專利名稱：：用于生產(chǎn)赤松素的代謝改造細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體而言涉及赤松素這種多酚的生產(chǎn)。此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生赤松素的天然或重組微生物用于生產(chǎn)食品、飼料和飲料的用途。
背景技術(shù)：
：利用微生物生產(chǎn)化學(xué)品是生物技術(shù)的一種重要應(yīng)用。開發(fā)這樣的生物生產(chǎn)方法的步驟一般可包括l)選擇合適的微生物宿主，2)消除產(chǎn)生副產(chǎn)物的代謝途徑，3)使期望的途徑在酶活性水平和轉(zhuǎn)錄水平都失去調(diào)節(jié)，和4)過表達(dá)期望途徑中的適當(dāng)酶。在一些優(yōu)選的方面中，本發(fā)明利用以上步驟的組合，通過植物苯基丙烷類(phenylpropanoid)途徑的酶使來自苯丙氨酸的碳流重新定向，所述苯基丙烷類途徑為期望的赤松素生物合成提供必要的前體。赤松素(或稱為銀松素或3,5-二羥基反式茛)是一種屬于芪類植物抗毒素的植物酚，芪類植物抗毒素是構(gòu)成植物中應(yīng)答于感染或其他脅迫相關(guān)事件的主動(dòng)防御機(jī)制的低分子量次級(jí)代謝物。芪類植物抗毒素包含芪骨架(反式芪)作為其共同的基本結(jié)構(gòu)還可通過添加其他基團(tuán)進(jìn)行補(bǔ)充(Hart和Shrimpton,1979,Hart，1981)。貧類可見于某些樹木中(被子植物、棵子植物)，但也可見于一些草本植物中(在桃金娘科(A^T似CCfle)、葡萄科(和豆科(legW柳/W0Sfle)物種中)。所述化合物對(duì)有害生物(特別是對(duì)真菌、細(xì)菌和昆蟲)具有毒性。僅有少數(shù)植物能夠合成芪類或者以足以抵抗昆蟲的量提供芪類?；拒喂羌艿暮铣赏ㄟ^芪合酶進(jìn)行，在多數(shù)所檢查物種中該酶包括一個(gè)小基因家族(Kodan等2002)。芪合酶似乎是由查耳酮合酶演化而來，屬于具有超過65%氨基酸同源性的聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)超家族。與細(xì)菌PKS不同，芪合酶和查耳酮合酶都作為具有單個(gè)活性位點(diǎn)的單模塊PKS發(fā)揮作用，形成相對(duì)小的同型二聚體(Tr叩f等，1995)。芪合酶和查耳酮合酶使用共同的底物三種丙二酸單酰輔酶A和一種肉桂酰輔酶A/對(duì)香豆酰輔酶A,通過類似的反應(yīng)機(jī)制形成其產(chǎn)物(Kindl,1985)。芪合酶可歸類到4-香豆酰輔酶A特異性類型(使用4-香豆酰輔酶A作為底物時(shí)具有最高活性，例如白藜,醇合酶(EC2.3.1.95))中，或者歸類到肉桂酰輔酶A特異性類型(使用肉桂酰輔酶A作為底物時(shí)具有最高活性，例如赤松素合酶(EC2.3.1.146))中。編碼白藜蘆醇合酶的基因之前已就花生(y^flc/i/s(Schoppner和Kindl,1984;Schroder等，1988)和葡萄vi"(^mj(Melchior和KindL1991;Wiese等，1994)進(jìn)行了描述，而編碼赤松素合酶的基因主要針對(duì)松樹(P/"i/s"/ve欲/s和i*,7iMSs加6m^進(jìn)行了描述(Schanz等，1992;Raiber等，1995;Kodan等，2002;Hemingway等，1977)。赤松素存在于桉樹、云杉樹和松樹例如歐洲赤松(iV"wssj/veWWs)、赤松CP/""s1^isiyZoffl)、火炬松(PiVi"5似^i)和北美喬松CP/"ws1sfn^"s)的木漿中。在松樹中，赤松素組分僅存在于心材中(Kindl，1985)。然而，該化合物作為對(duì)損傷、真菌攻擊或環(huán)境脅迫(如UV照射和臭氧接觸)的應(yīng)答而在邊材、韌皮部和針葉中被誘導(dǎo)出來(Hart,1981;Kindl,1985;Richter和Wild，1992;Lieutier等，1996;Rosemann等，1991)。該化合物具有針對(duì)廣泛的真菌種類的高效抗真菌活性(Lindberg等，2004;,Pacher等，2002)。赤松素(圖1,反式)由兩個(gè)緊密連接的酚環(huán)組成，因此屬于多酚。與多數(shù)其他羥基芪不同，赤松素缺乏環(huán)B中的羥基(圖1)，由未取代的肉桂酰輔酶A和三個(gè)丙二酸單酰輔酶A分子縮合而成。也就是說，赤松素在結(jié)構(gòu)上類似于紅酒中發(fā)現(xiàn)的三羥基芪一一白藜，醇(Aggarwal等，2004)。已經(jīng)有許多數(shù)據(jù)證實(shí)了白藜,醇在健康方面的益處。例如，白藜聲醇在許多癌細(xì)胞系中的高效抗癌活性已經(jīng)非常明確(Aggarwal等，2004)。由于在結(jié)構(gòu)上與白藜，醇的相似性，預(yù)計(jì)赤松素也具有高效的健康益處。事實(shí)上，已經(jīng)研究了赤松素對(duì)多種癌癥的作用，包括結(jié)腸直腸癌和肝癌，并已顯示其化學(xué)預(yù)防和抗白血病的活性(Skinnider和Stoessl，1986;.Mellanen等，1996;Roupe等，2005以及2006)。此外，赤松素還具有抗氧化劑的能力，盡管程度低于例如白藜蘆醇(Stojanovic等，2001)。目前，赤松素大多在多種黃酮類的混合物中獲得，該混合物提取自松樹皮。所述提取是產(chǎn)率^f艮低的勞動(dòng)密集型方法。在一些優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供新的更為高效且高產(chǎn)率的生產(chǎn)方法。在植物中，苯基丙烷類途徑負(fù)責(zé)合成多種次級(jí)代謝化合物，包括木質(zhì)素、水楊酸、香豆素、羥基肉桂酰胺、色素、類黃酮和植物抗毒素。事實(shí)上，芪類在植物中的形成通過苯基丙烷類途徑進(jìn)行。通過L-苯丙氨酸氨裂合酶(L-phenylalanineammonialyase,PAL)，經(jīng)由非氧化脫氨基作用將氨基酸L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸(圖2)。從反式肉桂酸開始，該途徑可分支成形成白藜蘆醇的途徑或形成赤松素的途徑。在笫一個(gè)途徑中，通過肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)(—種細(xì)胞色素P450單加氧酶)與NADPH:細(xì)胞色素P450還原酶(cytochromeP450reductase,CPR)的結(jié)合，將反式肉桂酸在對(duì)位羥化成4-香豆酸(4-羥基肉桂酸)。其后，接著通過4-香豆酸-輔酶A連接酶(4-coumarate-CoAligase,4CL)的作用將4-香豆酸活化成4-香豆酰輔酶A。接著，一種白藜^"醇合酶(VST1)可催化4-香豆酰輔酶A的苯基丙烷單元與丙二酸單酰輔酶A縮合，從而形成白藜蘆醇。在后一途徑中，通過4CL的作用將反式肉桂酸直接活化成肉桂酰輔酶A，其中赤松素合酶(pinosylvinsynthase,PST)隨后催化肉桂酰輔酶A中苯基丙烷單元與丙二酸4酰輔酶A的縮合，從而形成赤松素。芪合酶是一些底物相當(dāng)廣泛的酶，能接受多種生理及非生理底物。例如，體外加成多種苯基丙烷輔酶A起始酯類導(dǎo)致形成若干產(chǎn)物(Ikuro等，2004;Morita等，2001)。類似地，已經(jīng)顯示，來自大黃(及/^m柳似"flWc"m)的白藜蘆醇合酶在以肉桂酰輔酶A代替香豆酰輔酶A作為底物時(shí)事實(shí)上合成了少量赤松素(Samappito等，2003)。類似地，香豆酰輔酶A連接酶可接受香豆酸和肉桂酸作為底物，盡管對(duì)肉桂酸的催化效率(Km/Kcat)比香豆酸低100倍(Allina等，1998;Ehlting等，1999)。我們由此推斷，有可能在由4CL和芪合酶(甚至是指定為經(jīng)典白藜,醇合酶的芪合酶)所組成的途徑中產(chǎn)生赤松素。近來，公開了一種能從葡萄汁中少量存在的香豆酸產(chǎn)生白藜，醇的酵母(Becker等2003，ZA200408194)。通過共表達(dá)異源輔酶A連接酶基因(來自雜交白楊)與葡萄白藜聲醇合酶基因(KST7)實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母(&cwev/s/fle)實(shí)驗(yàn)室菌林中由外源4-香豆酸產(chǎn)生4-香豆酰輔酶A和伴隨產(chǎn)生的白藜聲醇。白藜蘆醇合酶的另一種底物丙二酸單酰輔酶A已在酵母中內(nèi)源產(chǎn)生，并參與脂肪酸從頭生物合成。該研究顯示，釀酒酵母細(xì)胞在補(bǔ)充有4-香豆酸的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)可產(chǎn)生游離形式或與葡糖苷結(jié)合形式的少量白藜蘆醇。由于白藜,醇合酶的底物廣泛性，所述酵母有可能在添加顯著量的肉桂酸進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)也能產(chǎn)生赤松素。然而，這種酵母的商業(yè)應(yīng)用將受困于很可能出現(xiàn)的低白藜蘆醇產(chǎn)率以及因在工業(yè)培養(yǎng)基中不充足而需要添加肉桂酸。因此，為了加快并拓寬赤松素作為藥物或營(yíng)養(yǎng)物的應(yīng)用，非常期望提供能直接由葡萄糖生產(chǎn)赤松素而無需添加肉桂酸或任何下游肉桂酸衍生物(例如肉桂酰輔酶A)的酵母或其他微生物。最近的一項(xiàng)研究(Ro和Douglas,2004)描述了通過引入來自白楊的PAL、C4H和CPR在釀酒酵母中重建苯基丙烷類途徑的進(jìn)入點(diǎn)。其目的是評(píng)估含有PAL和C4H的多酶復(fù)合體(multienzymecomplex,MEC)對(duì)于進(jìn)入苯基丙烷類代謝的這一進(jìn)入點(diǎn)是否具有功能重要性。通過向重組酵母提供[3H]-苯丙氨酸，發(fā)現(xiàn)大部分代謝掉的[3H]-苯丙氨酸摻入到4-[3H]-香豆酸中，并且通過抑制C4H活性高度降低了苯丙氨酸代謝。此外，僅表達(dá)PAL的宿主僅將極少量苯丙氨酸代謝成肉桂酸。當(dāng)向該三重表達(dá)宿主同時(shí)提供[3H-苯丙氨酸和[14C-反式肉桂酸時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)源合成的[3H-反式肉桂酸流向4-香豆酸的證據(jù)。因此，在酵母中，通過PAL和C4H所催化反應(yīng)從苯丙氨酸向4-香豆酸的有效碳流量似乎不需要通過MEC，PAL與C4H的完全生物化學(xué)偶聯(lián)看來足以驅(qū)動(dòng)碳流量進(jìn)入苯基丙烷類途徑。在另一項(xiàng)研究(Hwang等，2003)中，通過表達(dá)人工基因簇實(shí)現(xiàn)了通過大腸桿菌產(chǎn)生植物特異性黃酮，所述人工基因簇包含多種異源來源的三個(gè)苯基丙烷類途徑基因來自酵母菌深紅酵母(及/r"^似nz/fln/辦r")的PAL、來自放線菌天藍(lán)色鏈霉菌(5^印to附3;cM)的4CL以及來自甘草植物刺甘草(G(vcj;/t/i/z"ecA/"ato)的查耳酮合酶(chalconesynthase,CHS)。這些途徑繞開了C4H，因?yàn)榧?xì)菌4CL酶將反式肉桂酸和4-香豆酸均與輔酶A連接。此外，來自深紅酵母的PAL使用苯丙氨酸和酪氨酸均作為底物。因此，含有該基因簇并在葡萄糖上培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生少量的兩種黃酮來自苯丙氨酸的生松素(0.29g/l)和來自酪氨酸的柚皮素(0.17g/l)。此外，還累積了大量它們的前體4-香豆酸和反式肉桂酸(分別為0.47和1.23mg/l)。另外，可通過添加苯丙氨酸和酪氨酸來提高這些化合物的產(chǎn)率。還描述了這樣的研究其中通過首先將基因克隆進(jìn)大腸桿菌來研究赤松素合酶的酶特性。例如，Raiber等，1995報(bào)告了來自北美喬松(東方白松)(尸/""s欲M"s)的芪類，其中在大腸桿菌中異源表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行研究。為此，使用來自歐洲赤木>(戶/wws矽/v"加's)的芪合酶(stilbenesynthase,STS)探針篩選北美喬松cDNA文庫，在所分離的cDNA中發(fā)現(xiàn)了兩種密切相關(guān)的STS基因STS1和STS2,其蛋白質(zhì)中存在五個(gè)氨基酸差異。將所述基因克隆到質(zhì)粒上并在大腸桿菌中表達(dá)，對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行酶測(cè)定。看上去兩種蛋白質(zhì)都接受肉桂酰輔酶A作為底物，因此被認(rèn)為是赤松素合酶，但它們顯示了巨大的差異。STS1僅具有STS2活性的3-5%，其最適pH向更低值(pH6)遷移，并且其使用肉桂酰輔酶A合成另一種未知產(chǎn)物。定點(diǎn)*秀變顯示，STS1中Arg向His的單個(gè)改變?cè)斐闪怂羞@些差異。在另一項(xiàng)研究中，分離了來自赤松(乃Vi"sfif^w,77om)的三種STScDNA(PDSTS1、PDSTS2和PDSTS3)，并在大腸桿菌中異源表達(dá)所述cDNA，以表征其酶特性(Kodan等，2002)。PDSTS3看來是一種不常見的STS同工酶，其在所測(cè)試的STS中顯示最高的赤松素形成活性。此外，PDSTS3對(duì)產(chǎn)物抑制不敏感，這與PDSTS1和PDSTS2不同。PDSTS3的不尋常特征可能是由于缺少了芪合酶通常具有的C端延伸部分，這是由移碼突變導(dǎo)致的。在另一項(xiàng)研究中，用赤松素合酶cDNApSP-54作為探針篩選基因組DNA文庫(Mtiller等，1999)。亞克隆之后，通過測(cè)序來表征四種不同的成員。從PST-1、PST-2、PST-3和PST-5推出的氨基酸序列具有高于95%的總體同一性。接著通過在煙草原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)來分析啟動(dòng)子強(qiáng)度的差異。所使用的構(gòu)建體包含在松樹基因PST-1、PST-2和PST-3的啟動(dòng)子控制之下的細(xì)菌葡萄糖醛酸糖香酶。用UV光或真菌激發(fā)劑處理后，PST-1的啟動(dòng)子顯示最高的應(yīng)答，并在維管束中產(chǎn)生組織特異性表達(dá)。該數(shù)據(jù)提示，在松樹中，PST-1的基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)幼苗中的脅迫應(yīng)答以及心材中的赤松素形成。另一項(xiàng)研究顯示，克隆自蘇格蘭松(歐洲赤松)的一種芪合酶先前被錯(cuò)誤地歸類為二氫赤松素合酶，但它顯示是赤松素合酶。之前的誤解是由于細(xì)菌因子影響了在大腸桿菌中表達(dá)的植物特異性蛋白的底物偏好性和活性。改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)后，后續(xù)的動(dòng)力學(xué)分析顯示，所克隆的芪合酶的偏好底物是肉桂酰輔酶A，而不是苯基丙酰基輔酶A。此外，來自歐洲赤松的提取物中含有選擇性影響底物偏好性的西子，即使用苯基丙酰基輔酶A時(shí)活性降低，而使用肉桂酰輔酶A則不然。這解釋了植物提取物與大腸桿菌中表達(dá)的克隆酶之間的表觀差異，并且提醒人們，自然界及新宿主中的因子可以使克隆序列的功能鑒定復(fù)雜化。此外，描述了帶有芪合酶(可以指白藜蘆醇合酶和赤松素合酶)基因的載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化生物體和植物體以賦予增強(qiáng)的昆蟲及創(chuàng)傷抗性(EP0309862和EP0464461)。此外，還描述了含有與歐洲赤松中赤松素合酶雜交的DNA序列的另一些載體(US5391724)，所述載體用于在植物中進(jìn)行表達(dá)(US5973230)。然而，沒有公開將PAL和4CL與芪合酶一起摻入以用于在生物中產(chǎn)生赤松素。也沒有公開任何產(chǎn)生赤松素的微生物。近來，已有證據(jù)顯示絲狀真菌米曲霉(Aof^"e)中含有通常在植物中參與類黃酮(如柚皮素)生物合成的查耳酮合酶(CHS)(Juvvadi等，2005;Seshime等，2005)。事實(shí)上，還顯示米曲霉中含有負(fù)責(zé)苯基丙烷類-類黃酮代謝的一組重要基因，即PAL、C4H和4CL。然而，沒有跡象表面米曲霉中含有芪合酶。我們的共同未決申請(qǐng)WO2006/089898描述了產(chǎn)生白藜，醇的微生物，特別是酵母。發(fā)明概述本發(fā)明現(xiàn)提供了具有有效代謝途徑的微生物，所述代謝途徑中包含至少一種由肉桂酸產(chǎn)生赤松素的酶活性。在一些優(yōu)選的微生物中，所述途徑產(chǎn)生肉桂酸并由其產(chǎn)生赤松素。特別地，本發(fā)明提供了這些微生物用于生產(chǎn)赤松素的用途。這樣的微生物可以是天然存在的，并可通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法(例如簡(jiǎn)并性PCR、Southern印跡和計(jì)算機(jī)同源性檢索)分離，但更優(yōu)選是經(jīng)遺傳改造的。本發(fā)明包括從這些微生物中生產(chǎn)赤松素的方法，并任選地包括分離或純化由此產(chǎn)生的赤松素。優(yōu)選地，培養(yǎng)在基本不存在外源肉桂酸的情況下進(jìn)行。這也暗指基本不存在于苯基丙烷類途徑中由其形成的肉桂酸衍生物(例如肉桂酰輔酶A)的外源來源。優(yōu)選實(shí)施方案詳述優(yōu)選地，所述赤松素或衍生物在內(nèi)源丙二酸單酰輔酶A是其底物的酶催化反應(yīng)中產(chǎn)生，優(yōu)選地，由肉桂酰輔酶A產(chǎn)生所述赤松素。所述赤松素或衍生物優(yōu)選由肉桂酰輔酶A產(chǎn)生，優(yōu)選通過芪合酶產(chǎn)生，所述芪合酶優(yōu)選由編碼所述酶的核酸在所述微生物中表達(dá)，其中所述核酸不是該微生物中天然存在的。一般來說，在本文中，除非上下文表明為其他含義，否則提及赤松素時(shí)包括其寡聚衍生物或糖苷結(jié)合衍生物。因此，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芪合酶為白藜蘆醇合酶(EC2.3.1.95),所述白藜，醇合酶來自屬于落花生屬(^nic/i/s)的植物，例如Ag/"tom、落花生(J勿"^ie");屬于大黃屬(J/rew附)的植物,例如圓葉大黃(及.to似f/c"ni);屬于葡萄屬(的植物，例如美國(guó)葡萄(K/fl&"SCfl)、河岸葡萄(K)、歐洲葡萄(Kv,7i,y^fl);或者以下任何屬的植物松屬(i^wi/s)、云杉屬(iVcMfl)、百合屬(丄,7/w附)、桉屬(五MCfl/y/;似s)、爬山虎屬(i^W/r^ioc/s^ws)、白粉藤屬(C7s愿)、蝶花百合屬(Cfl/。cAo"ws)、蓼屬(iW，w函)、買麻藤屬((7""m附)、木'菱蘿屬(J/^oir/ms)、假山毛櫸屬(7V^/io/flgws)、刺葵屬(/Vioe"/jc)、羊茅屬(/^對(duì)i/cfl)、甚草屬()、藜,屬(J^m^扁)、羊蹄甲屬(5"M/hVi/fl)或老虎刺屬(i^e/v/M/"柳)。所述芪合酶可以是在以肉桂酰輔酶A作為底物時(shí)轉(zhuǎn)換率高于(例如至少1.5或至少2的因數(shù))在以4-香豆酰輔酶A作為底物時(shí)轉(zhuǎn)換率的酶。因此，在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芪合酶是赤松素合酶，其合適地來自樹木，例如松屬、桉屬、云杉屬或橙桑屬(Mflc/"m)物種。特別地，所述芪合酶可以是來自以下植物的赤松素合酶(EC2.3.1.146):屬于松屬的植物，例如歐洲赤松、北美喬松、赤松、火炬松(A似^/fl);屬于云杉屬的植物，或者桉屬的任一植物。優(yōu)選地，所述肉桂酸可在酶催化的產(chǎn)生氨的反應(yīng)中從L-苯丙氨酸產(chǎn)生，適當(dāng)時(shí)所述肉桂酸通過苯丙氨酸氨裂合酶從L-苯丙氨酸產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述L-苯丙氨酸氨裂合酶是來自植物或微生物的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC4.3.1.5)。所述植物可屬于擬南芥屬(Jm6,V/fl/;s^)，例如擬南芥(A^rfl""/i");屬于蕓苔屬(5mssic")的植物，例如歐洲油菜(及聽/7ws)、蕪青(5.ffl/m);屬于柑橘屬(CVYms)的植物，例如斥計(jì)橘(C.r"/cw/"似)、克萊蒙才甘橘(C.c/e附e"""Ms)、檸檬(C.//柳o/j);屬于菜豆屬(/Vifls/Ms)的植物，例如荷包豆(Ectfc"Vi^is)、菜豆(Pv"/gw/s);屬于爭(zhēng)>屬(戶,7fws)的植物，例如北美短針木>(E6"fiA:s/"wfl)、加州山*》(P附ow"'co/fl)、海岸*》(E/;/"fl對(duì)er)、歐洲赤爭(zhēng)》(Esj/vM加's)、火炬木》(Eto^/");屬于楊屬(/V/7w/ws)的植物，侈寸:i口小葉楊(E6fl/sa柳zy^")、Pde/^wV^s、加楊(A)、EA^flAYWff/csis\歐',川山楊(E"c柳m/(,V/^s);屬于癡屬的植物，例如馬鈴薯(5*.似&nw"柳)；屬于李屬(iV"m"s)的植物，例如歐洲甜樓杉包(E"v/w附)、桃(E/^ra/c");屬于葡萄屬(FZ似s)的植物，例如葡萄(W似sWw,y^fl);屬于玉蜀黍?qū)?Zm)的植物，例如玉蜀黍(Z.或者其他植物屬，例如藿香屬(^gflW"c/^)、鳳梨屬(v4wflwfls)、天門冬屬(^4s/;flni^/s)、布氏蘭屬f5mw/r^i力Vi人簕竹屬(5fl柳6ws"J、甜菜屬(5eto)、樺木屬(5e似/fl)、黃瓜屬(C"cww/s)、山茶屬()、辣椒屬(CVi/s/cm柳)、決明屬(CflswVi)、長(zhǎng)春花屬(C"&flm/i^iMS)、鷹嘴豆屬(C7cw)、西瓜屬(Ow//ms)、咖啡屬(CV，j^fl)、南瓜屬(C"cw6/to)、狗牙才艮屬(Q;w0^w)、胡蘿卜屬()、石斜屬(Dew^Y^/w附)、石竹屬(Z)zVm/Aws1)、洋地黃屬("/gzYfl//5)、薯蕷屬(i)/osromi)、按屬(五ncfl/"似s)、G"http://"s、銀杏屬(G/"&o)、大豆屬(G7戸W)、大麥屬(^n/e謂)、向日葵屬(ZTCVl^MS1)、番薯屬(^0附OCfl)、萵苣屬()、紫草屬(ZjYAos/^/7fiw柳)、百樂^才艮屬(Z^^ms)、番癡屬(Z^cfl^ers/coM)、首著屬(M^Z/c"go)、蘋果屬(Ma/i/s)、木薯屬(Afflwi7^)、苜蓿屬(M^//c"g()、日中花屬(A/^e附6owi幼e附n附)、煙草屬(iV/cW/fliifl)、木犀欖屬(O/e")、稻屬()、豌豆屬(iV^/附)、鱘梨屬(i^raefl)、歐芽屬(P^y^^Vii/iw)、蝴蝶蘭屬(尸/i"/fle腳/w/s)、剛竹屬()、小立碗蘚屬^P/rj^o附/^〃fl人云杉屬(P/ce)、梨屬(i^ri/s)、櫟屬(0/em/s)、蘿卜屬(及"/7/^wms)、地黃屬(及eAwfl/im'fl)、懸鉤子屬(及m6ws)、高粱屬(iSWg/iM附)、iS/7A^io5^"s、繁縷屬(5te〃flnVi)、鉛筆花屬(鄉(xiāng)/oswi^s)、小麥屬(7W,/cw附)、車軸草屬(7>,>//"附)、小麥屬(rnY/cMiM)、越桔屬(F"c"Vi/m附)、豇豆屬(Wg/ia)、百日草屬(Z,Viw/fl)。所述微生物可以是屬于蘑菇屬(爿^in'cwsJ的真菌，例如雙孢蘑菇(A6/s/onw);屬于曲霉屬(^s/;^^7/"s)的真菌，例如米曲霉(A00;^1e)、構(gòu)巢曲霉(A附V/"/flws)、煙曲霉(A/M附/gfl似s);屬于黑粉菌屬(C/幼7flgo)的真菌，例如￡/附"yrf/s;屬于紅細(xì)菌屬(及/^flfo^i"er)的細(xì)菌，例如莢膜紅細(xì)菌(J.ai/ww/"似s);屬于鏈霉菌屬(5^印似附y(tǒng)cM)的細(xì)菌，例如S.附fln7/附ws;屬于光桿狀菌屬(iV^torA"^/ws)的細(xì)菌，例如發(fā)光光桿狀菌(E/"w/"^ce/fs);屬于紅酵母(及/^rfo&ra/fl)的酵母，例如深紅酵母(i.rw6m)。由于如上文所述，為了產(chǎn)生赤松素，我們需要通過PAL酶產(chǎn)生肉桂酸并將其轉(zhuǎn)化成赤松素，而不是通過底物廣泛的PAL從酪氨酸產(chǎn)生香豆酸或是通過C4H酶轉(zhuǎn)化肉桂酸來生產(chǎn)香豆酸，因此由于本發(fā)明的微生物優(yōu)選具有偏好以苯丙氨酸(因此產(chǎn)生肉桂酸)而不是酪氨酸(將產(chǎn)生香豆酸)作為底物的PAL。因此，該P(yáng)AL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值優(yōu)選小于l:l，優(yōu)選小于1:5，例如小于1:10。一般地，Km是產(chǎn)生最高產(chǎn)物形成速率(Vmax)—半的底物(分別為苯丙氨酸或酪氨酸)摩爾濃度。C4H的存在對(duì)于赤松素產(chǎn)生沒有幫助，但也無需禁止，只要肉桂酸不將肉桂酸從赤松素產(chǎn)生過多地轉(zhuǎn)向形成白藜，醇的方向即可。因此，優(yōu)選地，不存在C4H產(chǎn)生，或者使得Keat(PAL)/Keat(C4H)大于2，優(yōu)選大于4。一般地，在每種情況下，Keat是V咖x/[酶，其中[酶是相關(guān)酶的濃度。例如，擬南芥苯丙氨酸氨裂合酶PAL2及其同源物PAL1的典型Km值在使用苯丙氨酸作為底物時(shí)約為60nM(Cochrane等，2004)，在使用酪氨酸為底物時(shí)則高于1000nM(Watts等，2006)。擬南芥PAL2的催化轉(zhuǎn)換率Keat在將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成肉桂酸時(shí)為192mol/mol酶PAL2(Cochrane等，2004)，而將酪氨酸轉(zhuǎn)化成香豆酸時(shí)K^很小。具有以上動(dòng)力學(xué)特性的PAL特異性地以苯丙氨酸作為底物，并僅僅從苯丙氨酸形成肉桂酸，從酪氨酸形成香豆酸的水平檢測(cè)不到。C4H所催化的羥化酶反應(yīng)的典型轉(zhuǎn)換率在天然酵母CPR活性支持該反應(yīng)時(shí)為25摩爾香豆酸產(chǎn)物/摩爾酶/分鐘(Urban等，1994)。C4H的活性可受限于NADPH的可用性，如果過表達(dá)細(xì)胞色素P450羥化酶(CPR)則這種活性可提高。如果CPR如文獻(xiàn)所示例的那樣過表達(dá)5至20倍(Mizutani等1998，Urban等，1994)，則C4H反應(yīng)將肉桂酸轉(zhuǎn)化成香豆酸的催化轉(zhuǎn)換率分別提高到125摩爾香豆酸產(chǎn)物/摩爾酶/分鐘和530摩爾香豆酸產(chǎn)物/摩爾酶/分鐘。組合反應(yīng)PAL-C4H-CPR的結(jié)果將取決于催化數(shù)和每種酶的存在量，特別是支持為C4H供給電子(NADPH)的CPR的量。使用天然CPR活性時(shí)，高效的PAL將給出約192摩爾肉桂酸/摩爾PAL/分鐘，其后C4H酶將約25摩爾這種肉桂酸/摩爾C4H/分鐘轉(zhuǎn)化成香豆酸。因此，使用天然CPR活性，該組合反應(yīng)PAL-C4H-CPR的主要產(chǎn)物將是肉桂酸(167摩爾肉桂酸/摩爾PAL酶/分鐘和25摩爾香豆酸/摩爾C4H酶/分鐘)。如果以高水平過表達(dá)，則越高的CPR活性將導(dǎo)致越高的C4H活性/摩爾C4H酶，最終導(dǎo)致純的香豆酸。在Mizutani的論文(Mizutani等，1998)中，過表達(dá)僅5倍的CPR會(huì)導(dǎo)致125摩爾香豆酸/^爾C4H/分鐘，而從所述PAL每分鐘僅產(chǎn)生67摩爾肉桂酸。因此，為了(不期望的)純香豆酸產(chǎn)生，CPR必須至少過表達(dá)約8倍。對(duì)于帶有若干PAL/TAL和C4H的重組或天然微生物的情況，可以制備細(xì)胞提取物，并測(cè)量表觀催化轉(zhuǎn)換率和Km值作為表觀酶PAL、TAL或C4H的總和(或總和酶)。從這些估計(jì)的整體特性中將有可能確定該生物主要產(chǎn)生香豆酸還是肉桂酸，并因此確定當(dāng)在該生物中表達(dá)4CL和VST時(shí)結(jié)果將是哪種產(chǎn)物白藜,醇還是赤松素。在此，轉(zhuǎn)換率將表示為摩爾產(chǎn)物/(摩爾總蛋白/時(shí)間)，而不是使用純酶時(shí)的摩爾產(chǎn)物/(摩爾純酶/時(shí)間)。因此，對(duì)于PAL而言小于1:1的優(yōu)選比值Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)可適用于存在多于一種PAL時(shí)的總和PAL活性，大于2的優(yōu)選比值Keat(PAL)/Kcat(C4H)可適用于存在多于一種PAL和/或C4H活性時(shí)的PAL和/或C4H總和活性(通過CPR調(diào)節(jié))。優(yōu)選地，所述微生物不含有外源C4H，即未經(jīng)遺傳修飾以提供C4H酶的表達(dá)。所存在的任何C4H產(chǎn)生都將是該生物天然的。任選地，所述無外源C4H的微生物還可缺乏內(nèi)源C4H。內(nèi)源C4H的缺乏可以是由于通過遺傳工程或基因沉默方法缺失了天然C4H能力，或者僅僅是因?yàn)樵撋镉捎谠撁覆皇瞧浯x的一部分而天然地缺乏C4H基因。同時(shí)，從上文可以看出，CPR的存在對(duì)于赤松素的產(chǎn)生沒有幫助，其過表達(dá)一般不是期望的，盡管并不禁止。因此，所述微生物優(yōu)選地不具有內(nèi)源性CPR、不具有外源性CPR或沒有天然CPR過表達(dá)，或者降低了天然CPR的表達(dá)。適當(dāng)時(shí)，所述L-苯丙氨酸氨裂合酶通過編碼所述酶的對(duì)該微生物來說非天然的核酸在所述微生物中表達(dá)。優(yōu)選地，肉桂酰輔酶A在以ATP和輔酶A為底物、ADP為產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)中形成，適當(dāng)時(shí)，肉桂酰輔酶A在4-香豆酸輔酶A連接酶(也稱為4-香豆酰輔酶A連接酶)所催化的反應(yīng)中形成。已知的4-香豆酸輔酶A連接酶接受4-香豆酸或肉桂酸作為底物，并產(chǎn)生相應(yīng)的輔酶A衍生物。通常，無論是以4-香豆酸作為底物還是以肉桂酸作為底物顯示更高的活性，這些酶都稱為"4-香豆酸輔酶A連接酶"。然而，我們?cè)诒疚闹袑⒕哂羞@種底物偏好性的酶稱為"肉桂酸輔酶A連接酶，，(或肉桂酰輔酶A連接酶)。一種這樣的酶描述于例如Aneko等，2003。所述4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶可以是來自植物、微生物或線蟲的4-香豆酸輔酶A連接酶/肉桂酸輔酶A連接酶(EC6.2.1.12)。所述植物可以是以下植物屬于冷杉屬(J6/es)的植物，例如百山4且冷杉^^flAfZI^WS/s)、日本冷杉(及yf7flfl)、杉木>(5.屬于擬南芥屬(爿mAiVfe/^/s)的植物，例如擬南芥(A&fl//"wfl);屬于蕓莒屬(5m^/cfl)的植物，例如歐洲油菜(及/ffl/7ws)、蕪青(及m/m)、甘藍(lán)(及o/eni"fl);屬于柑橘屬(C7"m)的植物，例如甜橙(C.siVie"w、)；屬于落葉松屬(Z"^x:)的植物，例如歐洲落葉(1.de"Vf"fl)、落葉爭(zhēng)^(￡.g柳e/,Vi//)、西藏紅#3(丄.g/7J^^/r/"wfl)、喜瑪拉雅紅杉(Z.A/附"/fl/cfl)、日本落葉松(￡A:"e附/7/^7')、北美落葉(厶/"nW"fl)、四川紅杉(厶附"Wws/"fifl)、美國(guó)西部落葉木》(￡oc"V/e她/Zs)、紅杉(1."似iii7iz7)、信件落葉松(厶si》/Wcflf)、怒江紅杉(.s/edosfl);屬于菜豆屬(iVffl^/ws)的植物，例如Eaa/^/W/ws、荷包豆(Eoc"VieMS1);屬于松屬(戶/"Ms)的植物，例如華山松fl簡(jiǎn)fl"力7)、北美短葉松(/^a"h,Vi鼎)、海岸松(E/;/"fl他r);屬于楊屬(戶o/7w/ws)的植物，例如小葉楊(p6fl/s"脂y^fl)、毛白楊(e似附ew^sfl)、歐洲山楊(E"eww/o,V/es);屬于癡屬(5V/flww柳)的植物，例如馬鈴薯(51.似&n^iw);屬于葡萄屬(M似s)的植物，例如葡萄(W似sv/w(^m);屬于玉蜀黍?qū)?Zefl)的植物，例如玉蜀黍(Z.或者其他植物屬，例如藿香屬(Jgflstod^)、紫穗槐屬(j附^t;/^)、銀杉屬(CVi幼"j;fl)、雪*》屬()、番紅花屬()、羊茅屬(/^s似cfl)、大豆屬(G/_yc/"e)、胡桃屬(/"g/fl"s)、油杉屬(fCe/^n'")、紫草屬(丄zY/ros/;er附"挑)、黑麥草屬(o//i/i)、百脈根屬(丄C"s)、番癡屬(Z^co^mVwi)、蘋果屬(Ma/ws)、苜蓿屬(A/^f/cflgo)、日中花屬(Afese柳6，w幼e附M附)、煙草屬(7V/cC/"iifl)、長(zhǎng)苞鐵杉屬(7Vo,/iCs"gfl)、稻屬(Ofjzfl)、天竺婆屬(/W"f^/ffi)、歐芽屬(/^ms^//"i//if)、小立碗蘚屬(^PAjwwii/^^〃fl人云杉屬(朽CM)、李屬(iVwwws)、金錢松屬(i^M^/"riv)、黃杉屬(i^e"她"gfl)、玫瑰屬(及05fl)、懸鉤子屬(Jw6ws1)、ij^fl、甘蔗屬(5ViccAa/"M/ff)、械蓬屬(iS"flerffl)、鹽芥屬(77^//""g/e//fl)、小麥屬(rnY/cw附)、鐵杉屬(7i"^1)。所述微生物可以是屬于曲霉屬(J^7Wg///MS)的絲狀真菌，例如黃曲霉(A/^vws)、構(gòu)巢曲霉(A附V/m/"/w)、米曲霉(Aoo^"e)、煙曲霉(A/w附/gfl似s);屬于脈孢霉屬(iV^/nw/wm)的絲狀真菌，例如粗糙脈孢霉(TV.屬于亞羅酵母屬(Yarrowia)的真菌，例如解脂亞羅酵母(K/i^/W/cs);屬于球腔菌屬?gòu)VAfyc，Aaere〃",的真菌,例如M戸薦Vi/c^/fl;屬于分枝桿菌屬(A0;co6""^77i附)的細(xì)菌，例如牛分枝桿菌(Af.Z^v/s)、麻風(fēng)分枝桿菌/e/7ffle)、結(jié)核分枝桿菌(」化似^fTw/os/s);屬于奈瑟氏菌屬(A^/swnVi)的細(xì)菌，例如腦膜炎奈瑟氏菌(TV.附^i/wgi7/rf/s);屬于鏈霉菌屬(5^e/7to附j(luò);c^)的細(xì)菌，例如天藍(lán)色鏈霉菌(51.);屬于紅細(xì)菌屬(及/io^6""w)的細(xì)菌，例如莢膜紅細(xì)菌(及.o/;sw/"似s);屬于鉤口線蟲屬(Jwcj;/(wto/wfl)的線蟲，例如錫蘭鉤口線蟲(Aw);屬于隱桿線蟲屬(Cflew0Wifl6flf/ris)的線蟲,例如秀麗隱桿線蟲(d/"flWS);屬于血矛線蟲屬(好fleWOMcAMS)的線蟲，例如掄轉(zhuǎn)血矛線蟲(仗屬于蛆蟲5l屬(丄w柳^7'cws)的線蟲，例如丄.r屬于才艮結(jié)線蟲屬(3fei7orf(5jwe)的線蟲，例如北方才艮結(jié)線蟲(Ml/^/;/");屬于類圃線蟲屬(5^wiw/oiV/"s)的線蟲，例如鼠類圓線蟲(51.m加7)、糞類圓線蟲(5*.);屬于/V/s"VmcAMs屬的線蟲，例如A戸"yc"s1。盡管所述微生物可以是天然存在的，但優(yōu)選向所述微生物中重組引入編碼所述代謝途徑中相應(yīng)酶的至少一種基因序列的至少一個(gè)拷貝。作為引入編碼所述酶的編碼序列的補(bǔ)充或替代，可以提供不在所述生物中與所述編碼序列天然關(guān)聯(lián)的一種或多種表達(dá)信號(hào)，例如啟動(dòng)子序列。因此，任選地將編碼L-苯丙氨酸氨裂合酶的基因序列的至少一個(gè)拷貝與不在所述生物中與所述基因序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。表達(dá)信號(hào)包括位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、其中或下游(3'非編碼序列)的核普酸序列，其影響相關(guān)聯(lián)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。這樣的序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。任選地，將編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶(天然與否均可)的基因序列的至少一個(gè)拷貝與不在所述生物中與所述基因序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。任選地，將編碼芪合酶(可以是白藜,醇合酶)(天然與否均可)的基因序列的至少一個(gè)拷貝與不在所述生物中與所述基因序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。任選地，將編碼赤松素合酶(天然與否均可)的基因序列的至少一個(gè)拷貝與不在所述生物中與所述基因序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。在一些方面中，本發(fā)明提供所述類型的經(jīng)代謝改造的微生物，其具有有效的代謝途徑，其中第一代謝物在第一酶所催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第二代謝物，所述反應(yīng)步驟產(chǎn)生氨；其中第二代謝物在第二酶所催化的ATP和輔酶A為底物、ADP為產(chǎn)物的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第三代謝物；其中所述第三代謝物在第三酶所催化的以內(nèi)源性丙二酸單酰輔酶A為底物的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第四代謝物。上述微生物包括這樣的微生物包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼芪合酶(可以是白藜蘆醇合酶)的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝?；蛘?，上述微生物包括這樣的微生物包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及包含與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼赤松素合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。在本文中，術(shù)語"微生物"指微觀生物，包括細(xì)菌；微觀真菌，包括酵母。更具體地，所述微生物可以是真菌，更具體地為屬于曲霉屬(Js/^w,7/"s)的絲狀真菌，例如黑曲霉64./t/gw)、泡盛曲霉(A"myi柳o/7')、米曲霉(Aoo^j^)、構(gòu)巢曲霉(A屬于酵母屬(5Vicc^"w附j(luò);c^s)的酵母,例如酉良酒酵母(5".cerev/siW)、51.A:/""er/、5*.6"戸聽s、少孢酵母(51.ex/g冊(cè)s)、5*.s^，z/、葡萄汁酵母(51.Mvara附)；屬于克魯維酵母屬(f/wj;ve/wfy;c^)的酵母，例如乳酸克魯維酵母(兀/fl"/s)、L附flfx/fl認(rèn)s1vr.附flwVi冊(cè)s1、L幼cr附C0/mms)屬于假絲酵母屬(CflM力'^！)的酵母，例如產(chǎn)朊假絲酵母(C.""7,'s)、熱帶假絲酵母(C."o/7/c"fc)、白色假絲酵母(C.a/6/c""s)、解脂假絲酵母(C./i/w/j;"cs)、C.vem^///s;屬于畢赤酵母屬(i^A,Vi)的酵母，例如樹干畢赤酵母(EW//;,V//s)、巴斯德畢赤酵母(E/m^w7's)、Pm/^/^p/^7fl;或者其他酵母屬，例如隱球菌屬(CVy/"coco/s)、德巴利酵母屬("e^ifwiy;cM)、漢遜酵母屬(H""^""/fl)、畢赤酵母屬(/Vc/hVi)、亞羅酵母屬(Kimw/")、接合酵母屬(Z^os^cc/rtt/"麵j;c^)或裂殖酵母屬(iSc始o(jì)sflcc/rflf謂j;c^s)。就其他微生物而言，合適的絲狀真菌的非窮舉性列表如下屬于青霉屬(i^M/d///"/!!)、根霉屬(及/l/zO/uis)、鐮孢霉屬(F"mWwW)、梭孢霉屬(FmwVZ/i/附)、赤霉屬(G/Me^//fl)、毛霉屬(Afwcw)、被孢霉屬(AfoW/^^//fl)、木霉屬(7>/c/i0&/7ii")的物種。就細(xì)菌而言，合適細(xì)菌的非窮舉性列表如下屬于芽孢桿菌屬(fifl"7/"s)的物種、屬于埃希氏菌屬(五sc/iw/c/^fl)的物種、屬于乳桿菌屬(丄fl"o6flci7/ws)的物種、屬于乳球菌屬()的物種、屬于棒桿菌屬(CWj;Me6fl"en7//11)的物種、屬于醋菌屬(JcCMfl"w)的物種、屬于不動(dòng)桿菌屬(J"Vi^^i"w)的物種、屬于假單胞菌屬(戶S^M^附0聽S)的物種等。本發(fā)明的優(yōu)選微生物可以為釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉、大腸桿菌、乳酸乳桿菌(L/fl"l、)或枯草芽孢桿菌(5.)。所構(gòu)建和改造的微生物可使用公知方法進(jìn)行培養(yǎng)，包括恒化器(chemostat)、分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)等。因此，本發(fā)明包括用于產(chǎn)生赤松素的方法，包括使微生物細(xì)胞在基本不存在肉桂酸外部來源的情況下接觸碳底物，所述細(xì)胞能在該條件下產(chǎn)生赤松素，其中所述微生物可選自真菌和細(xì)菌，尤其是酵母。這樣產(chǎn)生的赤松素可任選地分離或純化，合適的方法包括使用正己烷進(jìn)行溶劑提取，其后用100%乙醚、丙酮、甲醇和7jc依次提取，以及在使用正己烷/乙酸乙酯(2/1)體系的硅膠柱上進(jìn)行層析純化(Suga等1993)。所述碳底物任選地選自由以下構(gòu)成的可發(fā)酵碳底物單糖、寡糖和多糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤蘚糖、蘇糖和/或核糖)。作為補(bǔ)充或替代，所述碳底物可選自非發(fā)酵碳底物，包括乙醇、乙酸、甘油和/或乳酸。作為補(bǔ)充或替代，所述非發(fā)酵碳底物可選自氨基酸，并可以是苯丙氨酸。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括用于通過異源表達(dá)編碼苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸輔酶A連接酶和白藜聲醇合酶的核苷酸序列來產(chǎn)生赤松素的方法，以及通過異源表達(dá)編碼苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸輔酶A連接酶和赤松素合酶的核苷酸序列來產(chǎn)生赤松素的方法。赤松素(包括這樣產(chǎn)生的赤松素)可在食品(例如乳制品或飲料如嘩酒或葡萄酒)中作為營(yíng)養(yǎng)物。因此，本發(fā)明包括含有通過微生物產(chǎn)生的赤松素的食品。本發(fā)明還包括包含微生物細(xì)胞和至少1.5mg/g赤松素(基于干重)的微生物組合物。例如，可以提供含有赤松素(或這樣產(chǎn)生的赤松素)的酵母或含有酵母或來源于酵母的制劑，以供人或動(dòng)物消費(fèi)，例如為干燥形式，適當(dāng)時(shí)為單位經(jīng)口劑型，例如含有酵母的片劑或膠嚢劑，其中可含有如至少0.5g所述酵母，例如l-3g。本文提及的任何野生型酶均可被其突變體形式替換，所述突變體形式適當(dāng)時(shí)與所提及的野生型酶具有至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80。/。、更優(yōu)選至少90o/?；蛑辽?5。/。的氨基酸同源性，而同時(shí)當(dāng)然仍保留野生型的所需酶活性。這可包括保留野生型的任何底物偏好性，例如對(duì)苯丙氨酸相對(duì)于酪氨酸的偏好性，或者對(duì)肉桂酸相對(duì)于香豆酸的偏好性，或者對(duì)肉桂酰輔酶A相對(duì)于香豆酰輔酶A的偏好性。編碼本文提及酶的任何野生型編碼序列均可被編碼相同的酶但密碼子使用(codonusage)經(jīng)過調(diào)整的序列替換。這對(duì)上文討論的野生型酶及突變體形式均適用。編碼野生型酶的突變體形式的核苷酸序列優(yōu)選與編碼相應(yīng)野生型酶的野生型核苷酸序列具有至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80。/。、更優(yōu)選至少卯。/?；蛑辽?5%的同源性程度。酶的突變體形式可以具有與野生型酶相比沒有大改變的酶活性水平，或者可以選擇成具有更高的活性水平?？梢愿鶕?jù)已知的實(shí)踐進(jìn)行野生型酶的保守性氨基酸替換。具有提高活性的酶可通過本領(lǐng)域已知的定向演化技術(shù)來開發(fā)，酶中的隨機(jī)改變可通過諸如以下的方法來產(chǎn)生在適當(dāng)?shù)臏y(cè)試生物如大腸桿菌或釀酒酵母中在編碼該酶的序列中引入隨機(jī)基因改變，隨后表達(dá)，并通過篩選期望的特性來選擇提高的突變體，或者通過施加在該條件下表達(dá)提高活性的生物將具有存活優(yōu)勢(shì)的自選擇條件來選擇。本文中提及的不存在或基本不存在或缺乏物質(zhì)(如肉桂酸)供應(yīng)包括基本不存在可代謝成該物質(zhì)或是該物質(zhì)進(jìn)一步代謝之直接產(chǎn)物的其衍生物，例如肉桂酸酯(包括硫酯)，例如肉桂酰輔酶A。特別的，缺乏肉桂酸暗示缺乏肉桂酰輔酶A。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的赤松素可以是順式或反式赤松素，預(yù)期它們分別由順式肉桂酸和反式肉桂酸形成?；蛘撸梢酝ㄟ^包括異構(gòu)化的方法由反式肉桂酸形成順式赤松素。但預(yù)期反式形式通常是主要的。為了便于理解本發(fā)明的以上描述，參考以下附圖，其中圖1顯示赤松素的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖2顯示利用作用于香豆酰輔酶A的白藜？醇合酶產(chǎn)生白藜蘆醇的苯基丙烷類途徑；和圖3顯示利用作用于肉桂酰輔酶A的赤松素合酶或白藜^醇合酶產(chǎn)生赤松素的苯基丙烷類途徑。圖4顯示在100g/1半乳糖上培養(yǎng)的釀酒酵母菌林FSSC-PAL4CLVST1的上清液及細(xì)胞提取物的HPLC層析圖。包括60ng純赤松素的層析圖。圖5顯示在100g/1半乳糖上培養(yǎng)的釀酒酵母菌林FSSC-PAL4CLRES的細(xì)胞提取物的HPLC層析圖。包括60ng純赤松素的層析圖。圖6顯示純赤松素以及由在100g/1半乳糖上培養(yǎng)的釀酒酵母菌林FSSC-PAL4CLVST1所產(chǎn)生的赤爭(zhēng)》素的LC-MS數(shù)據(jù)。顯示了基峰層析圖和M/Z211.0759Da/e處的負(fù)離子痕跡。圖7顯示了得自實(shí)施例16的HPLC層析圖。圖8顯示了產(chǎn)生赤松素的大腸桿菌菌林(上圖)和對(duì)照菌林(下圖)的發(fā)酵物的提取產(chǎn)物的HPLC分析。本發(fā)明將通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述和舉例說明。實(shí)施例實(shí)施例1分席濕竭iMZ、4CX、及^^々Ky77嫂差厲使用表l所述引物，通過PCR從擬南芥cDNA(BioCat，Heidelberg,Germany)中分離苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)(Cochrane等，2004;SEQIDNO:1、2)、4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CLl)(Hamberger和Hahlbrock2004;Ehlting等，1999;SEQIDNO:3、4)。在若干擬南芥同源物中選擇PAL2和4CL1，因?yàn)樗鼈兎謩e具有有利于通向肉桂酸和肉桂酰輔酶A的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Cochrane等，2004;Hamberger和Hahlbrock2004;Ehlting等，1999)。使用www.entelechon.com的在線服務(wù)反翻譯工具，對(duì)來自圓葉大黃(及/^"附)的白藜蘆醇合酶(RES)編碼序列(Samappito等2003;SEQIDNO:5、6)進(jìn)行用于釀酒酵母表達(dá)的密碼子優(yōu)化，得到序列SEQIDNO:7、8。用于裝配合成基因的寡核苷酸在MWGBiotech構(gòu)建，使用下述來自Martin等(2003)的稍加修改的方法操作，通過PCR裝配合成基因。表l:用于擴(kuò)增基因的引物和限制性位點(diǎn)用于擴(kuò)增基因的引物^(限制性位點(diǎn)加有下劃線)基因限制性位點(diǎn)引物限制性位點(diǎn)栽體5'-CGGAATTCTCATGGATCAAATCGAAGCAATGTTPAL2EcoRlEcoRl5'-CGACTAGTTTAGCAAATCGGAATCGGAGCPAL2SpelSpel5'-GCTCTAGACCTATGGCGCCACAAGAACAAGCAGTTT4CIilXbalSpel5'-GCGGATCCCCTTCACAATCCATTTGCTAGTTTTGCC4CL1BamHlBgl工工5'-CCGGATCCAAATGGCCCCAGAAGAGAGCAGGRESBamHlBamHl5'-CGCTCGAGTTAAGTGATCAATGGAACCGAAGACAGRESXholXhol*SEQIDNo11-16將來自MWG的用于裝配合成基因的引物溶于milliQ水至濃度為100pmole/nl。將每種引物5pi的等分試樣與總混合物(totalmix)組合，接4用milliQ水稀釋10倍。每50nl使用5pi稀釋的總混合物作為模板并與融合DNA聚合酶(Finnzymes)合并，通過PCR裝配所述基因。PCR程序如下首先98X^30秒，接著為秒、40XM分鐘和72■CI分鐘/1000堿基對(duì)的30個(gè)循環(huán)，最后72^5分鐘。對(duì)于得到的PCR反應(yīng)，將20nl在lo/。瓊脂糖凝膠上純化。結(jié)果為PCR彌散帶，從瓊脂糖凝膠上切下期望大小附近的區(qū)域，使用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。最后使用表1中外部引物的PCR獲得了所需的RES29基因。使用Quickchange定點(diǎn)i秀變II試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)校正點(diǎn)突變。由GenScriptCorporation(Piscataway,NJ)合成編碼葡萄(版sW"ymi)白藜蘆醇合酶的VST1基因(Hain等1993)。使用該氨基酸序列(SEQIDNO:IO)作為模板來產(chǎn)生用于釀酒酵母表達(dá)的經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成基因(SEQIDNO:9)。將合成VST1基因遞送并插入大腸桿菌pUC57載體，側(cè)翼為BamHl和Xhol限制性位點(diǎn)。通過BamHl/Xhol限制性處理從pUC57載體中純化該合成基因，并使用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中純化。實(shí)施例2#建,于4這/M"使用帶有包含EcoRl和Spel限制性位點(diǎn)的5，突出的正向和反向引物(表l)，通過PCR再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼PAL2的基因。用EcoRl/Spel消化所擴(kuò)增的PAL2PCR產(chǎn)物，并連接進(jìn)經(jīng)EcoRl/Spel消化的pESC-URA載體(Stratagene)，得到載體pESC-URA-PAL2。通過對(duì)兩個(gè)不同克隆的測(cè)序來驗(yàn)證基因序列。實(shí)施例3游建^于4這4CX2辨脊母戎謬如實(shí)施例1所述分離編碼4CL1的基因。用Xbal/BamHl消化所擴(kuò)增的4CL1產(chǎn)物，并連接進(jìn)經(jīng)Spel/Bglll消化的pESC-TRP載體(Stratagene),得到載體pESC-TRP-4CLl。對(duì)兩個(gè)不同的pESC-TRP-4CLl克隆進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證所克隆基因的序列。實(shí)施例4和i^S辨脊母裁'謬如實(shí)施例1所述分離編碼RES的基因。用BamHl/Xhol消化所擴(kuò)增的合成RES基因，并連接進(jìn)經(jīng)BamHl/Xhol消化的pESC-TRP-4CLl(實(shí)施例3)。所得到的質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-RES含有發(fā)散的GAL1/GAL10啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1和RES的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同的pESC-TRP-4CLl-VSTl克隆進(jìn)行測(cè)序來驗(yàn)證編碼VST1的基因序列。實(shí)施例5游^^于4這4CX/和KS77如實(shí)施例1所述分離編碼VST1的基因。將經(jīng)純化和消化的VST1基因連接進(jìn)經(jīng)BamHl/Xho1消化的pESC-TRP-4CLl(實(shí)施例3)。所得質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl含有發(fā)散的GAL1/GAL10控制下的編碼4CL1和VST1的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同的pESC-TRP-4CLl-VSTl克隆進(jìn)行測(cè)序來驗(yàn)證編碼VST1的基因序列。實(shí)施例6炎^/M丄2、4CXJ和及五S在璩^發(fā)母"^在這^/^殺在、素的途徑分開或組合地用實(shí)施例2、3和4所述載體轉(zhuǎn)化含有適當(dāng)遺傳標(biāo)記的酵母菌林。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，使用感受態(tài)細(xì)胞，或者例如通過電穿孔(參閱如Sambrook等，1989)。在缺乏尿嘧咬和/或色氨酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，并在相同培養(yǎng)基上劃線純化。用pESC-URA-PAL2(實(shí)施例2)和pESC-TRP-4CLl-RES(實(shí)施例4)共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林FS01267(MATatrplura3)，轉(zhuǎn)化菌林命名為FSSC-PAL24CL1RES。實(shí)施例7炎^iM丄2、4CXJ々KS77在^潘發(fā)母一^t這if/^#在、#^_^逸分開或組合地用實(shí)施例2、3和5所述載體轉(zhuǎn)化含有適當(dāng)遺傳標(biāo)記的酵母菌林。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，使用感受態(tài)細(xì)胞，或者例如通過電穿孔(參閱如Sambrook等，1989)。在缺乏尿嘧咬和/或色氨酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，并在相同培養(yǎng)基上劃線純化。用pESC-URA-PAL2(實(shí)施例2)和pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林FS01267(MATatrplura3),轉(zhuǎn)化菌林命名為FSSC國(guó)PAL24CX1VST1。實(shí)施例8在凝威^炎眉f逸發(fā)母霧禱迷^^發(fā)使用無菌接種環(huán)從瓊脂平板上接種重組酵母菌林并在100ml成分確定的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Verduyn等，1992),該培養(yǎng)基中含有維生素、微量元素、5g/l葡萄糖、95g/l半乳糖。將500ml塞緊瓶塞的搖瓶在30t:和160rpm下孵育3天。實(shí)施例9a)通過5000g離心5分鐘來收獲細(xì)胞。將50ml上清液等分試樣4吏用20ml乙酸乙酯萃取一次。將乙酸乙酯凍千，將干產(chǎn)物重溶于0.7ml甲醇中，并過濾到HPLC管中。將來自100ml培養(yǎng)基的細(xì)胞沉淀溶于2ml水中，并分到三個(gè)快速制備管中，用玻璃珠破碎。將來自這三個(gè)管的粗提物合并到50mlSartorius管中的10ml100%曱醇中，并在4"C下在冷的暗室中在旋轉(zhuǎn)室中提取48小時(shí)。48小時(shí)后，5000g離心5分鐘除去細(xì)胞碎片，凍干過夜除去曱醇。將干燥的殘留物重溶于0.7ml甲醇中并過濾到HPLC管中。b)分析赤松素HPLC對(duì)于肉桂酸、香豆酸和赤松素的定量分析，將樣品置于高效液相層析(HPLC)Agilent1100系列系統(tǒng)(HewlettPackard),之后在k=306nm處進(jìn)行uv二極管陣列檢測(cè)。在40匸下使用Phenomenex(Torrance,CA，USA)Luna3微米C18(100x2.00mm)柱。使用0.4ml/分鐘流速的乙腈和miUiq水(均含有50ppm三氟乙酸)梯度作為流動(dòng)相。梯度模式為20分鐘中從15%乙腈到100o/q乙腈的線性梯度。洗脫時(shí)間對(duì)于反式赤松素來說約為8.8至8.9分鐘。純赤松素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)購(gòu)自ArboNova(Turku,Finland).LC-MS在具有與Agilent1100HPLC系統(tǒng)(AgilentTechnologiesWalbron，Germany)偶聯(lián)的LocksprayTM參比探頭的Waters(Micromass,Manchester,UK)LCTTM飛行時(shí)間質(zhì)鐠儀上通過負(fù)離子電噴霧LC-MS分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。在0.3ml/分鐘下使用水-乙腈梯度，在裝有4mmx2mmIDSecurityGuardTM預(yù)制柱(Phenomenex，USA)的50mmx2mmIDLunaC-18(II)柱(Phenomenex，USA)上進(jìn)行分離。兩種洗脫液均含有20mM曱酸。溶劑組成在20分鐘中從注入時(shí)的15%乙腈變成100%乙腈，然后維持5分鐘，再將梯度變回起始條件。在所有情況下，均注入3nl樣品并將所述柱保持在40lC。所有化學(xué)品均為HPLC級(jí)，并溶于Milli-QTM水中。以4nm的解析度，以2個(gè)鐠/秒在200-700nm處采集UV鐠。將質(zhì)譜儀調(diào)成負(fù)離子電噴霧模式的最高靈敏度，對(duì)亮氨酸腦啡肽溶液為高于5500FWH的分辨率(0.5ng/ml，在含有0.5%甲酸的50%乙腈中)。所述溶液還在LocksprayTM中以15jd/分鐘在負(fù)離子ESI中用作質(zhì)量參比。該儀器在負(fù)離子ESI中以50%乙腈中的羧化PEG混合物校準(zhǔn)。在兩種情況下，該校準(zhǔn)在至少25種校準(zhǔn)離子中的殘差小于2mDa。將運(yùn)行條件選擇成用于最低源內(nèi)斷裂。以0.1秒掃描間隔時(shí)間，以0.4秒/i普在100至卯0Da/e收集質(zhì)鐠。每3秒從LockmassTM探針收集參比譜，將10個(gè)參比譜平均后作為內(nèi)質(zhì)量校正。使用預(yù)計(jì)代謝物的質(zhì)子化或去質(zhì)子化質(zhì)量+/-25mDa抽取窄離子痕跡。結(jié)果如實(shí)施例8所述在100g/1半乳糖中培養(yǎng)菌抹FSSC-PAL24CL1RES和FSSC-PAL24CL1VST1，并分析其赤松素含量。此外，還包括了僅含有空載體的對(duì)照菌林FSSC-對(duì)照。HPLC分析顯示，菌林FSSC-PAL24CL1VST1和FSSC-PAL24CL1RES中含有與反式赤爭(zhēng)>素相同的8.8-9.0分鐘駐留時(shí)間的組分(圖4和5)。所述結(jié)果被LC-MS分析證實(shí)，顯示菌林FSSC-PAL24CL1VST1的上清液中存在駐留時(shí)間8.2分鐘的組分，其M/Z為211.0579Da/e±25mDA,事實(shí)上與陰離子模式中純赤松素的M/Z—致(圖6)。此外，UV吸收譜也與純反式赤松素(未顯示)的吸收鐠相似，Xmax約為306nm。因此，結(jié)果顯示釀酒酵母中存在活躍的苯基丙烷類途徑，導(dǎo)致在體內(nèi)產(chǎn)生反式赤松素。很可能可以通過在分批和連續(xù)培養(yǎng)中在良好確定的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)菌抹和/或優(yōu)化各個(gè)酶的表達(dá)/活性來改進(jìn)赤松素的產(chǎn)生。實(shí)施例10fl)游建^f在義靡并,哞《這iMZ^辨勿霧我謬以下實(shí)施例中使用的質(zhì)粒含有一種或多種標(biāo)記基因，使得可以將帶有它們的微生物從不帶有它們的微生物中選擇出來。選擇系統(tǒng)是基于顯性標(biāo)記，例如針對(duì)氨千青霉素和卡那霉素的抗性。此外，該質(zhì)粒中含有允許表達(dá)重組基因的啟動(dòng)子及終止子序列。此外，該質(zhì)粒中含有輔助克隆DNA片段及隨后鑒定重組體的合適獨(dú)特限制性位點(diǎn)。在本實(shí)施例中，含有氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒命名為pET16b(Novagen)和含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒命名為pET26b(Novagen)。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-PAL2(實(shí)施例2)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼PAL2的基因。在所述基因5，和3'末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)含有T7啟動(dòng)子的經(jīng)消化pET16B載體。所得質(zhì)粒pET16B-PAL2含有T7啟動(dòng)子控制下的編碼PAL2的基因。W種^^f在義應(yīng)并麥^4這^CU和K5T7使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼4CL1的基因。在所述基因5'和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化pET26B載體。所得質(zhì)粒pET26B-4CLl含有來自乳酸乳桿菌的T7啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1的基因。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼VST1的基因。在所述基因5'和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化pET16B載體。所得質(zhì)粒pET16B-VSTl含有T7啟動(dòng)子控制下的編碼VST1的基因。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pET16B-VSTl作為一個(gè)片段再擴(kuò)增T7啟動(dòng)子和編碼VST1的基因。在所述DNA片段5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的質(zhì)粒pET26B-4CLl。所得質(zhì)粒pET26B-4CLl-VSTl含有各自在T7啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1和VST1的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同的pET26B-4CLl-VSTl克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證了編碼4CL1和VST1的基因的序列。c)在大腸桿菌中表達(dá)通向赤松素的途徑分開或組合地用(a)和(b)所述載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株。細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，通過使用感受態(tài)細(xì)胞或者例如使用電穿孔(參閱如Sambrook等，1989)。在含有氨節(jié)青霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體，并在相同培養(yǎng)基上劃線純化。用載體pET16B畫PAL2(a)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌林BL21(DE3)，得到菌林FSEC-PAL2;并用pET26B-4CLl-VSTl(b)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到菌株FSEC-4CL1VST1。此外用pET16B國(guó)PAL2(a)和pET26B-4CLl-VSTl(n)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),轉(zhuǎn)化菌林命名為FSEC-PAL24CL1VST1。d)在發(fā)酵罐中使用重組大腸桿菌菌林進(jìn)行發(fā)酵所述重組酵母菌林可在以分批、補(bǔ)料分批或恒化培養(yǎng)方式運(yùn)行的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在本例中，發(fā)酵在搖瓶中進(jìn)行。在含有100jig/ml氨節(jié)青霉素和60ng/ml卡那霉素的7mlLB培養(yǎng)基中，以160rpm和37匸培養(yǎng)大腸軒菌BL21.(DE3)的預(yù)培養(yǎng)物。使用指數(shù)生長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)物接種500ml振蕩搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了50g/1葡萄糖、5g/1K2HP04、80jig/ml氨節(jié)青霉素和50ng/ml卡那霉素的200mlLB培養(yǎng)基，將振蕩搖瓶(baffledshakeflask)以160rpm在37匸下孵育。5小時(shí)后，添加異丙基(p-硫代半乳糖苷)(IPTG)至終濃度1mM，作為三種基因PAL2、4CL1和VST1每一個(gè)之前的T7啟動(dòng)子的i秀導(dǎo)物。以371C孵育48小時(shí)后，收獲細(xì)胞并進(jìn)行提取操作，并分析所產(chǎn)生赤松素的存在情況。e)提取并分析大腸桿菌中的赤松素提取和分析使用如實(shí)施例9所述的方法進(jìn)行。圖9的上圖和下圖分別顯示使用所述改造菌株和含有空質(zhì)粒的對(duì)照菌林的發(fā)酵物中所提取材料進(jìn)行的HPLC結(jié)果。圖中標(biāo)出了赤松素和肉桂酸的產(chǎn)生。實(shí)施例11^詢建^f在我^惑^^^^這iM"時(shí)勿,裁體以下實(shí)施例中使用的質(zhì)粒pSH71及其衍生物是雙功能穿梭載體，具有來自大腸桿菌和乳酸乳桿菌的多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。這樣，宿主范圍跨越了大腸桿菌和其他乳酸菌物種。在乳酸乳球菌中通常沒有問題，而在其他乳酸菌物種中可能的轉(zhuǎn)化困難可通過使用大腸桿菌作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的中間宿主來克服。該質(zhì)粒含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，以使得可以將帶有所述標(biāo)記基因的微生物從不帶有它們的微生物中選擇出來。用于乳酸乳球菌的選擇系統(tǒng)是基于顯性標(biāo)記，例如針對(duì)紅霉素和氯霉素的抗性，但也已描述了基于涉及碳水化合物代謝、肽酶和食品級(jí)標(biāo)記之基因的系統(tǒng)。此夕卜，該質(zhì)粒中含有允許表達(dá)重組基因的啟動(dòng)子及終止子序列。合適的啟動(dòng)子可取自乳酸乳球菌基因，例如/"d。此外，該質(zhì)粒含有合適的獨(dú)特限制性位點(diǎn)，以便于克隆DNA片段和其后鑒定重組體。在下文的方法中，含有紅霉素抗性基因的質(zhì)粒命名為PSH71-ERY1"或含有氯霉素抗性基因的質(zhì)粒命名為pSH71-CM、使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-PAL2(實(shí)施例2)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼PAL2的基因。在所述基因5，和3'末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)含有乳酸乳球菌/"d啟動(dòng)子的經(jīng)消化pSH71-ERYr載體。所得質(zhì)粒pSH71-ERY匕PAL2含有乳酸乳球菌/ac^啟動(dòng)子控制下的編碼PAL2的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同的pSH71-ERY^PAL2克隆測(cè)序來驗(yàn)證編碼PAL2的基因的序列。b)構(gòu)建用于在乳酸乳球菌中表達(dá)4CL1和VST1的細(xì)菌載體使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼4CL1的基因。在所述基因5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的pSH71-CM""載體。所得質(zhì)粒pSH71-C!Vr-4CLl含有乳酸乳球菌/flcJ啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1的基因。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5'突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼VST1的基因。在所述基因5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的pSH71-ERYr載體。所得質(zhì)粒pSH71-ERYr-VSTl含有乳酸乳球菌/fld啟動(dòng)子控制下的編碼VST1的基因。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5'突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pSH71-ERY^VSTl作為一個(gè)片段的啟動(dòng)子和編碼VST1的基因。^所述DNA片段的5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的質(zhì)粒pSH71-CMr-4CLl。所得質(zhì)粒pSH71-CM""-4CLl-VSTl含有其各自啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1和VST1的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同pSH71-CMr-4CLl-VSTl克隆測(cè)序來驗(yàn)證編碼4CL1和VST1的基因序列。c)在乳酸乳球菌中表達(dá)通向赤松素的途徑分別或組合地用如實(shí)施例16和17所述載體轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌林。細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，通過使用感受態(tài)細(xì)胞或者例如使用電穿孔(參閱如Sambrook等，1989)。在含有紅霉素和氯霉素的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體，并在相同培養(yǎng)基上劃線純化。用載體pSH71-ERY""-PAL2(實(shí)施例16)轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌林MG1363,得到菌林FSLL-PAL2。另外，用pSH71-ERYr-PAL2(實(shí)施例16)和pSH71-CM""-4CLl-VSTl(實(shí)施例17)共轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌林MG1363,轉(zhuǎn)化菌林命名為FSLL-PAL24CL1VST1。d)在發(fā)酵罐中用重組乳酸乳球菌進(jìn)行發(fā)酵可以在以分批、補(bǔ)料分批或恒化培養(yǎng)方式運(yùn)行的發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組的乳球菌菌林。分批及補(bǔ)料分批培養(yǎng)在厭氧、需氧或微需氧條件下，以1.5升工作體積在帶擋板的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)微生物。所有的培養(yǎng)物均在301C以350rpm孵育。通過自動(dòng)添加IOMKOH維持6.6的恒定pH。在補(bǔ)充了以下成分以允許在需氧條件下生長(zhǎng)的成分確定的MS10培養(yǎng)基中以乳糖來培養(yǎng)細(xì)胞MnS04(1.25xl(T5g/l)、硫胺素(lmg/l)和DL畫6，8-硫辛酸(2.5mg/1)。乳糖濃度為例如50g/1。用來自預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞接種生物反應(yīng)器，所述預(yù)培養(yǎng)物在30"C下在以三倍濃度K2HPO4和KH2PO4緩沖的含有上述培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)。通過以下步驟確保厭氧條件:接種前用N2(純度99.998%)進(jìn)行灌沖，在培養(yǎng)過程中在生物反應(yīng)器頂部空間中維持50ml/分鐘的&恒流。用于微需氧和需氧培養(yǎng)的生物反應(yīng)器裝有以空氣(DOT，100%)和N2(DOT,0%)校準(zhǔn)的極鐠氧傳感器。通過以1vvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入空氣以確保DOT高于80%來獲得需氧條件。在微需氧實(shí)驗(yàn)中，通過以0.25vvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入由N2和空氣組成的氣體混合物將DOT保持5%恒定。恒化培養(yǎng)在恒化培養(yǎng)中，細(xì)胞可在例如30C和350rpm下在1L工作體積的A卯likon實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐中培養(yǎng)。稀釋速率(D)可以設(shè)置成不同的值，例如0.050h1、0.10h1、0.15h1或0.20h1。使用補(bǔ)充有50jil/L消泡劑的上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基，通過自動(dòng)添加5MKOH使pH保持恒定，例如保持為6.6。乳糖的濃度可設(shè)置成不同值，例如3.0g/1、6.0g/1、12.0g/1、15.0g/1或18.0g/1。接種生物反應(yīng)器至起始生物量濃度為1mg/1,在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)打開補(bǔ)料泵。通過向生物反應(yīng)器的頂部空間引入50ml/分鐘的N2(純度99.998%)來獲得厭氧穩(wěn)態(tài)?？梢酝ㄟ^噴入250ml/分鐘由不同比例的N2(純度99.998%)及空氣所組成的氣體來獲得不同的缺氧穩(wěn)態(tài)。通過向生物反應(yīng)器中噴入空氣(100%DOT)和N2(0%DOT)來校準(zhǔn)氧電極。對(duì)于所有的條件，氣體在引入生物反應(yīng)器之前均除菌過濾。廢氣通過冷卻至-8lC以下的冷凝器排出，并通過聲學(xué)氣體分析儀分析其co2和02的體積含量。在至少5個(gè)駐留時(shí)間之后并且如果生物量及發(fā)酵終產(chǎn)物的濃度在最后兩個(gè)駐留時(shí)間中保持不變(相對(duì)偏差小于5%)，則認(rèn)為培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)。e)提取和分析乳酸乳球菌中的赤松素使用如實(shí)施例9所述方法進(jìn)行提取和分析。實(shí)施例12a)構(gòu)建用于在曲霉屬物種中表達(dá)PAL2的真菌載體本實(shí)施例中使用的質(zhì)粒來自pARpl，其含有來自構(gòu)巢曲霉的AMA1復(fù)制起始序列，它還在黑曲霉和米曲霉中保持自主質(zhì)粒復(fù)制(Gems等，1991)。此外，該質(zhì)粒為穿梭載體，其含有大腸桿菌復(fù)制序列，因此可以使用大腸桿菌作為中間宿主來構(gòu)建重組質(zhì)粒，從而克服在黑曲霉和米曲霉中固有的轉(zhuǎn)化困難。該質(zhì)粒含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，其允許將帶有所述選擇標(biāo)記的微生物從不帶有它們的微生物中選擇出來。選擇系統(tǒng)可基于顯性標(biāo)記(如針對(duì)潮霉素B、腐草霉素和博來霉素的抗性)或異源標(biāo)記(如氨基酸和/^K基因)。此外，該質(zhì)粒含有允許表達(dá)重組基因的啟動(dòng)子及終止子序列。合適的啟動(dòng)子可取自構(gòu)巢曲霉基因，例如"/cJ、g/aj、fl/ifj;、wiVLD和g/7^L4。此外，該質(zhì)粒含有合適的獨(dú)特限制性位點(diǎn)，以便于克隆DNA片段和其后鑒定重組體。該質(zhì)粒含有強(qiáng)組成型g/""啟動(dòng)子和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，均來源于構(gòu)巢曲霉；含有參與甲硫氨酸生物合成的基因的質(zhì)粒命名為pAMAl-MET;含有參與組氨酸生物合成的基因/i/W的質(zhì)粒命名為pAMAl畫HIS。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-PAL2(實(shí)施例2)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼PAL2的基因。在所述基因5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的pAMAl-MET載體。所得質(zhì)粒pAMAl-MET-PAL2含有構(gòu)巢曲霉朋<"啟動(dòng)子控制下的編碼PAL2的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同的pAMAl-MET-PAL2克隆測(cè)序來驗(yàn)證編碼PAL2的基因的序列。b)構(gòu)建用于在屬于曲霉屬的物種中表達(dá)4CL1和VST1的真菌載體使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼4CL1的基因。在所述基因5，和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的pAMAl-HIS載體，該載體含有來自構(gòu)巢曲霉的砂W啟動(dòng)子。所得質(zhì)粒pAMAl-HIS-4CLl含有構(gòu)巢曲霉砂<"啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1的基因。使用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5'突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)再擴(kuò)增如實(shí)施例1所述分離的編碼VST1的基因。在所述基因5'和3，末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的pAMAl-MET載體，得到pAMAl-MET-VSTl。4吏用帶有包含適當(dāng)限制性位點(diǎn)的5'突出端的正向及反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pAMAl-MET-VSTl作為一個(gè)片段的啟動(dòng)子和編碼VST1的基因。在所述DNA片段的5，和3'末端引入所述限制性位點(diǎn)使得可以將經(jīng)限制性處理的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)經(jīng)消化的質(zhì)粒pAMAl-HIS-4CLl。所得質(zhì)粒pAMAl-HIS-4CLl-VSTl含有其各自構(gòu)巢曲霉/;g^4啟動(dòng)子控制下的編碼4CL1和VST1的基因。通過對(duì)兩個(gè)不同pAMAl-HIS-4CLl-VSTl克隆測(cè)序來驗(yàn)證編碼4CL1和VST1的基因序列。c)在黑曲霉中表達(dá)通向赤松素的途徑分開或組合地用(a)和(b)所述栽體轉(zhuǎn)化黑曲霉菌林。真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如通過電穿孔或者接合(參閱如Sambrook等，1989)。在缺乏甲硫氨酸和/或組氨酸的基本培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體。分別用(a)pAMAl-MET-PAL2載體轉(zhuǎn)化組氨酸及甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型黑曲霉，例如菌株FGSCA919(參閱http:〃www.fgsc.net),得到菌林FSAN-PAL2，和(b)用pAMAl-HIS-4CLl-VSTl轉(zhuǎn)化，得到菌林FSAN-4CL1VST1。此夕卜，用pAMAl-MET隱PAL2(a)和pAMAl-HIS-4CLl-VSTl(b)共轉(zhuǎn)化黑曲霉菌林FGSCA919，得到的轉(zhuǎn)化菌林命名為FSAN-PAL24CL1VST1。實(shí)施例13在^曲#吵4這if/^#松#辨逸徑用載體pAMAl-MET-VSTl(實(shí)施例29)轉(zhuǎn)化含有編碼PAL2和4CL1的一組天然基因并且是甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的米曲霉菌林(Seshime等，2005),得到菌株FSAO-VSTl。真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如通過電穿孔或通過接合(參閱如Sambrook等,1989)。在缺少甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例14在復(fù)發(fā)攀尹^重逸^曲,和術(shù)曲#,#迷存發(fā)'^可以在以分批、補(bǔ)料分批或恒化培養(yǎng)方式運(yùn)行的發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組曲霉菌抹。分批及補(bǔ)料分批培養(yǎng)在需氧條件下，在1.5升工作體積的帶擋板生物反應(yīng)器中培養(yǎng)微生物。所有的培養(yǎng)物均在30"C以500rpm孵育。通過自動(dòng)添加10MKOH維持6.0的恒定pH，通過以1vvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入空氣以確保DOT高于80%來獲得需氧條件。在補(bǔ)充了以下成分以允許在分批培養(yǎng)下生長(zhǎng)的成分確定的培養(yǎng)基中以葡萄糖來培養(yǎng)細(xì)胞7.3g/1(NH4)2S04、1.5g/lKH2P04、1.0g/lMgSO47H20、1.0g/lNaCl、0.1g/1CaCl22H20、0.1ml/1Sigma消泡劑、7.2mg/1ZnS047H20、1.3mg/1CuS045H20、0.3mg/1MC126H20、3.5mg/1MnCl24H20和6.9mg/1FeS04.7H20。葡萄糖濃度為例如IO、20、30、40或50g/1。為在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中進(jìn)行生長(zhǎng)，在分批期中培養(yǎng)基由以下成分組成7.3g/1(NH4)2S04、4.0g/lKH2P04、1.9g/1MgS047H20、1.3g/lNaCl、0.10g/1CaCl22H20、0.1ml/1Sigma消泡劑、7.2mg/1ZnS047H20、1.3mg/1CuS045H20、0.3mg/1MC126H20、3.5mg/1MnCl24H20和6.9mg/1FeS04H20。然后，向反應(yīng)器中補(bǔ)充例如285g/kg葡萄糖和42g/kg(NH4)2S04。使用來自分批培養(yǎng)的游離菌絲體接種分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)物。使用2xl(^個(gè)孢子/1的孢子濃度接種pH2.5的預(yù)分批培養(yǎng)物(pre-batchculture)。通過在加入以下組分的29g稻米上繁殖凍干的孢子來獲得孢子6ml15g/1蔗糖、2.3g/1(NH4)2S04、1.0g/1KH2P04、0.5g/1MgS047H20、0.50g/1NaCl、14.3mg/1ZnS047H20、2.5mg/CuS045H20、0.50mg/1NiCl26H20和13.8mg/1FeS04.7H20。將孢子在30"C下繁殖7-14天，以在稻谷上獲得黑色孢子層，并通過加入IOOml無菌水中的0.1。/。Tween20進(jìn)行收獲。對(duì)于所有的條件，氣體在導(dǎo)入生物反應(yīng)器之前進(jìn)行除菌過濾。廢氣通過冷卻至-8"C以下的冷凝器排出，并通過聲學(xué)氣體分析儀分析C02和02的體積含量。恒化培養(yǎng)在恒化培養(yǎng)中，細(xì)胞可在例如30X:和500rpm下在1.5L工作體積的BiostatB實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐中培養(yǎng)。通過自動(dòng)添加10MKOH維持6.0的恒定pH,通過以lvvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入空氣以確保DOT高于80%來獲得需氧條件。稀釋速率(D)可以設(shè)置成不同的值，例如0.050h1、0.10h1、0.15h"或0.20h1。使用含有以下組分的基本生長(zhǎng)培養(yǎng)基，通過自動(dòng)添加10MKOH使pH保持恒定，例如保持為6.6:2.5g/1(NH4)2S04、0.75g/1KH2P04、1.0g/1MgS047H20、1.0g/1NaCl、0.1g/1CaCl22H20、0.1ml/1Sigma消泡劑、7.2mg/1ZnS047H20、1.3mg/1CuS04.5H20、0.3mg/1MC126H20、3.5mg/1MnCl24H20和6.9mg/1FeS047H20。葡萄糖濃度可設(shè)置成不同值，例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或18.0g/l。如上述用來自預(yù)分批培養(yǎng)物的游離菌絲體接種生物反應(yīng)器，在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)打開補(bǔ)料泵。對(duì)于所有的條件，氣體在導(dǎo)入生物反應(yīng)器之前除菌過濾。廢氣通過冷卻至-8lC以下的冷凝器排出，并通過聲學(xué)氣體分析儀分析C02和02的體積含量。在至少5個(gè)駐留時(shí)間之后并且如果生物量及發(fā)酵終產(chǎn)物的濃度在最后兩個(gè)駐留時(shí)間中保持不變(相對(duì)偏差小于5%)，則認(rèn)為培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)。實(shí)施例15炎承和為、^f黨必,及末命#*辨#松素如實(shí)施例9所述進(jìn)行提取和分析。實(shí)施例16游關(guān)曲享J/W3^關(guān)7"T差厲.'wg52、pjr("、v"差廚。a)構(gòu)建帶有argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)記的絲狀真菌表達(dá)載體使用帶有分別含有EcoRI和XmaI限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向引物5-CGGAATTCATACGCGGTTTTTTGGGGTAGTCA國(guó)3(SEQIDNO:17)和反向引物5-CGCCCGGGTATGCCACCTACAGCCATTGCGAA-3(SEQIDNO:18)，從構(gòu)巢曲霉ARl基因組DNA中擴(kuò)增包含同源啟動(dòng)子及終止子序列的編碼argB的基因。在PCR產(chǎn)物中加入的限制性位點(diǎn)允許插入經(jīng)EcoRI和Xmal消化的pUC19(NewEnglandbiolabs，Ipswich,MA.)中，得到pUC19-argB。使用帶有分別含有BamHI限制性位點(diǎn)和27堿基對(duì)適配體的5，突出端的正向引物5國(guó)GCGGATCCATAGGGCGCTTACACAGTACACGA-3(SEQIDNO:19)和反向引物5-CGGAGAGGGCGCGCCCGTGGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTACTGA-3(SEQIDNO:20)，從構(gòu)巢曲霉基因組DNA中擴(kuò)增trpC(吲咮-3-甘油磷酸合酶)。使用帶有分別含有27堿基對(duì)適配體和HindIII限制性位點(diǎn)的5，突出端的正向引物5-GCGGCCGCCACGGGCGCGCCCTCTCCGGCGGTAGTGATGTCTGCTCAA-3(SEQIDNO:21)和反向引物5畫CGAAGCTTTATAATTCCCTTGTATCTCTACAC國(guó)3(SEQIDNO:22)，從構(gòu)巢曲霉AR1基因組DNA中擴(kuò)增gpdA(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子。加入了限制性位點(diǎn)的trpC及gpdA片段的融合PCR產(chǎn)物使得可以插入經(jīng)BamHI和HindIII消化的pUC19-argB中，得到pAT3。b)構(gòu)建用于在構(gòu)巢曲霉AR1中表達(dá)C4H(肉桂酸-4-羥化酶)的帶有pyrG(乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶)標(biāo)記的絲狀真菌表達(dá)載體使用帶有分別含有限制性位點(diǎn)BssHII和Notl的5，突出端的正向引物5-CGGCGCGCATAATGGACCTCCTCTTGCTGGAG-3(SEQIDNO:23)和反向引物5-GGGCGGCCGCTTATTAACAGTTCCTTGGTTTCATAACG-3(SEQIDNO:24)，從酵母質(zhì)粒pESC-URA-PAL2-C4H(WO2006089898,實(shí)施例3)中再擴(kuò)增編碼C4H的基因。在所述PCR產(chǎn)物中引入的限制性位點(diǎn)使得可以插入經(jīng)BssHII和Notl消化的pAT3載體，得到pAT3-C4H。通過限制性酶切和測(cè)序來驗(yàn)證該構(gòu)建體?！嚼粲靡韵聝煞N限制性酶除去argB標(biāo)記BsiWI和Pcil。使用帶有5'突出端的正向引物5-CGTGTACAATATTAATTAACGAGAGCGATCGCAATAACCGTATTACCGCCTTTGAG-3(SEQIDNO:25)和反向引物5-CGACATGTATTCCCGGGAAGATCTCATGGTCA-3(SEQIDNO:26)，從煙曲霉基因組DNA中再擴(kuò)增編碼pyrG的基因，包括同源啟動(dòng)子及終止子序列，所述5，突出端中包含以下限制性位點(diǎn)正向引物中為BsrGI、Pacl、AsiSI，反向引物中為Pcil。在所述PCR產(chǎn)物中引入的限制性位點(diǎn)使得可以插入經(jīng)BsiWI和Pcil消化的pAT3載體，得到pAT3-C4H-pryG。通過限制性酶切和測(cè)序來驗(yàn)證該構(gòu)建體。c)構(gòu)建用于在構(gòu)巢曲霉AR1中表達(dá)4CL1(4-香豆酸輔酶A連接酶)的帶有argB標(biāo)記的絲狀真菌表達(dá)載體j吏用正向引物5國(guó)GCGGAGAGGGCGCGATGGCGCCACAAGAACAAGCA-3(SEQIDNO:27)和反向引物5國(guó)TGGATCCGCGGCCGCTCACAATCCATTTGCTAGTTTTGC-3(SEQIDNO:28)，從酵母質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl中再擴(kuò)增編碼4CL1的基因。<吏用InfusionTMPCR克隆技術(shù)(Clontech，MountainView,Calif.),將4CL1基因插入經(jīng)BssHII和Notl消化的pAT3載體，得到pAT3-4CLl。通過限制性酶切和測(cè)序來驗(yàn)證該構(gòu)建體。d)構(gòu)建用于在構(gòu)巢曲霉AR1中表達(dá)VSTl(白藜蘆醇合酶)的帶有argB標(biāo)記的絲狀真菌表達(dá)載體使用帶有分別含有限制性位點(diǎn)BssHII和Notl的5，突出端的正向引物5-CGGCGCGCATAATGGCATCCGTAGAGGAGTTC國(guó)3(SEQIDNO:29)和反向引物5-GGGCGGCCGCTTATCATTAGTTAGTGACAGTTGGAA國(guó)3(SEQIDNO:30),從酵母質(zhì)粒pESC-TRP-4CLl-VSTl(實(shí)施例5)中再擴(kuò)增編碼VSTl的基因。在所述PCR產(chǎn)物中引入的限制性位點(diǎn)使得可以插入將經(jīng)BssHII和Notl消化的pAT3載體，得到pAT3-VSTl。通過限制性酶切和測(cè)序來驗(yàn)證該構(gòu)建體。e)使用C4H、4CL1和VSTl在構(gòu)巢曲霉AR1(該菌林具有wg^2、/;FG"、vd7的缺失)中表達(dá)通向赤松素的途徑使用細(xì)胞壁裂解酶(glucanex，novozymes)，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法通過原生質(zhì)體化(protoplastation)進(jìn)行構(gòu)巢曲霉AR1真菌的轉(zhuǎn)化，(Tilburn等，1983)。C4H、4CL1和VST1的隨機(jī)整合在兩個(gè)步驟中進(jìn)行。使用限制性酶Bmrl將質(zhì)粒pAT3-4CLl和pAT3-VSTl線性化，并利用營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記argB根據(jù)Guerra等，2006所述的共轉(zhuǎn)化整合進(jìn)基因組。分離含有4CL1和VST1表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體，其后用以Bmrl線性化的pAT3-C4H-pyrG進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有C4H、4CL1和VST1的重組構(gòu)巢曲霉菌林。f)在搖瓶中用重組構(gòu)巢曲霉菌林進(jìn)行發(fā)酵在37"C下，在含有以下成分的瓊脂平板中將構(gòu)巢曲霉預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)5天1g/L葡萄糖、0.85g/LNaN03、0.1g/LKC1、0.1g/LMgS047H20以及0.3g/LKH2P04、0.00008g/LCuS045H20、0.000008g/LNa2B40710H2O、0.00016g/LFeS047H20、0.00016g/LMnS042H20、0.00016g/LNa2Mo042H20和0.0016g/LZnS047H20。使用該預(yù)培養(yǎng)物接種含有100mlCzapek培養(yǎng)基(CZ)的500ml振蕩搖瓶(baffledshakeflask)。將搖瓶以150rpm和30X3醉育，培養(yǎng)基的起始pH為6.2。孵育24小時(shí)后，取樣品并進(jìn)行提取操作(見下文)，并分析所產(chǎn)生赤松素的存在情況。g)從構(gòu)巢曲霉搖瓶培養(yǎng)物中提取赤松素從搖瓶中抽出由100ml培養(yǎng)物(細(xì)胞和培養(yǎng)液)組成的樣品。代謝物的提取如下進(jìn)行將樣品轉(zhuǎn)移至兩個(gè)50mlSartorius管中，并以4500rpm離心IO分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移進(jìn)燒杯，生物質(zhì)分成八個(gè)等分試樣，其被轉(zhuǎn)移到含有約300nl玻璃珠(0.25-0.50mm)的2mlSarstedt帶蓋小管中。將管插入Fastprep120(ThermoFisherScientific,Waltham,MA.)，以6.5級(jí)進(jìn)行四個(gè)循環(huán)，每次30秒，循環(huán)之間保持在水上。破碎的細(xì)胞被分裝到2個(gè)15亳升Sartorius管中。向管中裝入10ml上清液并加入3ml乙酸乙酯。用渦旋混合器將管劇烈混合2分鐘，并置于水上5分鐘。接著通過4500rpm離心10分鐘將乙酸乙酯相與水相分離，并收集乙酸乙酯相到四個(gè)1.5mlEppendorf管中。接著將乙酸乙酯凍干45分鐘，將干燥的樣品重溶于0.3ml50%曱醇中用于進(jìn)一步的HPLC分析，如實(shí)施例9b所述h)重組構(gòu)巢曲霉的搖瓶結(jié)果圖7顯示了來自典型搖瓶實(shí)驗(yàn)的HPLC層析圖。上圖顯示來自產(chǎn)生赤松素的改造菌林的結(jié)果，下圖顯示來自親本野生型對(duì)照菌林的結(jié)果。改造菌林的赤松素產(chǎn)生水平為1.0至2.0mg/l不等。對(duì)照菌林未顯示任何赤松素形成。通過與純標(biāo)準(zhǔn)品的UV層析圖進(jìn)行比較，通過二極管陣列UV鐠進(jìn)一步證實(shí)赤松素峰的身份(圖8)實(shí)施例17浙定/MlC7，及遵禁潛養(yǎng)參^薪類^合參W敘應(yīng)力及敘敏/A^"f在1升工作體積的限碳連續(xù)培養(yǎng)物中培養(yǎng)過表達(dá)CPR的酵母菌林FSSC-PAL2C4H4CL2VSTl-pADHlCPRl。對(duì)該培養(yǎng)物補(bǔ)充含有以下成分的Verduyn等(1992)所述成分限定的培養(yǎng)基5.0g/L(NH4)2S04;3.0g/LKH2P04;0.5g/LMgS04'71120;微量金屬及維生素以及作為生長(zhǎng)限制營(yíng)養(yǎng)素的5g/1葡萄糖和35g/l半乳糖。加入消泡劑(300nl/L,SigmaA-8436)以避免形成泡沫。將碳源與礦物質(zhì)培養(yǎng)基分別高壓滅菌，其后加入發(fā)酵罐中。此外，在培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻之后通過除菌過濾將維生素和微量金屬加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐系統(tǒng)來自SartoriusBBI系統(tǒng)，由1升工作體積的帶有BiostatBPlus控制器的帶擋板的3升反應(yīng)器組成，其裝有兩個(gè)以1000rpm旋轉(zhuǎn)的Rushton渦輪，溫度保持在30±1"C，通過自動(dòng)添加2MKOH將pH保持在5.5土0.2。通過質(zhì)量流控制器來控制氣流，并設(shè)置成1.5vvm(1.51/分鐘)。廢氣通過冷卻的冷凝器導(dǎo)出，并分析02及(:02(Model1308,Innova，Denmark),通過用10ml指數(shù)生長(zhǎng)的搖瓶培養(yǎng)物(含有5g/1葡萄糖和35g/1半乳糖)接種培養(yǎng)物來起始含有35g/1半乳糖的最初分批培養(yǎng)物。通過向反應(yīng)器中連續(xù)補(bǔ)充相同培養(yǎng)基而將分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)換成連續(xù)模式?；诤愣ㄋ絹砜刂葡♂屗俾?，目標(biāo)為D=0.050h"。當(dāng)稀釋速率和廢氣信號(hào)在至少五個(gè)駐留時(shí)間中保持不變，并且以一個(gè)駐留時(shí)間為間隔的兩個(gè)連續(xù)樣品中代謝物濃度的偏差低于3%，則認(rèn)為連續(xù)培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)。連續(xù)監(jiān)測(cè)的溶解氧濃度保持在高于60%空氣飽和度。在所述條件下，菌林消耗了所有的半乳糖，主要產(chǎn)生生物量和C02以及僅少量的乙醇。此外，RQ近似均一，表明代謝主要為呼吸模式。對(duì)于芪類化合物(stilbenoids)的測(cè)定，在約300小時(shí)發(fā)酵(對(duì)應(yīng)于15個(gè)駐留時(shí)間)時(shí)取樣。通過5000g離心5分鐘來收獲細(xì)胞。對(duì)于芪類化合物細(xì)胞外水平的測(cè)定，將上清液的25ml等分試樣用10ml乙酸乙酯提取一次。將乙酸乙酯凍干，并將干燥產(chǎn)物重溶于0.6ml甲醇中。將樣品在水中50倍稀釋，轉(zhuǎn)移到HPLC管中，并通過HPLC進(jìn)行分析。此外，為了評(píng)估所產(chǎn)生的芪類化合物水平是否超出了培養(yǎng)基的溶解度，或者是否與細(xì)胞膜結(jié)合，將細(xì)胞培養(yǎng)物(因此包括細(xì)胞和培養(yǎng)基)的1ml等分試樣與lmll00%乙醇混合，劇烈混合，然后離心。接著將上清液轉(zhuǎn)移至HPLC管，直接分析芪類化合物含量。對(duì)于芪類化合物細(xì)胞內(nèi)水平的測(cè)定，取50ml培養(yǎng)物等分試樣，通過離心分離細(xì)胞和培養(yǎng)基。用50ml水洗滌沉淀，以除去與細(xì)胞結(jié)合或包在沉淀中的任何茛類化合物，沉淀再次離心后溶于lml水中。將所得的細(xì)胞懸液分配到提取管中，并使用fast-prep機(jī)器用玻璃珠破碎。將粗提物合并到10ml100%甲醇中，在4X:下在冷的暗室中在旋轉(zhuǎn)腔中提取24小時(shí)。其后，5000g離心5分鐘除去細(xì)胞碎片，凍干過夜除去殘余的曱醇。將干燥殘余物重溶于0.4ml曱醇和0.1ml水中。將樣品在水中50倍稀釋，接著轉(zhuǎn)移進(jìn)HPLC管中，并通過HPLC進(jìn)行分析。下表總結(jié)了連續(xù)培養(yǎng)300小時(shí)后的結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>根據(jù)以下章節(jié)中解釋的計(jì)算，芪類化合物的胞內(nèi)水平表達(dá)為mg/g生物量(干重)。提取物中赤松素的濃度測(cè)定為1646mg/l,該提取物的體積為0.5ml,因此所提取赤爭(zhēng)>素的絕對(duì)量分別為0.5x1646/1000=0.8230mg。所述芪類化合物提取自50ml培養(yǎng)物等分試樣，因此以每升培養(yǎng)物表示的赤松素胞內(nèi)濃度為0.8230x(1000/50)=16.46mg/1。所述培養(yǎng)物的生物量濃度為9g/1。因此，以每克干重表示的胞內(nèi)赤松素水平為16.46/9=1.83mg/g干重。實(shí)施例18克隆產(chǎn)油酵母(oleaginousyeast)解月旨亞羅酵母(Ki/t歸,Vi/—)中的反式赤松素途徑a)分離基因?qū)AL(苯丙氨酸氨裂合酶)、CL(肉桂酰輔酶A連接酶)和VST1基因(其中基因定義為編碼蛋白質(zhì)的序列)作為合成基因(GenScriptCorporation,Piscataway，NJ)產(chǎn)生，其經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在解脂亞羅酵母中表達(dá)。解脂亞羅酵母中密碼子使用的確定先前已有描述(WO2006125000)。還可通過PCR從擬南芥cDNA(Stratagene)中分離PAL和4CL基因。肉桂酰輔酶A連接酶CL可以是任何接受肉桂酸為底物的羥基肉桂酰輔酶A連接酶。例如來自擬南芥的由4CL1和4CL2基因編碼的4-香豆酰輔酶A連接酶接受肉桂酸，盡管優(yōu)選底物為4-羥基肉桂酸(香豆酸)(Hamberger和Hahlbrock，2004;Costa等，2005)。更特別地，所述CL是經(jīng)密碼子優(yōu)化的對(duì)肉桂酸為底物具有特異性的連接酶，例如來自天藍(lán)色鏈霉菌的肉桂酸輔酶A連接酶(Kaneko等，2003)。類似地，VST1基因可以是接受肉桂酰輔酶A為底物的任何經(jīng)密碼子優(yōu)化或未經(jīng)密碼子優(yōu)化的芪合酶，盡管芪合酶的優(yōu)選底物通常為4-香豆酰輔酶A，產(chǎn)生白藜蘆醇，故稱為白藜蘆醇合酶。這類雙底物接受性是來自葡萄的VST1基因(SEQIDNO:9)的本性。更特別地，使用對(duì)肉桂酰輔酶A作為底物具有特異性的來自松科的芪合酶(Schanz等，1992;Koda等，2002)。b)啟動(dòng)子和終止子的分離可用于在解脂亞羅酵母中表達(dá)異源基因的啟動(dòng)子例如但不僅限于以下啟動(dòng)子長(zhǎng)鏈酰基輔酶A氧化酶POX2、hp4d、異檸檬酸裂合酶ICL1、細(xì)胞外堿性蛋白酶XPR2、翻譯延伸因子TEF、核糖體蛋白S7RPS7、甘油醛-3-磷酸脫氳酶GPD、YAT1、GPAT、FBA1和FBAIN的啟動(dòng)子(Mtiller等，1998:WO2006055322;WO2006125000)?？捎糜谠诮庵瑏喠_酵母中表達(dá)異源基因的終止子例如但不僅限于以下終止子XPR2、LIP2、PEX20和SQS終止子(Merkulov等，2000;WO2006055322;WO2006125000)。通過PCR從解脂亞羅酵母基因組DNA中分離終止子和啟動(dòng)子DNA片段，所述基因組DNA分離自解脂亞羅酵母的完整細(xì)胞，例如來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的細(xì)胞，例如ATCC16618、ATCC18943和ATCC18944、ATCC90811、ATCC卯812和ATCC卯903。c)產(chǎn)生表達(dá)盒產(chǎn)生表達(dá)盒是指裝配由以下組成的線性雙鏈DNA片段與異源基因的蛋白質(zhì)編碼序列融合的啟動(dòng)子(組成型或誘導(dǎo)型)以及終止子，即5'-啟動(dòng)子::基因:終止子-3'DNA片段。表達(dá)盒可通過不同基因片段、啟動(dòng)子、基因編碼序列和終止片段的融合PCR的組合來產(chǎn)生。例如，可使用PCR技術(shù)將PAL基因與XPR2啟動(dòng)子融合，可將所得的XPR2::PAL片段通過第二個(gè)PCR反應(yīng)與終止子融合，產(chǎn)生表達(dá)盒XPR2::PAL::終止子。產(chǎn)生表達(dá)盒的另一種方法是將異源基因(如PAL)的蛋白質(zhì)編碼序列克隆進(jìn)已有的表達(dá)載體中，例如但不僅限于ATCC載體69355TM。該ATCC載體已經(jīng)具有了啟動(dòng)子(XPR2)和終止子區(qū)以及啟動(dòng)子及終止子之間具有獨(dú)特限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)，用于通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)工具引入異源基因。如果靶載體在啟動(dòng)子與終止子區(qū)之間的限制性位點(diǎn)數(shù)有限，則可以使用Infusion克隆試劑盒技術(shù)(Clontech,CA,USA)，因?yàn)樗鼉H需要載體中的一個(gè)限制性位點(diǎn)來進(jìn)行基因插入。通過將基因插入載體中啟動(dòng)子與終止子之間，表達(dá)盒啟動(dòng)子::基因:終止子在環(huán)狀載體內(nèi)部產(chǎn)生，而不是作為單個(gè)雙鏈DNA片段產(chǎn)生。如果需要線性DNA表達(dá)盒片段，則可使用PCR從表達(dá)載體中擴(kuò)增表達(dá)盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員^i人識(shí)到，可以向同一質(zhì)?；蜉d體中引入多個(gè)表達(dá)盒，產(chǎn)生表達(dá)盒蔟，優(yōu)選用來自完整代謝途徑的基因來進(jìn)行，例如赤松素產(chǎn)生途徑(PAL、CL和VST1基因)。赤松素產(chǎn)生所需的這三種基因(PAL、CL和VST1基因)的束達(dá)盒蔟定義為赤松素途徑表達(dá)蔟。d)在解脂亞羅酵母中插入異源基因PAL、CL和VST1以用于產(chǎn)生赤松素將赤松素途徑基因(PAL、CL、VST1)裝配成帶有啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)盒啟動(dòng)子::基因:終止子。對(duì)于不同基因PAL、CL和VST1而言，所述啟動(dòng)子和終止子可以是相同的，或是不同啟動(dòng)子與終止子的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可用于在解脂亞羅酵母中引入和表達(dá)赤松素途徑表達(dá)蔟(包括含有基因PAL、CL和VST1的表達(dá)盒)所需的克隆技術(shù)、克隆載體或克隆工具，因?yàn)檫@些工具已經(jīng)描述于若干出版物(LeDA11等，1994;Pignede等，2000;Juretzek等，2001;Madzak等，2004)和專利申請(qǐng)(WO2006055322;WO2006125000)中。總之，一旦獲得了適于在解脂亞羅酵母中表達(dá)赤松素途徑(PAL、CL和VST1)的表達(dá)盒，就可將其(i)置于能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體中,或者(ii)直接整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，或者其組合，以在解脂亞羅酵母宿主中建立赤松素途徑表達(dá)蔟?？蓪⒈磉_(dá)盒設(shè)計(jì)成隨機(jī)整合進(jìn)宿主基因組，或者可以靶向至特定位置。在兩種情況下，都將表達(dá)盒進(jìn)一步構(gòu)建成在該表達(dá)盒兩側(cè)都含有與宿主基因組同源的周圍區(qū)。同源性區(qū)域可以為足以與宿主基因座靶向重組的20至1000個(gè)堿基對(duì)。可將單個(gè)拷貝靶向至基因組中不會(huì)導(dǎo)致缺失必要基因的任何部分。當(dāng)期望高水平基因表達(dá)時(shí)，在解脂亞羅酵母基因組中多個(gè)位置進(jìn)行插入可能特別有用，用于插入表達(dá)盒的多個(gè)拷貝的靶標(biāo)例如但不僅限于核糖體DNA序列(rDNA)或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣元件(TYl元件)(Pignede等,2000)。當(dāng)向解脂亞羅酵母基因組的隨機(jī)位置插入表達(dá)盒的多個(gè)拷貝時(shí)，實(shí)際上表達(dá)盒啟動(dòng)子-基因-終止子可以更短，僅包括啟動(dòng)子-基因，因?yàn)檎蠈⑹沟媒庵瑏喠_酵母基因組中已有的終止子作為該表達(dá)盒的終止子。還可以將包含表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA整合進(jìn)其他位點(diǎn)，以達(dá)到期望的表達(dá)盒拷貝數(shù)，例如但不僅限于URA3基因座(登記號(hào)AJ306421)和LEU2基因座(登記號(hào)AF260230)。LEU2整合載體例如但不僅限于ATCC載體69355tm。這種含有表達(dá)盒的表達(dá)載體可直接用于轉(zhuǎn)化亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型解脂亞羅酵母，以選擇含有解脂亞羅酵母LEU2標(biāo)記基因的表達(dá)載體。還可以通過PCR技術(shù)從表達(dá)載體中擴(kuò)增表達(dá)盒，以進(jìn)一步用于構(gòu)建含有適當(dāng)?shù)目股剡x擇標(biāo)記或生物合成氨基酸標(biāo)記的其他表達(dá)載體。URA3整合位點(diǎn)可以與5-氟乳清酸(5-fluorooroticacid,5-FOA)選擇一起重復(fù)使用。具體而言，在解脂亞羅酵母宿主中缺失天然URA3基因，以產(chǎn)生具有URA-營(yíng)養(yǎng)缺陷型表型的菌林，其中基于5-FOA抗性進(jìn)行選擇。當(dāng)111^3存在時(shí)，510眾被1111入3基因所編碼的乳清酸-5'-磷酸脫羧酶降解成有毒化合物5-氟尿嘧啶，僅有缺乏URA3基因的細(xì)胞將具有抗性。因此，可以在多個(gè)輪次中將多個(gè)表達(dá)盒和新URA3基因的簇插入解脂亞羅酵母基因組的多個(gè)基因座，從而產(chǎn)生具有URA+原養(yǎng)型表型的新菌林。當(dāng)所引入的URA3基因自主缺失(稱為環(huán)出(loop-out)或跳出(p叩-out))時(shí)，再使用5-FOA選擇進(jìn)行的后續(xù)整合產(chǎn)生新的URA3-營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌抹。因此，URA3基因與5-FOA選擇的組合可在多輪遺傳修飾及表達(dá)盒整合中用作選擇標(biāo)記。e)轉(zhuǎn)化解脂亞羅酵母可以使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)(Chen等，1997;WO2006125000)將包含表達(dá)盒的外源DNA、自主復(fù)制載體或DNA片段引入解脂亞羅酵母宿主，例如諸如ATCC卯811、ATCC卯812和ATCC90903的細(xì)胞。用于在解脂亞羅酵母中維持所引入外源DNA的選擇方法可基于氨基酸標(biāo)記(Fickers等，2003)或抗生素標(biāo)記(Cordero等，1996)。實(shí)施例19^^重逸義靡并,麥#進(jìn)#分批培#在需氧條件下，將重組大腸桿菌FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(對(duì)照菌林)培養(yǎng)在1.5升工作體積的帶擋板生物反應(yīng)器中。以30"C、800rpm孵育培養(yǎng)物。通過自動(dòng)添加2NKOH保持恒定的pH7。通過以1vvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入空氣以確保溶解氧密度(dissolvedoxygendensity,DOT)高于60%來獲得需氧條件。在引入生物反應(yīng)器之前將空氣進(jìn)行除菌過濾。將廢氣通過冷卻至6"C以下的冷凝器排出，并通過聲學(xué)氣體分析儀分析其C02和02體積含量。該生物反應(yīng)器裝有以空氣(DOT,1000/。)和&(DOT，0。/。)校準(zhǔn)的極鐠氧傳感器。在分批培養(yǎng)中，在含有用以允許生長(zhǎng)的以下組分的半確定培養(yǎng)基中用甘油培養(yǎng)細(xì)胞6.0g/l酵母提取物、27.2g/lNa2HP04(無水)、12.0g/1KH2P04、2.0g/1NaCl和4.0g/1NH4C1。甘油濃度為20g/l。在培養(yǎng)基中補(bǔ)充50mg/l氨節(jié)青霉素和50mg/l卡那霉素。加入消泡劑至終濃度為50jil/l。用重組菌林的1ml甘油儲(chǔ)存培養(yǎng)物接種生物反應(yīng)器，使600nm的最終吸光度約為0.03。通過在30C和150rpm下在搖瓶中以半確定培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞來獲得甘油儲(chǔ)存培養(yǎng)物。培養(yǎng)基的組成與上述培養(yǎng)基相同，但重新調(diào)整成四分之一，即5g/l甘油、1.5g/l酵母提取物、6.8g/1Na2HP04(無水)、3.0g/1KH2P04、0.5g/1NaCl和1.0g/1NH4C1。在培養(yǎng)基中補(bǔ)充50mg/l氨芐青霉素和50mg/l卡那霉素。在指數(shù)生長(zhǎng)后期收獲細(xì)胞，通過離心進(jìn)行收集并重懸于適當(dāng)體積的15%(重量/體積)無菌甘油溶液中，例如600nm處的最終吸光度為30。將1ml懸浮細(xì)胞的等分試樣保存于-80n。當(dāng)細(xì)胞開始在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)之后(接種后5.5小時(shí))，添加異丙基(P-硫代半乳糖苷)(IPTG)至終濃度為1mM，作為三種基因PAL2、4CL1和VST1中每一個(gè)之前的T7啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物。在分批培養(yǎng)過程中收集細(xì)胞培養(yǎng)液樣品并分析其赤松素存在情況。此外，分析樣品的生物量(以吸光度OD600進(jìn)行分析)、碳源(甘油)和主要副產(chǎn)物(乙醇、乙酸、丙酮酸、琥珀酸)。W爽承義厲并,尹辨殺松#用乙酸乙酯提取細(xì)胞內(nèi)的赤松素。為此，將4mL乙酸乙酯加入8mL細(xì)胞培養(yǎng)液中。通過混合(30秒)和通過離心(4500rpm5分鐘，)進(jìn)行相分離來加強(qiáng)提取。將乙酸乙酯相凍干(約2小時(shí))，將干燥產(chǎn)物重溶于0.5ml甲醇中，并通過HPLC進(jìn)行分析。然后將這些樣品在水中稀釋(i:5)并通過HPLC進(jìn)行分析。為、浙絲#使用如實(shí)施例9b所述方法對(duì)來自分批培養(yǎng)的樣品進(jìn)行赤松素分析。之前，樣品進(jìn)行以下平行進(jìn)行的樣品分離操作(i)離心細(xì)胞培養(yǎng)液(5分鐘)并分析上清液；(ii)添加乙醇(99.9%)至終濃度50%(體積/體積)、振蕩(30秒)、離心(5分鐘)并分析上清液；(iii)根據(jù)上述(b)用乙酸乙酯提取，并分析重溶于甲醇的干燥樣品。結(jié)果如上文(a)所述，在分批模式的生物反應(yīng)器中以20g/L甘油培養(yǎng)如實(shí)施例10c所述的重組大腸桿菌菌林FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(對(duì)照菌林)。在培養(yǎng)過程中，根據(jù)上文(a)分析重組菌林的赤松素含量。HPLC分析顯示，菌林FSEC-PAL24CL1VST1含有駐留時(shí)間與反式赤松素標(biāo)準(zhǔn)品相同的組分(圖4和5)。此外，UV吸收鐠也與純反式赤松素(未顯示)的相似，)wnax約為306nm。下表中顯示了所檢測(cè)赤松素的最高濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>(*)檢出水平以下。(**)未檢測(cè)來自對(duì)照菌林分批培養(yǎng)的樣品中未檢測(cè)到赤松素。因此，該結(jié)果證明，在分批模式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的大腸桿菌中存在活躍的苯基丙烷類途徑，導(dǎo)致在體內(nèi)產(chǎn)生反式赤松素。實(shí)施例20^眉重逸游關(guān)曲賓離#進(jìn)斤分批潛#在需氧條件下，將含有C4H、4CL1和VST1的重組構(gòu)巢曲霉菌林培養(yǎng)在1.5升工作體積的帶擋板生物反應(yīng)器中。以30C、700rpm孵育培養(yǎng)物。通過自動(dòng)添加2NKOH保持恒定的pH6。通過以1vvm的速率向生物反應(yīng)器中噴入空氣以確保溶解氧垂度(dissolvedoxygendensity,DOT)高于60%來獲得需氧條件。在引入生物反應(yīng)器之前將空氣進(jìn)行除菌過濾。將廢氣通過冷卻至6X:以下的冷凝器排出，并通過聲學(xué)氣體分析儀分析其C02和02體積含量。該生物反應(yīng)器裝有以空氣(DOT,100%)和]\2(DOT,0%)校準(zhǔn)的極^瞽氧傳感器。在由以下組分組成的成分確定的培養(yǎng)基中以蔗糖培養(yǎng)細(xì)胞3.0g/lNaN03、1.0g/1KH2P04、0.5g/lKCl、0.5g/lMgSO47H2O、0.5/1gFeS04.7H20。蔗糖濃度為30g/l。加入消泡劑至終濃度為50nl/l。以含有C4H、4CL1和VST1的構(gòu)巢曲霉菌林的孢子接種生物反應(yīng)器，所述孢子之前在具有以下組成的固體基本培養(yǎng)基上繁殖1g/L葡萄糖、0.85g/LNaN03、0.1g/LKCl、0.1g/LMgS047H20以及0.3g/LKH2P04、0.00008g/LCuS045H20、0.000008g/LNa2B4O710H2O、0.00016g/LFeS047H20、0.00016g/LMnS042H20、0.00016g/LNa2Mo04.2H20和0.0016g/LZnS047H20。將孢子以37匸培養(yǎng)5天，然后加入Tween80%溶液(0.25%(總量/體積))進(jìn)行收獲。W炎承游關(guān)必##辨#松#通過勻漿(在Polytron組織勻漿機(jī)中)破碎細(xì)胞，用10ml乙酸乙酯提取細(xì)胞內(nèi)赤松素。通過在旋轉(zhuǎn)混合儀中混合(約15分鐘)和通過離心進(jìn)行相分離(4500rpm，4C，5分鐘)來加強(qiáng)萃取。將乙酸酯相凍干(約2小時(shí))，將干燥產(chǎn)物重溶于0.5ml甲醇中并通過HPLC進(jìn)行分析。W為、浙絲素使用如實(shí)施例9b所述的方法對(duì)來自分批培養(yǎng)的樣品進(jìn)行赤松素分析結(jié)果根據(jù)實(shí)施例HD4，在分批模式的生物反應(yīng)器中以30g/L蔗糖培養(yǎng)如實(shí)施例16e所述的含有C4H、4CL1和VST1的重組構(gòu)巢曲霉菌林。培養(yǎng)約48小時(shí)之后，從生物反應(yīng)器中收獲細(xì)胞，通過勻漿進(jìn)行破壞并根據(jù)上文(b)和(c)分析其赤松素細(xì)胞內(nèi)含量。HPLC分析顯示，含有C4H、4CL1和VST1的構(gòu)巢曲霉菌林在胞內(nèi)顯示駐留時(shí)間與反式赤松素標(biāo)準(zhǔn)品相同的組分(圖4和5)。此外，UV吸收鐠也與純反式赤松素(未顯示)的吸收譜相似，、ax約為306nm。因此，所述結(jié)果證明，在分批模式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的構(gòu)巢曲霉中存在活躍的苯基丙烷類途徑，導(dǎo)致在體內(nèi)產(chǎn)生反式赤松素。參考文獻(xiàn)以下出版物均通過參考并入本文專利no.ZA200408194專利no.EP0309862專利no.EP0464461專利No.US5391724專利No.US5973230專利申請(qǐng)WO2006125000MethodfortheproductionofresveratrolinarecombinantoleaginousmicroorganismHuamgLixuanLisa,DuPont(US)專利申請(qǐng)WO2006055322Higharachidonicacidproducingstrainsofi^ari:owialipolyticsDamudeHoward,DuPont(US)Abe,I.,Watanabe,T.andNoguchi,H.(2004).Enzymaticformationoflong-chainpolyketidepyronesbyplanttypeIIIpolyketidesynthases.Phytochemistry.6,2447-2453.AggarwalBB,BhardwajA,AggarwalRS,SeeramNP,ShishodiaS,TakadaY,(2004).Roleofresveratrolinpreventionandtherapy〇fcancer:preclinicalandclinicalstudies.AnticancerRes.24,2783-840.Review.Allina,S.M,,Pri-Hadash,A.,Theilmann,D.A.,Ellis,B.E.andDouglas,C,J.(1998)4-coumarate:CoenzymeAligaseinhybridpoplar.Propertiesofenzymes,cDNAcloning,andanalysis〇frecombinantclones.PlantPhysiol.116,743-754.BeckerJV,ArmstrongG〇,vanderMerweMJ,LambrechtsMG,VivierNLA,PretoriusIS.(2003).MetabolicengineeringofSacohairo/nycesceirevisiaeforthesynthesisofthewine-relatedantioxidantresveratrol,FEMSYeastRes,4,79—85,ChenDC,BeckerichJM,GaillardinC.One-steptransformationofthedimorphicyeastYarrowiaApplMicrobiolBiotechnol.1997:48:232-5.Cochrane,F.C,,Davin,LB,andLewisN,G.(2004)TheAraJbidopsisphenylalanineammonialyasegenefamily:kineticcharacterizationofthefourPALisof〇rms.Phytochemistry65,1557-1564，CorderoOteroR,GaillardinC.Efficientselectionofhygromycin一B一resistantYarrowia_ZipoJyticatransformants,ApplMicrobiolBiotechnol.1996:46:143-8,CostaML,BedgarDL,MoinuddinSGA,KimK,CardenasCL,CochraneFC,ShockeyJM,HelmsGL,AmakuraY,TakahashiHetal.Characterizationinvitroandinvivooftheputativemultigene4—coumarate:CoAligasenetworkinArabidopsis:syringylligninandsinapate/sinapylalcoholderivativeformationPhytochemistry,2005:66:2072-2091Ehlting,J.,Biittner,D,,Wang,Q.,Douglas,C.J.,Somssich,工.EandKombrink,E.(1999).Three4-coumarate:coenzymeAligasesinAirabidopsisth<3lianarepresentstwoevolutionarydivergentclassesinangiosperms.Theplantjournal,19,9—20.FickersP,LeDallMT,GaillardinC,ThonartP,NicaudJM.NewdisruptioncassettesforrapidgenedisruptionandmarkerrescueintheyeastYarroivia_Zi_polytica.JMicrobiolMethods.2003:55:727—37.Gehlert,R.,Schoppner,A.andKindl,H,StilbenesynthasefromseedlingsofPinusvestris—purificationandinductioninresponsetofungalinfection.M〇l,Plant一MicrobeInteraction3(1990)444—449.Gems,D.,Johnstone,工.L.andClutterbuck,A.J.(1991).AnautonomouslyreplicatingplasmidtransformsAspergiiiusdculansathighfrequency.Gene98,61-67.Hain,R.,Reif,H.J.,Krause,E.,Langebartels,R.,Kindl,H.,Vornam,B.,Wiese,W,,Schmelzer,E.,Schreier,P.H.,Stocker,R.H.andStenzel,K.(1993),Diseaseresistanceresultsfromforeignphytoalexinexpressioninanovelplant.Nature361,153-156.HwangEI,KanekoM,OhnishiY,H〇rin〇uchiS.(2003).Productionofplant—specificflavanonesby￡scheriohiaco_Iicontaininganartificialgenecluster.Appl.Environ.Microbiol.69,2699—706.Hamberger,B.andHahlbrock,K.(2004).The4—coumarate:C〇AligasegenefamilyinArabidopsisti2aJianacomprisesonerare,sinapate一activatingandthreecommonlyoccurringisoenzymes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101,2209—2214.Hart,J,H.(1981)Roleofphytostilbenesindecayanddiseaseresistance.Annu.Rev.Phytopathology19,437—458,Hart,J.H.,Shrimpton,D.M.(1979),Roleofstilbenesinresistanceofwoodtodecay.Phytopathology69,1138—1143,HemingwayR.W.,McGraw,G.W.andBarras,S.J.(1977).PolyphenolsinCera亡ocystisminorinfectedPinustaeda:FungalMetabolites,phloemandxylemphenols.J.Agric.FoodChem.,25,717-722.Juvvadi,P.R.,Seshime,Y.,Kitamoto,K.(2005).Genomicsrevealstraces〇ffungalphenylpropanoid一flavonoidmetabolicpathwayinthefilamentousfungusAspergiUlzsoryzae.jMicrobiol.43,475-486.JuretzekT,LeDallM,MauersbergerS,GaillardinC,BarthG,NicaudJ.VectorsforgeneexpressionandamplificationintheyeastYeast.2001:18:97-113.Kaneko,M.,Ohnishi,Y.andHorinouchi,S.Cinnamate:Coenzyme(2003).AligasefromtheFilamentousBacteriaS亡reptoinycescoe_Licolo_rA3(2),J.Bact.185,20-27.Kindl,H.(1985)Biosynthesisofstilbenes.工nHiguchiT,ed,BiosynthesisandBiodegradationofWoodComponents.AcademicPress,London,pp349—377.Kodan,A.,Kuroda,H.andSakai,F.(2002).AstilbenesynthasefromJapaneseredpine(Pinusdensi_fiora):Implicationsforphytoalexinaccumulationanddown—regulationofflavonoidbiosynthesis.Pr〇c.Natl.Acad.Sci.99,3335—3339，LeDallMT,NicaudJM,GaillardinC.Multiple—copyintegrationintheyeastYa_r_rowialipolytics.CurrGenet.1994:26:38-44.Lieutier,F.,Sauvard,D.,Brignolas,F.,Picron,V.,Yart,A.,Bastien,C.andJay-Allemand,C.(1996)ChangesinphenolicmetabolitesofScotspinephloeminducedbyPphiostoi7ajbiTL7ii_neo—ci_Iiatu/n,abarkbeetle-associatedfungus.Eur.J,ForPathol.26,145—158LindbergLE,WillforSM,HolmbomBR.(2004)Antibacterialeffectsofknotwoodextractivesonpapermillbacteria,JIndMicrobiolBiotechnol.31,137—147.MadzakC,GaillardinC,BeckerichJM.Heterologousproteinexpressionandsecretioninthenon一conventionalyeastYar\roivialipolytics:areview.JBiotechnol.2004:109:63-81,Martin,V.J.J.,Pitera,D.J.,Withers,S.T,,Newman,J.D.andKeasling,J.D.(2003).EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoiiforproductionofterpenoids.Naturebiotechnology21,796—802.MelchiorF,KindlH(1991).Coordinateandelicitordependentexpression〇fstilbenesynthaseandphenylalanineammonialyasegenesinV"i亡iscv.Op亡i/na.ArchBiochem.Biophys288,552-557.Mellanen,P.,Petanen,T.,Lehtimaki,J.,Makela,S.,Bylund,G.,Holmbom,B.,Mannila,E.,Oikari,A.andSantti,R.(1996).W〇〇d-derivedestrogens:studiesinvitrowithbreastcancercelllinesand:i_nvivointrout.Toxicol.App.Pharm.136,381-388.MerkulovS,vanAssemaF,SpringerJ,FernandezDelCarmenA,M〇〇ibr〇ekH.CloningandcharacterizationoftheYairroiyiaiipoiyticasqualenesynthase(SQSl)geneandfunctionalcomplementation〇ftheSaccharomycescerevisiaeerg9mutation.Yeast.2000:16:197-206.MizutaniMandOhtaDetal,1998TwoIs〇f〇rmsofNADPH:CytochromeP450ReductaseinArabidopsisthaiiana.GeneStructure,HeterologousExpressioninInsectCells,andDifferentialRegulationPlantPhysiol.116,357-367Morita,H,,Noguchi,H.,Schroder,J.andAbe,工，(2001)Novelpolyketidessynthesizedwithahigherplantstilbenesynthase.Eur.J.Biochem.268,3759-3766.MlillerS,SandalT,Kamp-HansenP,Dalb0geH.ComparisonofexpressionsystemsintheyeastsSaccharo/nycescerevisiae,Hansenul<apoiy齢rpha,iQyvero/nycesiac亡is,5chizosaccharo/nyces_po/n_beandYajrrowiaJipolytica.Cloning〇ftwonovelpromotersfromYarroiviaiipolytica.Yeast.1998:14:1267-83，NicaudJM,MadzakC,vandenBroekP,GyslerC,DubocP,NiederbergerP,GaillardinC.ProteinexpressionandsecretionintheyeastYarroiyia二ipo2yt化a.FEMSYeastRes.2002:2:371-9.PignedeG,WangHJ,FudalejF,SemanM,GaillardinC,NicaudJM.Autocloningandamplification〇fL工P2inYarroiviaJipoiytica.ApplEnvironMicrobiol.2000:66:3283-9.Preisig-Muller,R.,Schwekendiek,A.,Brehm,I.,Reif,H.J.andKindl,H.(1999).Characterizationofapinemultigenefamilycontainingelicitor—responsivestilbenesynthasegenes.PlantM〇l.Biol.199939,221—229,PacherT,SegerC,EngelmeierD,VajrodayaS,Hofer〇,GregerH,(2002).AntifungalstilbenoidsfromSte/nonacomnsae.JNatProd.65,820-827.RaiberS,Schr5derG,Schr6derJ.(1995).MolecularandenzymaticcharacterizationoftwostilbenesynthasesfromEasternwhitepine(Pi/iusstrobus).AsingleArg/HisdifferencedeterminestheactivityandthepHdependenceoftheenzymes.FEBSLett.361,299-302,Richter,C.,Wild,A.(1992).Phenoliccompoundsinneedles〇fNorwaysprucetreesinrelationt〇novelforestdecline:工.StudiesontreesfromsiteoftheNorthernBlackForest.Biochem.Biophys.Pflanz188,305-320.R〇D.K*,DouglasC.J.(2004).Reconstitution〇ftheentrypointofplantphenylpropanoidmetabolisminyeast(Saccharo/77ycescerevisiae):implicationsforcontrol〇fmetabolicfluxintothephenylpropanoidpathwayJ.Biol.Chem.279,2600-2607.Rosemann,D.,Heller,W.andSandermann,H.(1991).BiochemicalPlantResponsestoOzone.工工.InductionofStilbeneBiosynthesisinScotsPine(Pinussyivest:ris_L.)Seedlings.Jr.PlantPhysiol.97,1280-1286.Roupe,K.A.,Fukuda,C,,Halls,S.,Y站ez,J.A.andDaviesN.M.(2005)Pinosylvin:Method〇fAnalysis,Anti—CancerActivityandMetabolism.AmericanAssociation〇fPharmaceuticalScientistsAnnualMeeting.November.Accepted,Roupe,K.A.,Remsberg,C,M,,Yaflez.J.A.andDavies,N.M.(2006).PharmacometriesofStilbenes:SeguingTowardstheClinic.Curr.Clin.Pharmac.1,81-101.Samappito,S,,Page,J.E.,Schmidt,J.,De-Eknamkul,W.andKutchan,T,M.(2003).Aromaticandpyronepolyketidessynthesizedbyastilbenesynthasefrom_Rheum亡ataricuzn.Phytochemistry62,313-323.Sambrook,J.,Fritsch,E,F.andManiatis,T,(1989).MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,Y.Schanz,S.,Schr5der,G.andSchr6der,J.(1992).StilbenesynthasefromScot'spine(Pi_nusves亡ris)FEBSLett.313,71-74.Sch6ppner,A.andKindl,H.(1984)Purificationandpropertiesofastilbenesynthasefrominducedcellsuspensionculturesofpeanut.J.Biol.Chem.259,6806—6811，Schr6derG,BrownJWS,SchroderJ.(1988),Molecularanalysisofresveratrolsynthase.cDNAclonesandrelationshipwithchalconesynthase.EurJBiochem172,161—169.Seshime,Y.,Juvvadi,P.R.,Fujii,I.andKitamoto,K.(2005〉.GenomicevidencesfortheexistenceofaphenylpropanoidmetabolicpathwayinAspergilluso_ryzae.Biochem.Biophys.ResCommun.337,747—51.Skinnider,L.andStoesslA.(1986).Theeffect〇fthephytoalexins,丄ubimin,(-)-maackiain,pinosylvin,andtherelatedcompoundsdehydr〇l〇r〇gl〇ss〇landhordatineMonhumanlymphoblastoidcelllines.Experientia42,568-570.Stojanovic,S.,Sprinz,H.andBrede,〇(2001).Efficiencyandmechanismoftheanti一oxidantactionoftrans—resveratrolanditsanaloguesintheradicalliposomeoxidation.Arch.Biochem.Biophys.391,79一89.SugaT.,〇htaS.,MunesadaK.,工deN.,KurokawaM.,ShimizuM.,〇htaE.(1993).Endogenouspinewoodnematicidalsubstancesinpines,Pinus/nassoniana,P.s亡roi)us$_ndP.pa_Iust_ris.Phytochemistry33,1395—1401.Tropf,S.,Karcher,B,,Schr6dei:,G.andSchr6der,J.(1995).Reactionmechanismsofhomodimericplantpolyketidesynthase(stilbenesandchalconesynthase).Asingleactivesiteforthecondensingreactionissufficientforsynthesis〇fstilbenes,chalcones,and6'—deoxychalcones.J.Biol.Chem.270,7922-7928.UrbanP,Werck-ReichhartD,TeutschHG,DurstF,RegnierS,KazmaierM,PomponD(1994).Characterizationofrecombinantplantcinnamate4-hydroxylaseproducedinyeast.Kineticandspectralproperties〇fthemajorplantP450ofthephenylpropanoidpathway.EurJBiochem.222:843—50VerduynC,Post腿E,ScheffersWA,VanDijkenJP.(1992).Effect〇fbenzoicacidonmetabolicfluxesinyeasts:acontinuous—culturestudyontheregulationofrespirationandalcoholicfermentation.Yeast.8,501—517.Wattsetal;WattsKT,MijtsBN,LeePC,ManningAJ,Schmidt—DannertC.(2006)Discovery〇fasubstrateselectivityswitchintyrosineammonia—lyase,amemberofthearomaticaminoacidlyasefamily.ChemBiol.13:1317—26.WieseW,VornamB,KrauseE,KindlH(1994).Structuralorganizationanddifferentialexpressionofthreestilbenesynthasegeneslocatedona13kbgrapevineDNAfragment.PlantMolBiol26,667—677,以下為本文中出現(xiàn)的核苷酸及氨基酸序列總結(jié)SEQIDNO:1為來自擬南芥的編碼苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)的核苷酸序列。SEQIDNO:2為SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:3為來自擬南芥的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL1)的核苷酸序列。SEQIDNO:4為SEQIDNO:3所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:5為來自圓葉大黃的編碼白藜蘆醇合酶(RES)的核苷酸序列。SEQIDNO:6為SEQIDNO:5所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:7為來自圓葉大黃的白藜，醇合酶(RES)核苷酸序列，其針對(duì)在釀酒酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。SEQIDNO:8為SEQIDNO:7所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:9為來自葡萄的編碼白藜蘆醇合酶(VST1)的核苷酸序列，其針對(duì)在釀酒酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。SEQIDNO:10為SEQIDNO:9所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:11-16為實(shí)施例1中表1中的引物序列。SEQIDNO:17-22為實(shí)施例16a中使用的引物序列。SEQIDNO:23-26為實(shí)施例16b中使用的引物序列。SEQIDNO:27-30為實(shí)施例16c中使用的引物序列。權(quán)利要求1.微生物用于產(chǎn)生赤松素的用途，其中所述微生物具有包含至少一種酶活性的有效代謝途徑，所述途徑從肉桂酸產(chǎn)生赤松素。2.權(quán)利要求l的用途，其中所述微生物產(chǎn)生肉桂酸，并從其產(chǎn)生赤松素。3.權(quán)利要求2的用途，其中所述赤松素在由以內(nèi)源性丙二酸單酰輔酶A為底物的酶所催化的反應(yīng)中產(chǎn)生。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中從肉桂酰輔酶A產(chǎn)生所述赤松素。5.權(quán)利要求4的用途，其中通過芪合酶從肉桂酰輔酶A產(chǎn)生所述赤松素。6.權(quán)利要求5的用途，其中所述芪合酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達(dá)，所述核酸對(duì)于該微生物來說不是天然的。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述芪合酶為來自以下來源的白藜，醇合酶(EC2.3.1.95):屬于落花生屬(Jmc/i/s)的植物；屬于大黃屬(及/i^/附)的植物；屬于葡萄屬(W似"或者以下任何屬的植物松屬(i^ViMs)、云沖》屬(P/cefl)、百合屬(丄///"附)、桉屬(五moi(v/^ws)、爬山虎屬(尸""/^mo"'ss"s)、白粉藤屬(CVssws)、蝶花百合屬(Cfl/oc/^似s)、蓼屬(iWj^M謂)、買麻藤屬(GVlC謂)、木菠蘿屬(v4r似c"/77M5)、假山毛櫸屬(A^/i(/"^is)、刺葵屬(尸/^ew/jc)、羊茅屬(i^s似ai)、薹草屬(CVimx:)、藜聲屬(Kem,n/iw)、羊蹄甲屬(5flw/w7i/fl)或老虎刺屬(i^m/c6/M附)。8.權(quán)利要求6的用途，其中所述芪合酶為來自以下來源的赤松素合酶(EC2.3.1.146):屬于松屬(i^iw)的植物，例如歐洲赤松(戶.^/veWn's)'北美喬+》CRs"o6m)、赤^"(A^wy/oni)、火炬木》(P屬于云杉屬(jP/cm)的植物；或者任何桉屬(五"c"/j;/7似s)植物之一。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途,其中在所述途徑中，在產(chǎn)生氨的酶催化反應(yīng)中從L-苯丙氨酸產(chǎn)生所述肉桂酸。10.權(quán)利要求9的用途，其中通過L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)從L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸。11.權(quán)利要求10的用途，其中所述苯丙氨酸氨裂合酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達(dá)，所述核酸對(duì)于該微生物來說不是天然的。12.權(quán)利要求ll的用途，其中通過來自以下來源的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC4.3.1.5)從L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸屬于擬南芥屬(Jf"6/^/w/s)的植物；屬于蕓苔屬(丑m^/cfl)的植物；屬于才甘橘屬(的植物；屬于菜豆屬(/Viflseo/ws)的植物；屬于木>屬(Pi7ims)的植物；屬于楊屬(i^/m/ws)的植物；屬于茄屬(5Wflwi/wi)的植物；屬于李屬(iV"M"s)的植物；屬于葡萄屬(的植物；屬于玉蜀黍?qū)?Ze")的植物；或者屬于以下任一屬的植物藿香屬(J^is似c/^)、鳳梨屬(JWflMfl51)、天門冬屬(y4s/mr"gWS1)、布氏蘭屬(.必fO附/ieflrf/fl)、簕竹屬(5fl附6"Sfl)、甜菜屬()、樺木屬(丑e^m/fl)、黃瓜屬(CV/CW附/S1)、山茶屬(Cfl柳e〃/fl)、辣椒屬(CVi戸'cw附)、決明屬(Owsifl)、長(zhǎng)春花屬()、鷹嘴豆屬(C/cw)、西瓜屬(CV>i///ms)、咖"^屬(Coj^e")、南瓜屬(CwcwW/to)、狗牙才艮屬(Q;wo^m)、胡蘿卜屬("做CMsO、石斛屬(Z)ewafro6/w附)、石竹屬(D/薦幼ws)、洋地黃屬(D&Yfl"s)、薯蕷屬("/oscomi)、按屬(五wcfl/"似s1)、GVi〃ws、銀杏屬(G7"&0)、大豆屬(G7戸W)、大麥屬(好onfe薩)、向日葵屬()、番薯屬(化o附oe")、萵苣屬(丄fl"wcfl)、紫草屬(丄/^5/e簡(jiǎn)w/m)、百脈根屬(丄o似s)、番癡屬(Z^co/7^*5iam)、苜蓿屬(Af(^Z/c"go)、蘋果屬(Af"/"s)、木薯屬(Maw/to)、苜蓿屬(Merf/oigo)、日中花屬(M^e附6owiAeww附)、煙草屬(7V,V^/"wfl)、木犀欖屬()、稻屬(Oo^fl)、豌豆屬(PZsmw)、鱘梨屬(尸ers^！)、歐芽屬(戶Wnse/iViw附)、蝴蝶蘭屬(iV^/"e/iopw's)、剛竹屬(iV^〃^toc/^s)、小立碗蘚屬(/^SrO附/^〃fl)、云杉屬(P/c^1)、梨屬(尸jtms)、櫟屬(jgMem/s)、蘿卜屬(jfl/;/^聽s)、地黃屬(及e/i廳朋iVi)、懸鉤子屬(勘6tis)、高粱屬(jSWg/rw附)、5^/r^iosWs1、繁緣屬()、錯(cuò)筆花屬(鄉(xiāng)/os"w^s1)、小麥屬(7WY/cm附)、車軸草屬(7>(/i//mi)、小麥屬(7h7/cw附)、越桔屬(Hicc,Vi/w附)、5L豆屬(Wg"")或百日草屬();或者來自曲霉屬(Js/7^^7/ms)的絲狀真菌。13.權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的用途，其中所述PAL接受苯丙氨酸為底物并由其產(chǎn)生肉桂酸，以使得如果該P(yáng)AL也接受酪氨酸為底物并由其形成香豆酸，則所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值小于l:l。14.權(quán)利要求13的用途，其中如果所述微生物產(chǎn)生肉桂酸-4-羥化酶(C4H)，則Kcat(PAL)/Kcat(C4H)比值為至少2:1。15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途,其中在所述途徑中，在ATP及輔酶A為底物、ADP為產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)中產(chǎn)生所述肉桂酰輔酶A。16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中在由4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酰輔酶A連接酶所催化的反應(yīng)中形成肉桂酰輔酶A。17.權(quán)利要求16的用途，其中所述4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶是來自以下來源的4-香豆酸輔酶A連接酶/肉桂酸輔酶A連接酶(EC6.2.1.12):屬于冷杉屬(J6/m)的植物，屬于擬南芥屬(Jm6/^/^/s)的植物，屬于蕓莒屬(丑m^/ai)的植物，屬于才甘橘屬(Ows)的植物，屬于落葉松屬()的植物，屬于菜豆屬()的植物，屬于松屬(尸/zi"s)的植物，屬于楊屬(iV/^/"s)的植物，屬于茄屬(5W"""附)的植物，屬于葡萄屬(FzY""的植物，屬于玉蜀黍?qū)?Zefl)的植物，或者屬于以下任一屬的植物藿香屬(v^"Wflc/ie)、紫穗槐屬(Jiwc77/^)、4艮杉屬(C"&"j;fl)、雪松屬(CWras)、番紅花屬(Otfo/s)、羊茅屬(i^W"ai)、大豆屬((7/jc/"e)、胡書匕屬(/"g/"/w)、S由才，屬(/Te^/eer/a)、紫草屬(丄/^Aos/7er附M附)、，繁、麥草屬(丄o/i'u附)、百脈根屬(丄齒5)、番癡屬(Z^考^/co")、蘋果屬(Ma/"s)、苜蓿屬(iV/^Z/cfl^)、曰中花屬(Afeswij^jflii^挑w附)、煙草屬(iWcWflWfl)、長(zhǎng)苞鐵杉屬(A^/iofe"gfl)、稻屬(6>o^")、天竺葵屬(iV/"f^m/w/M)、歐芽屬(i^^^se/z7iM柳)、'J、立碗蘚屬(iV^sc"o附/^^〃")、云#-屬()、李屬(7V簡(jiǎn)MS)、金錢松屬(/^w^/flr/;c)、黃杉屬(J^^tewgfl)、薔薇屬(及om)、懸鉤子屬(及h6ms)、及j;z"、甘蔗屬(5Vicc/iflf7/附)、堿蓬屬(Swflerffl)、鹽芥屬(T7ie〃Mwg/e〃fl)、小麥屬(7W"c謂)或鐵杉屬(R"gfl);來自屬于曲霉屬(^s/^^///"s)的絲狀真菌，屬于脈孢霉屬(A^inW/70m)的絲狀真菌，屬于亞羅酵母屬(KWTO兩'fl)的真菌，屬于球腔菌屬(A0;aw/7AflwC/fl)屬的真菌，屬于分4支桿菌屬(聊co6fl"m'謂)的細(xì)菌，屬于奈瑟氏菌屬(7V"、sm'fl)的細(xì)菌，屬于鏈霉菌屬(5^印M/i^cm)的細(xì)菌，屬于紅細(xì)菌屬(及/^^6fl"w)的細(xì)菌，或來自屬于鉤口線蟲屬(^ficj;/^to附fl)的線蟲，屬于隱桿線蟲屬(C"ewoWm6力Y/s)的線蟲，屬于血矛線蟲屬(^Tae附o/ic/ii/s)的線蟲,屬于蟲丘蟲5l屬(1"w^7'cms)的線蟲，屬于才艮結(jié)線蟲屬(Afe/^^5Jwe)的線蟲，屬于類圓線蟲屬(iftfY/fgj;/o,V/"s)的線蟲,或?qū)儆?V/WiVMc/i"s屬的線蟲。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中向所述微生物中重組引入了編碼所述代謝途徑中相應(yīng)酶的至少一種遺傳序列的至少一個(gè)拷貝。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中編碼苯丙氨酸氨裂合酶《遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中編碼白藜蘆醇合酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中編碼赤松素合酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。23.權(quán)利要求l的用途，其中所述微生物含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝，以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝，以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼白藜，醇合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。24.權(quán)利要求l的用途，其中所述微生物含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝，以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼赤松素合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述微生物是真菌。26.權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是絲狀真菌。27.權(quán)利要求26的用途，其中所述微生物屬于曲霉屬。28.權(quán)利要求27的用途，其中所述微生物是黑曲霉(y^/7^^i7/"sw/g")或米曲霉的菌林。29.權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是酵母。30.權(quán)利要求29的用途，其中所述微生物屬于以下屬酵母屬(5Vicc^n附j(luò)^s1)、克魯維酵母屬d/""m考ces1)、假絲酵母屬(CVmrfiV/fl)、畢赤酵母屬(朽cA/")、德巴利酵母屬("Wa柳j;c")、漢遜酵母屬(^m^/i"/fl)、亞羅酵母屬(KinwW")、接合酵母^(^Vgos^cc/ifln附y(tǒng)ces)'或裂殖酵母屬(5"c/r/^sttcc^fwiy^s)。31.權(quán)利要求30的用途，其中所述微生物是來自以下的菌林釀酒酵母(5Wc/rtf/"o考ces"rev/si"e)、A:/w"m'、51.6a^"聽s1、少抱酵母(乂ejc/gwws)、51.sevflOT'、葡萄汁酵母(51.Mvcrm附)、乳酸克魯維酵母絲酵母(CVm力V/fl"&7/s)、熱帶假絲酵母(CWn^/cato)、樹干畢赤酵母(P/c/r/"s咖VZ/s)、巴斯德畢赤酵母(A/7fl加Ws)、尸.sw*Mo/7/r//"、漢遜德巴利酵母(2^6"附j(luò);c^y/r"/i5wi//)、多形漢遜酵母(^T"mswim/"/;o(v柳or/7Afl)、解月旨亞羅酵母(！iwroM^Vi/^w(v,/c")、魯氏接合酵母(Z^osYicc/rfln7附j(luò)7c^yiwija7)或粟酒裂殖酵母(iS"c/^zos/icc/r"fwy;c^sv"附6e)。32.權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的用途，其中所述微生物是細(xì)菌。33.權(quán)利要求32的用途，其中所述微生物屬于埃希氏菌屬(五sr/renV^,Vi)或乳球菌屬(丄flc,ococcM51)。34.權(quán)利要求33的用途，其中所述微生物是大腸桿菌(￡scAw/c/Vico//)或乳酸乳球菌(Z^ic似cocc"s/fl"/s)菌林。35.編碼苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶以及白藜，醇合酶的核苷酸序列的異源表達(dá)用以產(chǎn)生赤松素的用途。36.編碼苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶以及赤松素合酶的核苷酸序列的異源表達(dá)用以產(chǎn)生赤松素的用途。37.—種生產(chǎn)赤松素的方法，其包括在產(chǎn)生赤松素的條件下培養(yǎng)具有產(chǎn)生赤松素之代謝途徑的微生物細(xì)胞，其中所述途徑包含接受苯丙氨酸為底物并由其產(chǎn)生肉桂酸的苯丙氨酸氨裂合酶(PAL),所述PAL使得如果該P(yáng)AL也接受酪氨酸為底物并由其形成香豆酸，則所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比小于l:l;并且其中如果所述微生物產(chǎn)生肉桂酸-4-羥化酶(C4H),則Kcat(PAL)/Kcat(C4H)為至少2:1。38.權(quán)利要求37的方法，還包括分離由此產(chǎn)生的赤松素。39.權(quán)利要求37或38的方法，其中所述培養(yǎng)在基本不存在肉桂酸或其衍生物的外部來源的情況下進(jìn)行。40.權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物細(xì)胞選自真菌和細(xì)菌。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述微生物細(xì)胞是選自酵母的真菌。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述酵母選自酵母屬。43.權(quán)利要求37至42中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物細(xì)胞缺少C4H的外源產(chǎn)生。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述微生物細(xì)胞缺少C4H的內(nèi)源產(chǎn)生。45.權(quán)利要求37至44中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物如權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)進(jìn)行使用。46.權(quán)利要求37至45中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)在選自以下可發(fā)酵碳底物的碳底物存在下進(jìn)行單糖、寡糖和多糖。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述可發(fā)酵碳底物為葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤蘚糖、蘇糖、核糖。48.權(quán)利要求37至47中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)在選自非可發(fā)酵碳底物的碳底物存在下進(jìn)行。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述非可發(fā)酵碳底物為乙醇、乙酸、甘油、乳酸。50.權(quán)利要求48的方法，其中所述非可發(fā)酵碳底物選自氨基酸。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述非可發(fā)酵碳底物選自苯丙氨酸。52.權(quán)利要求37至51中任一項(xiàng)的方法，還包括將所述產(chǎn)生的赤松素作為營(yíng)養(yǎng)物摻入食品或飼料產(chǎn)品中。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述赤松素在乳制品或飲料中用作營(yíng)養(yǎng)物。54.權(quán)利要求52的方法，其中所述赤松素在啤酒中用作營(yíng)養(yǎng)物。55.具有產(chǎn)生肉桂酰輔酶A并通過芪合酶的作用由其產(chǎn)生赤松素的有效代謝途徑的微生物，所述芪合酶使用肉桂酰輔酶A為底物時(shí)比使用4-香豆酰輔酶A為底物時(shí)具有更高的轉(zhuǎn)換率。56.權(quán)利要求55的微生物，其中所述芪合酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達(dá)，所述核酸對(duì)于該微生物來說不是天然的。57.權(quán)利要求56的微生物，其中所述芪合酶是屬于樹木物種的赤松素合酶o58.權(quán)利要求57的微生物，其中所述芪合酶是對(duì)于松屬、桉屬、云杉屬或橙桑屬物種來說天然的赤松素合酶。59.權(quán)利要求58的微生物，其中所述芪合酶是來自松屬物種例如歐洲赤木>(戶/""5、北美喬爭(zhēng)》CP/"WSWn6MS)、赤爭(zhēng)^(尸/WM5^/wiy^m)或火炬^^CP/"wsto^fl)的赤爭(zhēng)^素合酶(EC2.3.1.146)。權(quán)利要求55的微生物，其中通過L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)從L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸。60.權(quán)利要求59的微生物，其中所述苯丙氨酸氨裂合酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達(dá)，所述核酸對(duì)該微生物而言不是天然的。61.權(quán)利要求60的微生物，其中通過來自以下來源的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC4.3.1.5)從L-苯丙氨酸產(chǎn)生所述肉桂酸屬于擬南芥屬(Jm6iV/o/w/s)的植物，屬于蕓莒屬(5m^/c")的植物，屬于才甘橘屬(的植物，屬于菜豆屬(iV^s/"s)的植物，屬于爭(zhēng)〉屬(戶/"ws)的植物，屬于楊屬(i^/m/"s)的植物，屬于茄屬(5Wflwww)的植物，屬于李屬(/Vw"ms)的植物，屬于葡萄屬(的植物，屬于玉蜀黍?qū)?Ze")的植物，或者屬于以下任一屬的植物藿香屬(J^wtoc/^)、鳳梨屬(^4flfls)、天門冬屬(Js/mm^is)、布氏蘭屬人簕竹屬(5fl附6ws")、甜菜屬(5eto)、樺木屬(丑Cm/")、黃瓜屬(C"c"附/y)、山茶屬(CVnwe///")、辣椒屬(CVi/w/cm附)、決明屬(CViss,Vi)、長(zhǎng)春花屬(C"幼flmw^ws)、鷹嘴豆屬(C7cer)、西瓜屬(Ow〃ws)、咖啡屬(CV，j^")、南瓜屬(C"cwWto)、狗牙才艮屬(C>wo^w)、胡蘿卜屬(Z)flMCM51)、石斜屬(DeWfl^6/m附)、石竹屬(Z)/"w幼ms)、洋地黃屬(D/gzYfl/,'s)、薯蕷屬(D/05TOrefl)、桉屬(五wc"(V/7《ms)、Gfl〃ms、4艮杏屬(G7w紐o)、大豆屬(G7戸Vie)、大麥屬(^n/e畫)、向曰葵屬(仏/,Viw幼msO、番薯屬(T/7麵m")、萵苣屬(l"wai)、紫草屬(Z^/ios/;ef7fiM附)、百樂>才艮屬(1o^is0、番癡屬(Z^copersico/f)、苜蓿屬(M^/z'c"g()、蘋果屬(Ma/ws)、木薯屬(MflwiT^)、苜蓿屬(M^Z/aig^)、日中花屬(M^ew6owi幼e附m柳)、煙草屬(7V/c"W/flWfl)、木犀欖屬()、稻屬(0o;zfl)、豌豆屬(戶//附)、聘梨屬(i^raefl)、歐芽屬(i^/Y^e//""/!!)、蝴蝶蘭屬(iVm/fl^io^s/s)、剛竹屬(i^j;〃ostoc/y;s)、小立碗蘚屬人云杉屬(iVcefl)、梨屬(戶jtws)、櫟屬(Qw^tws)、蘿卜屬(及fl/7/^fll/s)、地黃屬(及eA附fl/f/l/fl)、懸鉤子屬(im辦ms)、高粱屬(5Vw^A謂)、5^/^腳s(y/,'s、繁縷屬(5te〃fl由)、鉛筆花屬(鄉(xiāng)/osflw幼es)、小麥屬(7Wrici/挑)、車軸草屬(7>(/i//mi)、小麥屬(7>,Y/cmw)、越桔屬(Hicc/"/"附)、SL豆屬(Wg/i")或百日草屬(Z/ww/fl);或者來自曲霉屬(的絲狀真菌。62.權(quán)利要求59至61中任一項(xiàng)的微生物，其中所述PAL接受苯丙氨酸為底物并由其產(chǎn)生肉桂酸，使得如果該P(yáng)AL也接受酪氨酸為底物并由其形成香豆酸，則所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比小于63.權(quán)利要求62的用途，其中如果所述微生物產(chǎn)生肉桂酸-4-羥化酶(C4H),則Kcat(PAL)/Kcat(C4H)比率為至少2:1。64.具有產(chǎn)生肉桂酰輔酶A并通過芪合酶的作用由其產(chǎn)生赤松素的有效代謝途徑的微生物，其中通過L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)從L-苯丙氨酸產(chǎn)生所述肉桂酸，所述PAL接受苯丙氨酸為底物并由其產(chǎn)生肉桂酸，使得如果該P(yáng)AL也接受酪氨酸為底物并由其形成香豆酸，貝，J所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比小于1:1。65.權(quán)利要求64的微生物，其中如果所述微生物產(chǎn)生肉桂酸-4-羥化酶(C4H)，則Kcat(PAL)/Kcat(C4H)比率為至少2:1。66.權(quán)利要求55至65中任一項(xiàng)的微生物，其中在ATP及輔酶A為底物、ADP為產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)中形成所述肉桂酰輔酶A。67.權(quán)利要求66的微生物，其中在4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶所催化的反應(yīng)中形成所述肉桂酰輔酶A。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達(dá)，所述核酸對(duì)于該微生物來說不是天然的。69.權(quán)利要求68的微生物，其中所述4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶是來自以下來源的4-香豆酸輔酶A連接酶/肉桂酸輔酶A連接酶(EC6.2.1.12):屬于冷杉屬(爿6/m)的植物，屬于擬南芥屬(Jm6/^/^/s)的植物，屬于蕓苔屬(5m^/c")的植物，屬于才計(jì)橘屬(CVYms)的植物，屬于落葉松屬(丄flWx)的植物，屬于菜豆屬(iV^iseo/ws)的植物，屬于爭(zhēng)^屬(尸/wms)的植物，屬于楊屬(/^/wz/ms)的植物，屬于茄屬(5W"w"w)的植物，屬于葡萄屬(W似s)的植物，屬于玉蜀黍?qū)?Zm)的植物，或者屬于以下任一屬的植物藿香屬(々"s,"由)、紫穗槐屬(』腳/7;/m)、銀杉屬(CM，)、雪松屬(C^/ri/s)、番紅花屬(Owms)、羊茅屬(/^對(duì)wai)、大豆屬(G7戸W)、胡杉&屬(Jwg/aws)、油杉屬(^TCe/eef/fl)、紫草屬(丄/幼o(hù)s/^7fiw附)、黑麥草屬(丄"http://"附)、百脈根屬(丄她s)、番癡屬(Z^co/7ersico")、蘋果屬(Mfl/"s)、苜蓿屬(M^Z/cflgo)、日中花屬(Af(^se附6owi^e附M附)、煙草屬(iV,V^/fl聽)、長(zhǎng)苞鐵杉屬(A^/^to"g")、稻屬(Oo;zfl)、天竺蔡屬(i^/flrgo/i/w附)、歐芽屬(/^^ywc/zViw柳)、小立碗薛屬(iVi戸o附/^〃fl)、云杉屬(iVcea)、李屬(iV簡(jiǎn)MS)、金錢松屬(i^e^/o/"f/x)、黃杉屬(i^Wflf她Wg")、薔薇屬(i0S")、懸鉤子屬(76ms)、及w"、甘蔗屬(5ViccAfln/附)、械蓬屬(iS"a^/fl)、鹽芥屬(77^//Mwg/W/fl)、小麥屬(rnY/cww)或鐵杉屬(r柳gfl);來自屬于曲霉屬(^s/^^///ms)的絲狀真菌，屬于脈孢霉屬(A^mw/^ni)的絲狀真菌，屬于亞羅酵母屬(Kinwv/fl)的真菌，屬于球腔菌屬(Afyc，/^"〃")屬的真菌；來自屬于分枝桿菌屬(Afyco^"m'謂)的細(xì)菌，屬于奈瑟氏菌屬(A^/swnVi)的細(xì)菌，屬于鏈霉菌屬(&r印to附j(luò);c")的細(xì)菌，屬于紅細(xì)菌屬(及/fo^6tt"w)的細(xì)菌；或來自屬于鉤口線蟲屬(爿MQ^Wo/wfl)的線，屬于隱桿線蟲屬(C7"^iof^6rf/^s)的線蟲，屬于血矛線蟲屬(^Tfle/iioMc/rws)的線蟲,屬于虹封l屬(丄M附6f/cMS)的線蟲，屬于才艮結(jié)線蟲屬(Afe//oflfo^^e)的線蟲，屬于類圓線蟲屬(/Sy/^w^v^"V/"s)的線蟲，或?qū)儆?V/W/o"cA"5屬的線蟲。70.權(quán)利要求55至69中任一項(xiàng)的微生物，其中向所述微生物中重組引入了編碼所述代謝途徑中相應(yīng)酶的至少一種遺傳序列的至少一個(gè)拷貝。71.權(quán)利要求55至70中任一項(xiàng)的微生物，其中編碼苯丙氨酸氨裂合酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。72.權(quán)利要求55至71中任一項(xiàng)的微生物，其中編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。73.權(quán)利要求72的微生物，其中所述肉桂酸輔酶A連接酶在以肉桂酸為底物時(shí)比以反式香豆酸為底物時(shí)顯示更高的活性。74.權(quán)利要求55至73中任一項(xiàng)的微生物，其中編碼赤松素合酶的遺傳序列的至少一個(gè)拷貝與在所述生物中不與所述遺傳序列天然關(guān)聯(lián)的表達(dá)信號(hào)有效連接。75.權(quán)利要求55、64或65的微生物，所述微生物含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼白藜蘆醇合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。76.權(quán)利要求55、64或65的微生物，所述微生物含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼苯丙氨酸氨裂合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼4-香豆酸輔酶A連接酶或肉桂酸輔酶A連接酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及含有與表達(dá)信號(hào)有效連接的編碼赤松素合酶的異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。77.權(quán)利要求55至76中任一項(xiàng)的微生物，所述微生物是真菌。78.權(quán)利要求77的微生物，所述微生物是絲狀真菌。79.權(quán)利要求78的微生物，所述微生物屬于曲霉屬。80.權(quán)利要求79的微生物，所述微生物是黑曲霉或米曲霉菌林。81.權(quán)利要求77的微生物，所述微生物是酵母。82.權(quán)利要求81的微生物，所述微生物是屬于以下屬的微生物酵母屬(iS"cc/rflr謂j^s)、克魯維酵母屬(^fi7""ero附j(luò);c^s)、假絲酵母屬(C""力V/fl)、畢赤酵母屬(P/c/^Vi)、德巴利酵母屬(DetowMyces)、漢遜酵母屬(H""m"m/")、亞羅酵母屬(Kw7wWfl)、接合酵母屬(Zy^w"ccAfl/wwj;c^s)或裂殖酵母屬(jSc/r/^sflcc/ifl/wiy;ce51)。83.權(quán)利要求82的微生物，所述微生物是來自以下的菌林釀酒酵母(5^cc/iflf麵j;c^sce^Ws/fle)、S.A/m"肌'、51.6fl^flwns、少孢酵母(S.ex&""s)、又^vfl^/、葡萄汁酵母(51.wv"r"附)、乳酸克魯維酵母(兀/fl"/s)、L柳flo:/flWMS1wm柳arx/fl簡(jiǎn)s、幼c削C^/yiw51、產(chǎn)阮假絲酵母(C.熱帶假絲酵母(C.^Y/7/Cflto)、樹干畢赤酵母(E幼》iVfe)、巴斯德畢赤酵母(E/ms加Ws)、EM^/似//ii7fl、漢遜德巴利酵母(De6fln附j(luò);c&s/rfl/isew//)、多形漢遜酵母(好flw耳eMw/fl/o(v附o/7;/rfl)、解月旨亞羅酵母()、魯氏接合酵母(Z^os^ccAar謂j;cesr冊(cè)x/i')或粟酒裂殖酵母(Sc^osflcc/ifi^附y(tǒng)c&s"附6e)。84.權(quán)利要求55至76中任一項(xiàng)的微生物，所述微生物是細(xì)菌。85.權(quán)利要求84的微生物，所述微生物屬于埃希氏菌屬或乳球菌屬。86.權(quán)利要求85的微生物，所述微生物是大腸桿菌或乳酸乳球菌菌林。87.用于生產(chǎn)赤松素的方法，包括在產(chǎn)生赤松素的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求55至86中任一項(xiàng)的微生物。88.含有微生物產(chǎn)生的赤松素的食品。89.微生物組合物，其包含微生物細(xì)胞以及基于干重為至少1.5mg/g的赤爭(zhēng)>素。全文摘要使用經(jīng)遺傳改造的微生物進(jìn)行赤松素生產(chǎn)，所述微生物具有產(chǎn)生肉桂酰輔酶A和通過茋合酶的作用由其產(chǎn)生赤松素的有效代謝途徑。所述肉桂酸可通過L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)由L-苯丙氨酸形成，PAL是一種接受苯丙氨酸為底物并由其產(chǎn)生肉桂酸的酶，優(yōu)選使得如果該P(yáng)AL還接受酪氨酸作為底物并由其形成香豆酸，則所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值小于1∶1，并且如果所述微生物產(chǎn)生肉桂酸-4-羥化酶(C4H)，則K_cat(PAL)/K_cat(C4H)的比值為至少2∶1。文檔編號(hào)C12P7/22GK101535488SQ200780033636公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年7月19日優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日發(fā)明者托馬斯·托馬森·杜爾許斯,漢斯·彼得·施密特,約亨·福斯特,薩拉·彼得森·比約恩,邁克爾·卡茨,馬林·森德柳斯,黑爾佳·大衛(wèi)申請(qǐng)人:弗盧克索姆科學(xué)公司