細(xì)胞成簇，隨后通過75 u m 尼龍篩篩分。通過臺(tái)盼藍(lán)排除估計(jì)的細(xì)胞成活力常規(guī)高于95%。過濾 后，大部分肝胚細(xì)胞是每聚集體含有4至8個(gè)細(xì)胞的成簇細(xì)胞。這 些技術(shù)共同幫助產(chǎn)生基本不含PBC而富含實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的細(xì)胞混懸液。
作為另一個(gè)實(shí)例，如美國專利申請第10/620， 433號(hào)所描述，整 個(gè)肝可以被加工以去除死亡細(xì)胞和造血細(xì)胞。簡言之，來自新生、 小兒、青年、成年或尸體供體的整個(gè)人類肝或其部分在37t:用螯合 緩沖液灌注約15分鐘，然后用包含膠原酶和彈性酶的酶制劑在37 "C消化至少約30分鐘，以提供消化的肝。然后，將消化的肝冷凍在 收集緩沖液中并機(jī)械離解以提供細(xì)胞混懸液。然后，將細(xì)胞混懸液 又通過過濾筒過濾以去除碎屑和細(xì)胞聚集體。然后收集單細(xì)胞混懸 液，并任選測定其成活力和濃度。細(xì)胞濃度被調(diào)節(jié)至約25百萬細(xì)胞 /mL，以提供起始細(xì)胞混懸液。為了從該混懸液去除死亡細(xì)胞，小份 (250 mL)起始細(xì)胞混懸液與等體積25%碘克沙醇(OPTIPREP)在缺少 酚磺酞的RPMI 1640培養(yǎng)基中的溶液混合。該混合物(500 mL)用預(yù) 定體積(60 mL)的缺少酚磺酞的RPMI 1640培養(yǎng)基覆蓋，并在COBE2991 Cell Processor (15 min， 2000 rpm，約500 x g)上經(jīng)受離心， 以獲得至少一個(gè)富集活力細(xì)胞的條帶。該條帶在冰上收集入第三個(gè) 袋。任選地，可以測定細(xì)胞存活力和濃度。 細(xì)胞外基質(zhì)組分
單干細(xì)胞混懸液一經(jīng)獲得，本發(fā)明通過將混懸液鋪板于凝膠樣 細(xì)胞外基質(zhì)上分離或選擇肝祖細(xì)胞細(xì)胞(優(yōu)選肝干細(xì)胞)。事實(shí)上， 不限于理論或不受理論束縛，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本文描述的細(xì)胞 外基質(zhì)組分優(yōu)選以纖維(即，聚合)形式使用。如本文所定義，"聚 合"或"聚合物"膠原與纖維形式的膠原同義。注意，定義以及本 發(fā)明不受聚合程度的限制。換言之，包含大部分非單體膠原的任何 組合物是纖維狀的。確信的是，當(dāng)聚合時(shí)，基質(zhì)蛋白形成凝膠樣層， 其有益于肝祖細(xì)胞分離和增殖。細(xì)胞可以直接鋪板于基質(zhì)上或者 "夾在"在兩層之間，產(chǎn)生三維基質(zhì)。
確信，本發(fā)明范圍不限于任何一種基質(zhì)組分或其組合。與本文 教導(dǎo)相一致，本發(fā)明描述并教導(dǎo)了任何和所有細(xì)胞外基質(zhì)組分及其 組合產(chǎn)生基質(zhì)的用途，所述基質(zhì)可用于體外維持待擴(kuò)增或分化的細(xì) 胞。雖然這些組分中許多將在下文討論，為清楚起見，術(shù)語例如I、 III和IV型膠原和/或?qū)诱尺B蛋白應(yīng)該解釋為僅代表其各自類別的 細(xì)胞外基質(zhì)組分。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，描述了 I和III型膠原的基質(zhì)。 雖然這些膠原的許多比例適合本發(fā)明，但優(yōu)選實(shí)施方案包括97:3的 I:III膠原。97%1型膠原和3%III型膠原的溶液可以標(biāo)志PURECOL 商業(yè)獲自INAMED Corp. (Fremont, USA)。
PURECOL通常以大約3 mg/mL和pH 2提供。"溶液"含有高含 量單體；然而，單體可根據(jù)下述生產(chǎn)商建議的方案聚合
1. 將8份冷的PURECOL膠原與1份10X細(xì)胞培養(yǎng)基的10X磷酸 鹽緩沖生理鹽水溶液混合。細(xì)胞在該步驟被添加至培養(yǎng)基。
2. 通過添加0. 1M Na0H或0. 01N HC1調(diào)節(jié)溶液pH至7. 4 土 0. 2。 溶液pH可由pH計(jì)或PH試紙監(jiān)測。
3. 保持4-6"C的溫度以防止膠凝化。4. 為了成凝膠，加熱被中和的PURECOL膠原溶液至37'C。為了 最好的結(jié)果，允許發(fā)生至少45分鐘至1小時(shí)的膠凝化。
5. 凝膠可以在層流通風(fēng)櫥中干燥。
為了本文描述的實(shí)驗(yàn)，用10x PBS制備PURECOL基質(zhì)為所提供 的PUREC0L溶液。例如，在圖1A中，由8份1. 5 mg/ml PUREC0L和 1份10X PBS， pH 7. 4 (使用0. 1M NaOH或0. 1M HC1)組成的1. 0 ml PURECOL被合并，并在4t:溫和混合以產(chǎn)生均質(zhì)溶液。此過程中，需 要避免在新形成的膠原懸液中引入氣泡，因?yàn)闅庀赌軌蚴鼓z原不穩(wěn) 定。優(yōu)選地，制備表1所示不同比例的I型和III型人類膠原為上 述凝膠，然后應(yīng)用至組織培養(yǎng)塑料(TCP)。膠凝化后，準(zhǔn)備好板/孔 以接收細(xì)胞懸液。
如上所述，這些膠原的許多比例適合本發(fā)明。除了上文特別指 出的那些外，其他比例包括但不限于下表l所列表1.No.% I型膠原% III型膠原%其他膠原1%非膠原2
197300
2982
3991
41000
5955
69010
78020
87030
96040
105050
119703
129703
1397120
1497111
1597030
1695131
1795005
1895050
1:其他膠原包括例如IV型膠原 2:非膠原包括例如纖維結(jié)合素
ii不受理論束縛，認(rèn)為膠原I與膠原III的比例越大，促進(jìn)祖細(xì) 胞富集，而且，與膜(即，單體的)形式相反的膠原的凝膠(即，纖 維的)形式可以驅(qū)使祖細(xì)胞富集。
可選的富集步驟
雖然本發(fā)明不要求，但在將全部肝細(xì)胞涂布至本文所述基質(zhì)之 前或隨后的進(jìn)一步富集方案包括菲可分級(jí)分離以分離肝母細(xì)胞。簡
言之，細(xì)胞懸浮于10 ml無酚紅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并層疊在50 ml 離心管中等體積菲可帕克(Amersham Pharmacia)上。細(xì)胞隨后以 1000 xg離心25分鐘。收集界面和沉淀的細(xì)胞。菲可粉劑分離產(chǎn)生 超過80%實(shí)質(zhì)細(xì)胞的沉淀，其基本上全部是肝母細(xì)胞，具有多種抗原 全貌的原始細(xì)胞群的13-14%的界面表明實(shí)質(zhì)、造血和內(nèi)皮細(xì)胞。菲 可界面細(xì)胞以0. 1%產(chǎn)生管板細(xì)胞集落，是來自原始細(xì)胞懸液的10 倍。雖然菲可分級(jí)分離的結(jié)果可能與肝母細(xì)胞分離一致，但它們在 分離干細(xì)胞時(shí)制備與制備間更容易變化。
免疫選擇是富集和/或分離肝干細(xì)胞(管板細(xì)胞)或其他亞群的 另一種技術(shù)。優(yōu)選的免疫選擇方案是采用在細(xì)胞上高表達(dá)的抗原(例 如，在所有肝祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的EpCAM)和在肝祖細(xì)胞的一個(gè)亞群上的 其他抗原(例如，管板細(xì)胞上的NCAM)的那些方案。免疫選擇可以是 這些程序的多種方法的任何一種，并且可以是細(xì)胞計(jì)數(shù) 器、淘選或 磁珠。
磁性免疫選擇包括從人肝細(xì)胞懸液分離表達(dá)例如EpCAM的細(xì)胞， 使用與磁性小珠偶聯(lián)的單克隆抗體隨25，和Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach， Germany)的autoMACS 或CliniMACS⑧磁性柱 分離系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商推薦的方案。使用類似的方法來免疫選擇 NCAM、 CD146、 KDR (VEGFr)和CD133/1細(xì)胞。
培養(yǎng)基&緩沖液
多種細(xì)胞培養(yǎng)基可適合本發(fā)明。通過添加或從培養(yǎng)基去除生長 和/或分化因子，可以影響細(xì)胞增殖和/或分化的速率。例如，添加 血清可以減緩肝祖細(xì)胞的生長并導(dǎo)致對(duì)肝細(xì)胞命運(yùn)的譜系限制，平 行地，導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞群的快速擴(kuò)增(間質(zhì)和內(nèi)皮)。添加表皮生長因子導(dǎo)致對(duì)肝細(xì)胞命運(yùn)的譜系限制。優(yōu)選地，在一些實(shí)施方案中，本文描述的基質(zhì)組分與無血清培 養(yǎng)基結(jié)合使用。無血清培養(yǎng)基先前為肝母細(xì)胞而開發(fā)并描述于第09/678,953美國專利申請，其公開內(nèi)容通過引用整體結(jié)合入本文。 不受理論束縛，目前認(rèn)為本發(fā)明基質(zhì)組分提供了許多一般由培養(yǎng)細(xì) 胞提供的生存、生長和/或增殖細(xì)胞。因此，本發(fā)明可以顯著部分地 替代對(duì)胚胎間質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞的需求以保持肝祖細(xì)胞的存活力和擴(kuò)增潛 力。除非另有說明，在肝組織處理和細(xì)胞培養(yǎng)物維持過程中使用了 無血清培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基包含500 ml RPMI 1640，添加了 0. 1%牛血 清白蛋白組分V、 10 ug/ml牛全運(yùn)鐵蛋白(離子飽和的)、5 ug/ml 胰島素、500 ti 1硒(5 x 10—5 M原液)、5 ml L-谷氨酰胺、270 mg煙 酰胺、5mlAAS抗生素、500 u 1氫化可的松(l(T4 M原液)、1. 75 ix 1 2-巰基乙醇和38 u 1游離酸混合物，其如第09/678， 953號(hào)美國專 利申請所公布的制備。該培養(yǎng)基進(jìn)一步添加了 0. 2至1單位/mL LIF (ES-GRO; Chemicon， Inc., Temecula， CA) 、 0 - 10 ng/ml BMP4 (R & D Systems)和0 - 20 u M PD098059 (Mek inhibitor, Upstate, Lake Placid, NY)。最終，培養(yǎng)基被滅菌并在使用前調(diào)節(jié)其pH至7. 4。 "細(xì)胞洗滌緩沖液"包含500 ml RPMI 1640，添加1%牛血清白 蛋白、500 u 1硒和5 ml AAS抗生素。"酶消化緩沖液"包含100 ml 細(xì)胞洗滌緩沖液，其添加60 mg IV型膠原酶和30 mg在37 "C溶解 的DNA酶。增殖使用4x、 10x和20x放大鏡的相位顯微鏡檢査法，通過集落生 長的成像尺寸變化目視評(píng)價(jià)肝祖細(xì)胞增殖的識(shí)別和記錄；低放大物 鏡允許完整集落的觀察。祖細(xì)胞集落包括直徑約7 - 10 um的緊緊 粘附的細(xì)胞。通過重復(fù)集落成像獲得生長曲線，根據(jù)MetaMorph圖 像軟件預(yù)先校準(zhǔn)的己知尺度標(biāo)準(zhǔn)化顯微照片，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比分 析。或者，肝祖細(xì)胞的增殖使用生產(chǎn)商推薦的CellTiter 96非放射 性細(xì)胞增殖分析(MTT)或單溶液細(xì)胞增殖分析(MTS) (Promega，通常，富集根據(jù)本發(fā)明的肝祖細(xì)胞所需的生長期范圍是，對(duì)于 胎兒實(shí)質(zhì)細(xì)胞群為6天，對(duì)于新生細(xì)胞實(shí)質(zhì)群為10天，對(duì)于成體實(shí) 質(zhì)細(xì)胞群為60天。組織獲得&制備來自16-22周妊娠年齡的人胎兒的肝組織獲自公認(rèn)的代理商 Advanced Biosciences Resources of Alameda, CA。優(yōu)選地，組織 在分離18小時(shí)內(nèi)接收并作為肝組織多切片或者有時(shí)作為適當(dāng)完整的 肝到達(dá)。 一般而言，整個(gè)肝體積范圍為約4 ml至約12 ml，并含有 大量紅細(xì)胞(RBC)。肝被機(jī)械離解，組織用酶消化緩沖液部分消化，產(chǎn)生實(shí)質(zhì)細(xì)胞 簇。這些簇經(jīng)受洗滌和低速離心以基本上去除游離的懸浮造血細(xì)胞 而保留肝實(shí)質(zhì)。然后，將離解的肝分成3ml小份，向其中添加25ml 酶解消化緩沖液。32 t:下30分鐘適度攪拌后，移出上清液并貯存 于4 °C。任何殘留的未成碎片的沉淀用新鮮酶消化緩沖液再次消化 額外30分鐘。組織碎片的酶消化完成后，細(xì)胞懸液以250革命性離 心力(RCF)離心；除去上清液；沉淀重懸于等量細(xì)胞洗滌緩沖液。免疫染色使用丙酮和甲醇的50/50混合物固定細(xì)胞2分鐘后進(jìn)行細(xì)胞的 免疫染色，再次用lx PBS洗滌，用10%山羊血清封閉45分鐘。然后， 在室溫下添加與熒光探針偶合的初級(jí)人類抗體1至8小時(shí)。當(dāng)使用 未偶合的初級(jí)抗體時(shí)，細(xì)胞用與熒光探針偶合的次級(jí)抗體染色?，F(xiàn)在通過非限制實(shí)施例描述本發(fā)明實(shí)施方案。實(shí)施例使用幾種細(xì)胞外基質(zhì)作為涂布全肝(例如"UMIX")或EpCAM+磁 性分選細(xì)胞(即，肝干細(xì)胞)的單細(xì)胞懸液的基底?；|(zhì)誘導(dǎo)的(a)未 處理的；(b) PureCol ; (c和d)膠原III [分別來自Sigma-Aldrich 或Becton-Dickinson (BD) ]; (e)膠原IV (BD) ， (f)膠原I (Biocoat; Becton-Dickinson);或(g)纖維結(jié)合素(Sigma) 。 PureCol (Inamed) 包含凝膠形式(纖維形式)的97%膠原I禾『3%膠原III。來自Sigma-Aldrich和Becton-Dickinson的膠原III都主要包含膠原 III，含有小百分比的膜形式的膠原I。膠原IV是膜形式，來自 Becton-Dickinson的膠原I也以膜形式(單體形式)提供。纖維結(jié)合 素(Sigma-Aldrich， Inc， St. Louis, M0)板以5 ug/cm2制備并調(diào) 節(jié)至pH 7. 5。膠原III和IV板以1. 0 mg/ml濃度制備。 實(shí)施例I新生-37周膠凝化。十億細(xì)胞用于免疫選擇EpCAM+肝祖細(xì)胞。 新生EpCAM-分選細(xì)胞涂布于(a)未處理的組織培養(yǎng)塑料(TCP); (b) PUREC0L;和(c-d)膠原III (分別地，Sigma和BD)，在6孔皿中以 每孔100， 000或300， 000個(gè)細(xì)胞。涂布后兩周，干細(xì)胞集落在PureCol 板中獲得，而沒有干細(xì)胞集落在任何其他條件下獲得。實(shí)施例II新生-38周膠凝化。73億細(xì)胞被回收，接近全部被免疫選擇 EpCAM+肝祖細(xì)胞。新生EpCAM-分選細(xì)胞涂布于(a)未處理的組織培 養(yǎng)塑料(TCP); (b) PURECOL;和(c-d)膠原III (分別Sigma和BD)， 6孔皿中每孔800，000細(xì)胞。此外，非免疫選擇的全細(xì)胞群(包括實(shí) 質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞)也以每孔800, 000個(gè)細(xì)胞(6孔皿)涂布于(a) 未處理的TCP; (b) PURECOL;和(c-d)膠原III (分別為Sigma和 BD)，對(duì)UMIX以融合涂布，對(duì)EpCAM分選細(xì)胞以6孔皿中每孔800, 000 個(gè)細(xì)胞涂布。體外增殖兩周內(nèi)，觀察到肝細(xì)胞樣集落(圖l)。圖1中所示的 顯微照片在以相等細(xì)胞密度涂布的UMIX細(xì)胞培養(yǎng)兩周后獲得。 PURECOL增殖的培養(yǎng)物以更低放大倍數(shù)照相以更好說明推定肝干細(xì) 胞的廣泛生長。肝干細(xì)胞形成致密的直徑7-10 PM的細(xì)胞聚集物。 在未處理和膠原III處理的涂布中，UMIX細(xì)胞培養(yǎng)物沒有產(chǎn)生任何 干細(xì)胞集落，但觀察到了成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。使用EpCAM-分選細(xì)胞 獲得了類似結(jié)果。有趣的是，涂布在PURECOL上的EpC雄分選細(xì)胞 也產(chǎn)生了干細(xì)胞集落；但是，非免疫選自群產(chǎn)生了更高的干細(xì)胞富 集。其他涂布條件沒有一個(gè)產(chǎn)生任何干細(xì)胞集落。涂布兩周后，培養(yǎng)物經(jīng)固定并對(duì)EpCAM染色。所有細(xì)胞對(duì)EpCAM染色呈陽性。對(duì)于陰性對(duì)照，平行培養(yǎng)物不用二級(jí)抗體染色而可視; 沒有觀察到信號(hào)。因此，PURECOL基質(zhì)單獨(dú)可以用以從全肝細(xì)胞選擇 肝干細(xì)胞(參見圖2)。實(shí)施例III胎兒肝細(xì)胞在6孔皿中以每孔800， 000個(gè)細(xì)胞涂布于(a)未處 理的TCP; (b) PUREC0L;禾口 (f) Biocoat膠原I。涂布5周后，通過 形態(tài)學(xué)確定與圖1和3- PUREC0L板)所示相同，條件(a)和(f)產(chǎn)生 了不小于1%的肝干細(xì)胞。條件(a)產(chǎn)生了 >50%的肝干細(xì)胞，但是， 細(xì)胞在35天后停止增殖。實(shí)施例IV胎兒肝細(xì)胞在6孔皿中以每孔800， 000個(gè)細(xì)胞涂布于(a)未處理 的TCP， 4. 6 x 106個(gè)細(xì)胞于10 cm皿中；和(b) PUREC0L。涂布4周 后，條件(a)產(chǎn)生小于2%的肝干細(xì)胞，而條件(b)產(chǎn)生> 40%肝干細(xì) 胞。實(shí)施例V胎兒肝細(xì)胞在6孔皿中以每孔800,000細(xì)胞涂布于(a)未處理 的TCP; (b) PUREC0L; (c， d)膠原III (分別Sigma-Aldrich和BD); (e)膠原IV， (f)膠原I (Biocoat; Becton-Dickinson);和(g)纖 維結(jié)合素。涂布1周后，條件(a)和(c-g)產(chǎn)生了小于2。/。的肝干細(xì) 胞，而條件(b)產(chǎn)生了 〉40%的肝干細(xì)胞(參見圖3)。綜合而言，這些實(shí)驗(yàn)說明，全肝的單細(xì)胞懸液在凝膠樣細(xì)胞外 基質(zhì)(優(yōu)選含有纖維膠原、更優(yōu)選纖維膠原I)上培養(yǎng)時(shí)可以基本上 富集肝祖細(xì)胞，優(yōu)選肝干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基本 上富集被定義為對(duì)全肝細(xì)胞群富集超過約40%、 50%或60%。在優(yōu)選 實(shí)施方案中，對(duì)全肝細(xì)胞群富集超過約70%、 80%或甚至90%富集。如上所記錄的，在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，全肝單細(xì)胞懸液 在凝膠樣細(xì)胞外基質(zhì)(優(yōu)選含有纖維膠原、更優(yōu)選纖維膠原I)上培 養(yǎng)時(shí)可以基本上被分離或選擇肝祖細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，分離 產(chǎn)生超過約90%、優(yōu)選超過約95%、最優(yōu)選超過約99% "純"肝祖細(xì) 胞群、優(yōu)選肝干細(xì)胞的群。16干細(xì)胞集落培養(yǎng)物通常在肝處理后兩周內(nèi)獲得。對(duì)于胎JL制品， 高富集的干細(xì)胞樣集落在肝處理后1周是可視的。成體肝細(xì)胞群可 發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。再次，數(shù)據(jù)顯示，干細(xì)胞更好地?cái)U(kuò)增并保持在主要由纖維形式 的膠原I組成的基質(zhì)上，該基質(zhì)提供了簡單的選擇性培養(yǎng)基以從新 生和胎兒全肝細(xì)胞制品獲得高富集的肝干細(xì)胞群(接近或達(dá)到100% 富集)。換言之，本發(fā)明方法允許選擇肝干細(xì)胞而無任何其他標(biāo)準(zhǔn)。例如，本方法不需要分選EpC細(xì)+細(xì)胞。來自這些培養(yǎng)物的RNA可用以對(duì)許多生物標(biāo)志物(例如，EpCAM (表達(dá)于干細(xì)胞)、ALB (表達(dá)于干細(xì)胞)、AFP (表達(dá)于肝母細(xì)胞而非 干細(xì)胞)、CYP3A4 (表達(dá)于成熟肝細(xì)胞)、CK19 (表達(dá)于干細(xì)胞和膽 細(xì)胞)和GAPDH (輸入RNA質(zhì)量的對(duì)照和RNA量的內(nèi)標(biāo))進(jìn)行RT-PCR 分析(圖4)。確信，肝干細(xì)胞已知是EpCAM+AFP-ALB+。這樣，細(xì)胞 能夠被識(shí)別為"干細(xì)胞"、"肝母細(xì)胞"或"成熟肝細(xì)胞"。這里的新發(fā)現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或細(xì)胞群的移植，并可以不需要全 器官一起替代。實(shí)際上，本發(fā)明的發(fā)明性組合物能夠用于對(duì)患病肝 進(jìn)行種群恢復(fù)。來自胎兒、新生、小兒或成體供體器官的全肝細(xì)胞 制品或者已經(jīng)從這些來源富集的干細(xì)胞可以以800至850細(xì)胞/cm2 (3.5-4.0 x 106細(xì)胞/150腿皿)的密度涂布于本文描述的新基質(zhì)上 (例如，膠原I和ni凝膠(33:l比例))。在干細(xì)胞富集后，可以獲 得超過3 x 107細(xì)胞/150 mm皿。產(chǎn)生可安全移植入患者的3 x 109 細(xì)胞或1%肝塊將需要約100個(gè)150 mm皿(利用總計(jì)3. 5-4. 0 x 10H 個(gè)肝細(xì)胞；成體肝含有超過50 x 109個(gè)細(xì)胞)。在這一點(diǎn)上，細(xì)胞可用于細(xì)胞移植，冷凍保存以將來擴(kuò)增，或 者通過胰島素或膠原酶消化從150 mm皿去除細(xì)胞而進(jìn)一步擴(kuò)增并以 l:10稀釋涂布(g卩，使1皿擴(kuò)增至10皿)。支持強(qiáng)壯干細(xì)胞增殖的、 添加了因子例如LIF、 EPO、 PD98059、 BMP4和膽堿的無血清培養(yǎng)基 將用以培養(yǎng)干細(xì)胞。對(duì)于預(yù)期用于人類的產(chǎn)品，所有處理步驟應(yīng)優(yōu)選根據(jù)具有適當(dāng) S0P的cGMP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。人類干細(xì)胞應(yīng)該通過胰島素或膠原酶消化而17分離。細(xì)胞應(yīng)該立即使用或在使用前冷凍保存。冷凍保存的人類干 細(xì)胞可以被融化并懸浮于適合以不小于0. 1百萬且不超過10百萬細(xì) 胞/ml的優(yōu)選濃度輸注的無血清等滲介質(zhì)中。細(xì)胞存活力可以通過臺(tái) 盼藍(lán)排除或等同分析來評(píng)估。細(xì)胞可以保存在室溫或在濕冰上，并 通過顯微鏡檢查評(píng)估成簇跡象。如果觀察到成簇，則細(xì)胞將接受在尼龍網(wǎng)(40微米)過濾器上分散，并再次測定細(xì)胞的最終濃度。細(xì)胞可以以1百萬至10百萬細(xì)胞/kg體重的優(yōu)選劑量通過肝門靜脈或脾內(nèi)輸注入由于接觸急性毒性而遭受肝損傷的受體。作為細(xì) 胞輸注的替代，干細(xì)胞可以植入多種支架(模子)的任何一種，所述 支架用于直接移植入肝，使用上述相同的劑量參數(shù)。應(yīng)該監(jiān)測受體 的任何急性反應(yīng)跡象，例如發(fā)熱、寒戰(zhàn)或精神狀態(tài)變化，并且如果 觀察到這些癥狀的任何一種，應(yīng)該通過標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)踐對(duì)癥治療。然后通過每周血清化學(xué)在接下來的2個(gè)月時(shí)段內(nèi)監(jiān)測患者，以評(píng)價(jià)肝 功能恢復(fù)。在其他實(shí)施方案中，體外裝置例如生物反應(yīng)器可以用在適當(dāng)細(xì) 胞外基質(zhì)和適當(dāng)信號(hào)傳遞環(huán)境中包封的肝祖細(xì)胞接種，以便它們居 住在具有活力組織結(jié)構(gòu)的裝置小室。這樣，生物人工肝被開發(fā)為體 外肝輔助裝置以支持器官衰竭的患者。它們還可以用作佐劑以移植 干細(xì)胞以使患者具有肝功能，即使移植的供體細(xì)胞是重建的正常肝 組織。臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)使用細(xì)胞系(例如，豬肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞)完成 或者正在進(jìn)行。本發(fā)明的發(fā)明性組合物能夠用于如下用干細(xì)胞接種肝輔助裝 置來自胎兒、新生、小兒或成體供體器官的全肝細(xì)胞制品，或來 自這些來源的富集干細(xì)胞以850細(xì)胞/cm2的密度(細(xì)胞數(shù)將取決于肝 輔助裝置的容積容量)涂布在根據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)上，優(yōu)選地，膠原I 和III凝膠(33:1比例)。細(xì)胞培養(yǎng)將導(dǎo)致高富集的肝干細(xì)胞在肝輔 助裝置內(nèi)產(chǎn)生。支持強(qiáng)壯干細(xì)胞增殖的、添加了因子(包括LIF、 EPO、 PD98059、 BMP4和膽堿的組合)的無血清培養(yǎng)基將用以培養(yǎng)干細(xì)胞。生物人工肝還可以用于藥理學(xué)研究、疫苗開發(fā)和作為器官衰竭 和器官移植之間的橋梁。每年合成數(shù)百個(gè)候選藥物化合物，需要降低動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的花費(fèi)(其可能超過幾百萬元以試驗(yàn)一種物質(zhì)的安全性 評(píng)估)。因此，評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)和藥物毒性的體外模型系統(tǒng)的開發(fā)已變 得日益重要。這些體外系統(tǒng)也可以提高對(duì)藥物和化學(xué)誘導(dǎo)的毒性機(jī) 制的理解。體外模型通過生化途徑的結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性的存在而復(fù) 雜化，并不允許被清楚確定或重復(fù)檢驗(yàn)的機(jī)制。目前用于試驗(yàn)藥物候選物的技術(shù)是基于四十年前開發(fā)的二維(2-D)夾層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 大鼠肝細(xì)胞在多同軸生物反應(yīng)器(MCB)中維持升高水平的代謝 功能持續(xù)至少14天的最近發(fā)現(xiàn)已經(jīng)說明了 MCB的證實(shí)原理。本發(fā)明 的發(fā)明性組合物可以用于接種MCB，供體外藥物和化學(xué)品誘導(dǎo)的毒性 研究。該含有肝干細(xì)胞的新產(chǎn)品具有通過識(shí)別特異體質(zhì)藥物反應(yīng)而 節(jié)省制藥工業(yè)顯著時(shí)間和金錢資源的潛力，所述特異體質(zhì)藥物反應(yīng) 一直不能使用現(xiàn)有的2-D技術(shù)解釋。實(shí)際上，從這些考察獲得的結(jié)果表明，利用這些細(xì)胞可以是改 善目前限制細(xì)胞療法和生物反應(yīng)器裝置醫(yī)療選擇的細(xì)胞來源局限性 的途徑。根據(jù)本文的教導(dǎo)，來自胎兒、新生、小兒或成體供體器官 的全肝細(xì)胞制品，或者來自這些來源的富集干細(xì)胞以2 x106細(xì)胞/ml 體積(細(xì)胞數(shù)將取決于生物反應(yīng)器的容積容量)涂布于根據(jù)本發(fā)明的 基質(zhì)上，優(yōu)選地，膠原I和III凝膠(33:1比例)。細(xì)胞培養(yǎng)將導(dǎo)致 高富集的肝干細(xì)胞在肝輔助裝置內(nèi)產(chǎn)生。支持強(qiáng)壯干細(xì)胞增殖的、 添加了因子(包括LIF、 EPO、 PD98059、 BMP4和膽堿的組合)的無 血清培養(yǎng)基將用以培養(yǎng)干細(xì)胞。雖然已經(jīng)結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，其能 夠有進(jìn)一步調(diào)整，并且該申請預(yù)期包括下述本發(fā)明的任何變化、用途或改變。
一般而言，本發(fā)明原理包括如下從本公開內(nèi)容的偏差落入本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或慣常實(shí)踐，和可以應(yīng)用至前文提出 的必要特征，和落入所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種體外分離肝祖細(xì)胞的方法，該方法包括(a)提供肝細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；(b)在包含聚合形式的膠原的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)所述肝細(xì)胞懸液以獲得一群分離的肝祖細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述膠原是I型膠原。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約75%重量的I 型膠原。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約90%重量的I 型膠原。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約95%重量的I 型膠原。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約97%重量的I 型膠原。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)進(jìn)一步包含聚合形式的III 型膠原。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所述肝祖細(xì)胞是肝干細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求l的方法，其進(jìn)一步包括在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述肝細(xì)胞懸液。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述包含聚合形式的膠原的細(xì)胞 外基質(zhì)是PUREC0L基質(zhì)。
11. 一種體外選擇肝祖細(xì)胞的方法，該方法包括(a) 提供肝細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；(b) 在包含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)所述肝細(xì)胞懸液，所 述膠原是聚合形式，以獲得一群分離的肝祖細(xì)胞。
12. —種體外選擇肝祖細(xì)胞的方法，該方法包括(a) 提供肝細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；(b) 在包含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)所述肝細(xì)胞懸液，所述膠原是聚合形式，以獲得一群分離的肝祖細(xì)胞。
13. —種組合物，其包含肝祖細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物、無血清培養(yǎng) 基和包含聚合形式膠原的細(xì)胞外基質(zhì)。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述膠原是I型膠原。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約95%重量的 I型膠原。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述基質(zhì)包含超過約97%重量的 I型膠原。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述基質(zhì)進(jìn)一步包含聚合形式的in型膠原。
18. 權(quán)利要求13的方法，其中所述肝祖細(xì)胞是肝干細(xì)胞。
19. 一種體外增殖肝祖細(xì)胞的方法，該方法包括(a) 提供肝細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；(b) 在細(xì)胞外基質(zhì)上和無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞懸 液，其中所述膠原是聚合形式。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述肝祖細(xì)胞是分離的肝干細(xì)胞、 分離的肝母細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞或其組合。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述肝祖細(xì)胞獲自成體肝。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述成體肝是成人肝。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步包含層粘 連蛋白。
24. 權(quán)利要求1的方法，其中所述I型膠原的濃度為約0. 1至 約15 g/cm2。
25. —種用于增殖肝祖細(xì)胞的容器，該容器包括(a) 容器，禾口(b) 包含至少一種聚合形式的膠原的不溶性材料； 其中所述不溶性材料基本上包裹所述容器的至少一個(gè)表面。
26. 權(quán)利要求25的容器，其中所述容器是組織培養(yǎng)板、生物反 應(yīng)器、實(shí)驗(yàn)室單元或?qū)嶒?yàn)室芯片。
全文摘要
本發(fā)明提供了在一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分上體外分離和增殖肝祖細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)組分包括聚合形式的膠原。還提供了用于分離和增殖所述祖細(xì)胞的容器，該容器包括包含所公開的基質(zhì)的培養(yǎng)皿和/或生物反應(yīng)器。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101600791SQ200780032083
公開日2009年12月9日 申請日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日
發(fā)明者J·C·克拉克, J·C·魯伊斯, S·A·舍伍德 申請人:維斯塔治療公司