專利名稱：：用于確定微生物的dna片段化的方法用于確定微生物的DNA片段化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，且主要涉及微生物學(xué)，本發(fā)明的應(yīng)用范圍屬于衛(wèi)生保健(人類、獸醫(yī)學(xué)、環(huán)境和基礎(chǔ)研究)領(lǐng)域。鑒于細(xì)胞死亡意味著DNA片段化，因此本發(fā)明具體涉及用于確定微生物的DNA完整性的方法和用于評價微生物的DNA完整性的試劑盒。現(xiàn)有技術(shù)微生物可死于不同原因。細(xì)菌是與健康具有特殊關(guān)系的生物體，抗生素藥劑的作用導(dǎo)致其死亡的最終機制基本上不了解，這最有可能是因為這是一個淺顯的問題。抗生素影響重要的細(xì)胞內(nèi)過程，這遲早將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。盡管了解了特定抗生素的最初作用機制，但有時無法清楚地區(qū)分是抑菌作用還是殺菌作用。最近發(fā)現(xiàn)存在小部分永存細(xì)胞(persistentcells),盡管它們是突變的且在存在殺菌抗生素時不能生長，但所述抗生素不能將其殺死，這使得細(xì)胞死亡的情況變得特別復(fù)雜。所述永存細(xì)胞似乎可解釋為何生物膜和靜止培養(yǎng)物對化學(xué)治療藥劑具有高度抗性。此外，對大腸桿菌C&c/^n'c^a00//)所有基因的轉(zhuǎn)錄分布圖研究證實，在抗生素(作用機制差別很大)起作用之后，存在一組被誘導(dǎo)的基因，和以通常方式被抑制的其他的基因。這已經(jīng)在氨芐青霉素(一種細(xì)胞壁合成抑制劑)和氧氟沙星(一種氟喹諾酮，其阻斷DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，直接誘導(dǎo)DNA損傷)上得到證實(KaldaluN,MeiR，LewisK.Killingbyampicillinandofloxacininducesoverlappingchangesin^Esc/zm'c/w'aco//transcriptionprofile.AntimicrobAgentsChemother2004;48:890-896.)。這方面的知識提示，細(xì)菌的細(xì)胞死亡，例如經(jīng)殺菌性抗生素作用后，可能是程序化的過程，類似于高等生物體內(nèi)的凋亡現(xiàn)象。在單細(xì)胞酵母應(yīng)答于殺真菌劑時也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。在暴露于抗生素或不良環(huán)境條件后，自溶素造成細(xì)胞壁的自身消化，使得細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生自裂解，這可以是缺陷生物體的程序化細(xì)胞死亡的表現(xiàn)(LewisK.ProgrammedDeathinBacteria.MicrobiolMolBiolRev2000;64:503-514.)。從微生物學(xué)的最初階段開始，常規(guī)用于評價絕大多數(shù)化學(xué)治療作用研究的一直是評估細(xì)胞的生長，如在半固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生集落或在液體培養(yǎng)基中導(dǎo)致混濁的能力。除了相對費時以外，這一系統(tǒng)評價的也不是各個細(xì)胞的行為，而是整個群體的行為，并且只能用于能夠在體外培養(yǎng)的微生物。為了研究各個細(xì)胞的生命階段，則需要使用顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)(LecoeurH.Nuclearapoptosisdetectionbyflowcytometry:influenceofendogenousnucleases.ExpCellRes2002;277:1-14;SteensmaDP，TimmM，WitzigTE.Flowcytometricmethodsfordetectionandquantificationofapoptosis.MethodsMolMed2003;85:323-332)。一種可能的但并不常規(guī)的評價方法是使用活體染料評估細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性。僅在將細(xì)胞與外界隔離開的屏障發(fā)生改變時(這通常與滲透性休克引起的裂解相關(guān))，細(xì)胞才被活體染料染色。無論細(xì)胞死亡是通過直接損傷、通過酶系統(tǒng)、還是通過膜完整性的喪失所引起的，細(xì)胞死亡的過程中微生物染色體的DNA必然發(fā)生片段化。不過，在逐個細(xì)胞的原位研究中，尚未將染色體DNA完整性作為微生物死亡的參數(shù)進行評價。這是因為缺乏用于確定小于高等生物體的細(xì)胞的微生物的染色體DNA完整性的可行的、可靠的和開重復(fù)的技術(shù)。已經(jīng)有多種不同的原位方法學(xué)用于評價與誘導(dǎo)的損傷以及凋亡或壞死引起的細(xì)胞死亡有關(guān)的高等生物體細(xì)胞的DNA完整性。在此類方法學(xué)中比較突出是通過使用酶例如末端轉(zhuǎn)移酶(TUNEL)或DNA聚合酶(原位缺口翻譯ISNT)將標(biāo)記的核苷酸引入DNA斷裂處而對DNA斷裂處進行原位標(biāo)記(DidenkoV，ed./"w'加detectionofDNAdamage.HumanaPress,Totowa，NewJersey,2002.)。這些方法學(xué)基于對固定(fixed)于載片上的細(xì)胞使用酶，所述的酶作用于這些斷裂處的3'-OH端，即不進行化學(xué)修飾。因此，這些方法的效率是不規(guī)則的，僅有能夠被酶接近的那些斷裂點才能被標(biāo)記，這意味著結(jié)果的重復(fù)性較低。僅有一項研究中使用了TUNEL技術(shù)來檢測大腸桿菌和古細(xì)菌沃爾卡尼極嗜鹽菌(7/a/o/emxvo/ca"/z')中的細(xì)菌DNA斷裂點(RohwerFandAzamF.DetectionofDNADamageinProkaryotesbyTerminalDeoxyribonucleotideTransferase-MediateddUTPNickEndLabeling.ApplEnvironMicrobiol2000;66:1001-1006.)。該研究證實能夠在感染噬菌體之后檢測到細(xì)菌DNA片段化。不過，在某些情況下未能檢測到過氧化氫直接引起的斷裂。其原因可能是酶無法標(biāo)記具有修飾的3'-OH末端的斷裂點。此外，為了實施這些技術(shù)，細(xì)胞必須被固定(fixed)，這會影響標(biāo)記的功效。此外試劑也很昂貴，因此這些技術(shù)僅用于科學(xué)研究，無法將其用于常規(guī)評估DNA損傷和破壞。這些技術(shù)相對費時和復(fù)雜，因此通常無法用于微生物學(xué)，且目前沒有報道與之有關(guān)的其他研究。用于原位逐個細(xì)胞DNA完整性研究的另一種顯微鏡技術(shù)是彗星試驗或單個細(xì)胞電泳(OlivePL，DurandRE.HeterogeneityinDNAdamageusingthecometassay.Cytometry2005;66:1-8.)。將真核細(xì)胞置于載片上的瓊脂糖微凝膠內(nèi)，并用裂解溶液處理以提取膜和蛋白質(zhì)。收集類核(nucleoid),即去蛋白化的核，其中的DNA環(huán)區(qū)(DNAloops)己經(jīng)因去致密化而松散。將類核在充有緩沖液的槽中進行電泳，使得DNA纖維向正極遷移，形成沿電泳遷移方向具有頭部和尾部的彗星狀圖形。這些彗星狀圖形經(jīng)熒光染料染色以便通過熒光顯微鏡觀察。如果核具有DNA片段化，其大量片段將遷移，并濃聚于彗星的尾部。該技術(shù)十分敏感，但對于常規(guī)的臨床實驗室而言，是一種相對昂貴而復(fù)雜的試驗。實際上，其需要某些不太常用的儀器電泳電源和電泳槽以及用于捕獲和分析圖像的系統(tǒng)。由于上述原因，其僅用于研究目的。目前僅在一篇文獻中報導(dǎo)了將彗星技術(shù)在中性pH條件用于大腸桿菌中(SinghNP，StephensRE，SinghH，LaiH.VisualquantificationofDNAdouble-strandbreaksinbacteria.MutatRes1999;429:159-168)。該技術(shù)費時而且復(fù)雜，需要多次溫育，且對DNA斷裂的圖像的解析并不清楚。因此，還沒有在細(xì)菌中使用該技術(shù)的研究被報導(dǎo)?；谇笆隼碛烧J(rèn)為，目前對能夠常規(guī)并簡便地用于原位研究微生物的染色質(zhì)/DNA完整性的可靠方法仍有需求。必須建立或改進一種方法使之更快地并更有效地用于評價細(xì)菌的死亡，該方法特別關(guān)注由DNA降解所招致的或者是導(dǎo)致DNA降解的死亡。在這一領(lǐng)域中幾乎一直沒有任何創(chuàng)新。這樣的方法必須是有效的、易于實施、便宜且可用于基層實驗室。此外，其必須能夠在不同的實驗室之間獲得一致的結(jié)果，且必須能夠?qū)崿F(xiàn)自動化。DNA擴散試驗有些類似于單個細(xì)胞電泳分析，能夠評價其片段化。將浸沒于載片上的惰性瓊脂糖凝膠中的細(xì)胞裂解。如果細(xì)胞具有片段化的DNA，則片段會從原來的核中擴散至瓊脂糖介質(zhì)中，因此可觀察到DNA片段向周圍擴散造成的寬暈輪(VasquezM,TiceRR.Comparativeanalysisofapoptosisversusnecrosisusingthesinglecellgel(SCG)assay.EnvironMolMutagen1997;29:53)。該技術(shù)已經(jīng)用于真核細(xì)胞，主要是體細(xì)胞類型。顯示出DNA片段擴散的細(xì)胞對應(yīng)于那些死于凋亡過程的細(xì)胞(SinghNP.Asimplemethodforaccurateestimationofapoptoticcells.ExpCellRes2000;256:328-337)。該研究小組已經(jīng)成功地將這種分析的一些變體用于人類精子和其他動物物種的精子，該分析稱為精子染色質(zhì)擴散(SCD試驗)(RodriguezS，GoyanesV，SegrellesE，BlascoM，Gos&lvezJ，F(xiàn)erndndezJL.CriticallyshorttelomeresareassociatedwithspermDNAfragmentation.FertilSteril2005;84:843-845.;EncisoM，L6pez-Fern&ndezC,FernandezJL，GarciaP,GosdlbezA，Gos&lvezJ.AnewmethodtoanalyzeboarspermDNAfragmentationunderbright-fieldorfluorescencemicroscopy.Theriogenology2006;65:308-316.)。本發(fā)明的方法的變體與所述用于精子的技術(shù)的主要區(qū)別在于-不需要先與酸溶液溫育，僅需裂解。-用于裂解精子的溶液對微生物例如細(xì)菌無活性。TritonX-l00對裂解這些微生物無活性。因此，建議裂解時使用能夠變性蛋白質(zhì)的更強的去垢劑如SDS，并加入EDTA作為螯合劑，以便有助于去穩(wěn)定化細(xì)胞壁。從技術(shù)上來說，這些區(qū)別是指裂解細(xì)菌的壁，保留DNA的完整性。后者十分重要，這是因為由于細(xì)菌DNA相對于真核細(xì)胞而言相對缺乏蛋白質(zhì)，其可能更易于在處理和加工過程中受到醫(yī)源性破壞。使用高敏感性熒光染料，例如SYBR類的那些，如SYBRGold，能夠辨別微生物的類核DNA纖維，特別是可精確地顯示在這種DNA片段化事件中被擴散至瓊脂糖中的小DNA片段。這對于經(jīng)典的DNA熒光染料如碘化丙啶(PI)、溴化乙啶、吖啶橙、Hoechst33258或33342、或DAPI而言是做不到的。另一個額外的優(yōu)勢在于裂解過程中所需的溫育時間明顯縮短，因此相對于所公開的用于精子的方法而言更加快速。在本發(fā)明中，為了使用熒光顯微鏡進行觀察，穩(wěn)定微生物的DNA類核是必需的。這種小的類核非常脆弱，在暴露于熒光顯微鏡的光之后發(fā)生脫離并進行性地且快速地降解進入液體染色介質(zhì)中。這是一個關(guān)鍵的技術(shù)問題，該問題在精子或具有更大質(zhì)量的高等生物體的其他細(xì)胞類型的類核中并不出現(xiàn)。對于微生物，為了穩(wěn)定化類核并使之牢固粘附于載片，可進行干燥高熱溫育步驟。因此，在具有類核的載片己經(jīng)干燥后，在染色前，將其在微波爐中以高功率(750-1000W)溫育10分鐘。隨后可染色并觀察。另一種可能性是將載片在烤箱中以高溫，即80-100°C，溫育數(shù)小時。不過微波爐顯著加快了過程，有助于快速實施技術(shù)方案。這一穩(wěn)定化步驟對于本發(fā)明而言是至關(guān)重要的，因此該方法對于制備商品化的終產(chǎn)品具有高增值價值。從上文可知，本發(fā)明的方法產(chǎn)生微生物類核圖像，能夠清楚地辨別那些含有片段化DNA的類核。因此，采用所述方法可簡便而可靠地確定樣品的DNA片段化水平，這使得其可以被常規(guī)使用，且費用低廉。其可用于不同的臨床和基礎(chǔ)微生物學(xué)實驗室的微生物樣品。不過，具有這些特征的測定法尚未被用于確定微生物的DNA完整性。改進并調(diào)整該方法以評價(在先裂解細(xì)菌的壁以使得在此DNA片段化事件中發(fā)生DNA擴散之后)相對較小的基因組可能具有巨大的潛在意義。這樣便有可能得到一種相對簡便而快速的工具，其能夠使得以可重復(fù)的方式逐個細(xì)胞地原位評價細(xì)菌和其他微生物中的DNA斷裂。在經(jīng)裂解劑作用后，可通過在顯微鏡水平觀察片段化的DNA分子而快速分析細(xì)菌細(xì)胞死亡。該方法在研究、醫(yī)院、獸醫(yī)學(xué)或環(huán)境保護等方面所具有的有吸引力的多種潛在用途詳述如下，監(jiān)測具有間接或直接使DNA損傷和片段化之潛在能力的藥劑，它們可以是物理性的(離子輻射、紫外輻射)、化學(xué)性的(一般而言，防腐劑、抗生素、化學(xué)治療劑和抗微生物劑)、生物學(xué)的和酶性的(修復(fù)酶、由額外的模塊編碼的限制性酶或噬菌體)。*監(jiān)測對已知的或新的抗微生物藥物的敏感性。*確定能夠使DNA損傷和片段化的藥劑在不同的實驗條件或環(huán)境條件下的功效。*在天然微生物群或不同實驗室條件下(營養(yǎng)、老化、物理化學(xué)條件的改變?nèi)鐪囟?、pH、滲透壓、光等等)。，分析不同的野生菌株和突變菌株(例如耐抗微生物藥劑的菌株)對誘導(dǎo)DNA損傷的敏感性及其修復(fù)。發(fā)明描述本發(fā)明的目的涉及用于簡便、快速和準(zhǔn)確地評價微生物的DNA完整性的方法，且所述方法可用于微生物學(xué)研究實驗室的常規(guī)工作中。因此，本發(fā)明的第一個目的是用于評價微生物的DNA完整性的方法，包括以下步驟a)通過將所述微生物置于惰性介質(zhì)內(nèi)，不經(jīng)固定作用(fixing)而使之固定化(immobilizing)于載片上；b)以裂解溶液處理以提取細(xì)胞壁、膜和蛋白質(zhì)，保留所述微生物的DNA;c)穩(wěn)定化所述載片上的所述微生物的DNA類核；和d)染色并評價DNA完整性。先將微生物置于類似于水性懸液的介質(zhì)內(nèi)，優(yōu)選地置于惰性微凝膠內(nèi)，特別是瓊脂糖微凝膠內(nèi)，所述介質(zhì)可在合適的支持物上制備，例如在玻璃蓋片上制備。裂解溶液的選擇對實現(xiàn)本發(fā)明的目的至關(guān)重要。需要使用陰離子或陽離子型蛋白質(zhì)變性去垢劑，例如十二垸基硫酸鈉(SDS)、烷基苯磺酸鹽、N-十二烷基肌氨酸鹽(Sarkosyl)、水合乙醇酸鹽及其混合物，.優(yōu)選地使用SDS。這些去招劑引起膜高度破壞，帶來裂解效應(yīng)，它們同時也是活性蛋白質(zhì)變性劑。它們用在蛋白質(zhì)遷移的變性電泳中，以保證完全變性(失去三維結(jié)構(gòu))。它們是高活性去垢劑。使用非離子型的非蛋白質(zhì)變性去垢劑，即溶解蛋白質(zhì)但不使之變性的去垢劑，對許多微生物通常不能有效地裂解。加入乙二胺四乙酸(EDTA)十分重要，因為它起著]^++陽離子螯合劑的作用，該陽離子穩(wěn)定細(xì)菌的外膜，特別是革蘭氏陰性菌的膜(coat)。還可以加入細(xì)胞壁或蛋白質(zhì)的裂解性蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，裂解溶液含有其他有助于去穩(wěn)定化細(xì)胞壁和有助于隨后提取的試劑。已經(jīng)驗證，有效的溶液含有0.001至2M的二硫蘇糖醇(DTT)、0.001至2M的2-氨基-2-(羥甲基)-l，3-丙二醇(Tris)、0.001至2M的EDTA、和0.1%至3%的SDS，pH為6.5至10.5。特別是合適的溶液含有約0.1MDTT、約0.01MTris、約0.05MEDTA和約2%SDS，pH為約10。裂解之后，必須穩(wěn)定載片上的DNA類核，使之在暴露于熒光顯微鏡的光時不會降解和脫離。最快和最有效的系統(tǒng)是在濃度逐漸升高的醇浴中溫育脫水之后，將載片在微波爐中干燥。所產(chǎn)生的熱將核苷酸牢固地粘附于載片。這是本發(fā)明的一個關(guān)鍵的、特殊的步驟?？墒褂貌煌墓β什y試不同的時間。一種可能性是使用最大功率加熱2-15分鐘。另一種可能性是將干燥的載片在烤箱或干燥箱中以高溫即40-100。C溫育一或數(shù)小時，但由于該技術(shù)過程較長而不是特別推薦。在步驟a)、b)和c)之后，本發(fā)明的方法還包括評價微生物DNA完整性的步驟。盡管有多種可選的評價方法，但優(yōu)選的方法是觀察。為此，該方法優(yōu)選地包括在步驟a)、b)和c)之后對樣品進行染色的步驟。鑒于微生物的DNA相對較少，所述染色必須使用具有高倍鏡(通常IOOX)的顯微鏡以高敏感性染料進行。因此，優(yōu)選地使用基于熒光顯微鏡的采用DNA特異性熒光染料的系統(tǒng)，特別是那些能夠提供最大的敏感性和穩(wěn)定性的系統(tǒng)。其種類廣泛且仍在持續(xù)增加。一些實例為GdRed、EvaGreen以及其他花青衍生物例如SYBR類、PicoGreen類的那些、以及TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO畫PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO-PRO、JO-PRO、PO-PRO、LO-PRO的變體，等等?？赏ㄟ^觀察者來評價結(jié)果，將觀察到的各個類核分配至預(yù)先建立的損傷等級。優(yōu)選地也可使用用于捕獲數(shù)字化圖像并偶聯(lián)于用來定量確定損傷水平的軟件的系統(tǒng)進行評價。本發(fā)明的第二個目的是制備用于評價微生物DNA完整性的試劑盒，其基本上包括a)預(yù)處理的玻璃載片，其用于支持并保留具有微生物的微凝膠；b)用于混合并容納微凝膠中的微生物的溶液；c)用于提取壁、膜和蛋白質(zhì)的裂解溶液；和d)用于染色DNA的熒光染料。所述試劑盒能夠進行上述的方法。本發(fā)明的第三個目的涉及開發(fā)用于自動化測定微生物DNA片段化水平的軟件。圖1顯示了通過實施本發(fā)明的方法而獲得的來自大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物的類核。完好的類核在載片上是致密、平坦的，觀察不到提示DNA片段化的連續(xù)性溶液。在培養(yǎng)物中偶爾可見來自自發(fā)死亡細(xì)胞的具有大量片段化DNA的類核(上方)。圖2顯示了不同進展程度的大腸桿菌DNA損傷a-完好的類核(0級)。b:DNA斷裂后具有不連續(xù)周邊片段的相對較大的類核(l級，輕度損傷)。c:更加松散的類核，占據(jù)較大面積，DNA斷裂后具有不連續(xù)周邊片段，相對較大(2級，中度損傷)。d:明顯更加松散且擴大的類核，DNA斷裂后具有大量周邊片段(3級，高度損傷)。e:具有大量DNA片段化的類核，由裂解后擴散于瓊脂糖介質(zhì)中的多個小片段形成，形成更寬的擴散面(4級，大量損傷)。圖3顯示了用于檢測DNA斷裂的DBD-FISH技術(shù)，與Cy3標(biāo)記的全基因組大腸桿菌DNA探針雜交(A)。具有擴散片段的類核具有顯著的標(biāo)記，而其余的類核僅顯示明顯不連續(xù)的基線標(biāo)記。以DAPI復(fù)染DNA(B)。圖4顯示了將本發(fā)明的方法用于鮑氏不動桿菌(A^eto^c^6做ma""")樣品。顯示了兩個完好的類核以及另外兩個DNA碎裂為片段的類核。圖5顯示了將大腸桿菌暴露于10mM過氧化氫IO分鐘后，出現(xiàn)大量細(xì)菌DNA片段化。圖6顯示了在與環(huán)丙沙星(lpg/ml)溫育不同時間后觀察到大腸桿菌DNA損傷。a:0分鐘。b:2.5分鐘。c:5分鐘。d:15分鐘。e:40分鐘。在5分鐘后已經(jīng)觀察到初始損傷水平，并隨溫育時間延長而逐漸增加。圖7:與氨芐青霉素(300嗎/ml)溫育20分鐘(a)和24小時(b)之后觀察到的大腸桿菌類核。20分鐘后沒有觀察到DNA片段，但24小時后，底部被DNA片段占據(jù)。圖8顯示了大腸桿菌類核的片段擴散暈輪或環(huán)區(qū)松散的平均面積變化(像素，y-軸)(A)和莢膜(B)的平均面積變化，時間為與環(huán)丙沙星10pg/ml溫育后40分鐘(x-軸)。圖9的示意圖顯示了逐步測定所遵循的規(guī)程以及為產(chǎn)生細(xì)菌DNA片段化最終報告的決策方法。圖10顯示了用于分區(qū)并確定ROI的三種方法的實例，在數(shù)字捕獲裝置上進行，顯示的細(xì)菌視野中包括3個具有正常DNA的細(xì)菌和2個具有片段化DNA的細(xì)菌(左上方圖像)。其余圖像相應(yīng)于使用原始圖像的電子濾鏡，這可用作一種可遵循的策略以便更加容易地區(qū)分兩類細(xì)胞。圖11顯示了9個不同實驗系列中的平均摻入密度，其中選擇的是具有未片段化DNA的細(xì)菌(l)和具有片段化DNA的細(xì)菌(2)。根據(jù)非片段化DNA(l)相對于片段化DNA(2)的標(biāo)準(zhǔn)，圖的上部顯示的是每個實驗的平均值，而圖的下部顯示的是每組的總體平均值。發(fā)明詳述如下文所詳述的那樣，本發(fā)明的方法和試劑盒是用于確定具有片段化DNA的微生物的頻率的簡便而可靠的系統(tǒng)。本發(fā)明的方法可評價微生物的DNA完整性，其包括以下步驟a)通過將所述微生物置于惰性介質(zhì)內(nèi)，不經(jīng)固定作用(fixing)而使之固定化(immobilizing)于載片上；b)以裂解溶液處理以提取細(xì)胞壁、膜和蛋白質(zhì)；c)穩(wěn)定化所述載片上的類核DNA;和d)染色并評價DNA完整性。以下詳述本發(fā)明的方法連同一些變化和任選的步驟。本領(lǐng)域人員可以理解，在保留所述的必需方面的條件下可以有其他的實施方式和可能性。A)第一步是制備樣品。通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法獲得并驗證液體樣品中的微生物濃度。適合分析的濃度范圍在每毫升0.1至20x106個微生物。如果樣品過于濃縮，可根據(jù)微生物適當(dāng)通過以培養(yǎng)基或鹽水/磷酸緩沖液(PBS)等稀釋而調(diào)整至合適的濃度。推薦在低照度條件下進行處理以避免處理和溫育過程中發(fā)生光誘導(dǎo)的DNA損傷。樣品需要放置于支持物上以便根據(jù)本發(fā)明的方法進行處理并有助于對其進行評價。支持物優(yōu)選地是玻璃載片，其上涂覆標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖膜。為此，在科普林氏缸或類似物品中制備置于蒸餾水內(nèi)的0.2至1%的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖溶液。蓋上多孔塑料片并置于微波爐內(nèi)。將微波爐的功率調(diào)整至300-1000W,優(yōu)選地500W，間或攪動容器以便瓊脂糖更好地溶解。也可使用恒溫水浴進行這一處理。當(dāng)瓊脂糖溶液完全透明后，便可以將其置于容量為10至250ml的垂直管中。這些管需要在水浴中提前調(diào)溫至60-100。C，優(yōu)選地為70。C，以保持瓊脂糖溶液為液態(tài)。載片必須干凈。用鑷子夾住載片的基部，將載片垂直浸沒達l-60秒，取出并再次浸沒1到10次，直至載片上形成均質(zhì)的膜。將其水平放置于平而冷卻至1到15°C的表面上，優(yōu)選地4°C，該表面例如是玻璃的或金屬的。將載有載片的盤放入4°C冰箱至少30分鐘，直至確認(rèn)瓊脂糖溶液已經(jīng)在載片的表面形成膠凍。從冰箱內(nèi)取出托盤，以吸水紙清潔載片表面曾與盤接觸的位置。然后將載片水平放入干燥箱，溫度為37-100°C，直至瓊脂糖完全干燥并形成粘附于玻璃上的薄膜。這樣處理過的載片可立即使用或儲存于密封的盒中，在室溫存放數(shù)月。為了便于處理含有所述微生物的樣品，將其置于具有類似于懸液的特征的介質(zhì)內(nèi)，例如瓊脂糖微凝膠。在這種情況中，在蒸餾水或磷酸緩沖鹽(PBS)中制備低熔點/低膠凝溫度的瓊脂糖溶液，濃度為0.5至2%。使用微波爐或恒溫水浴融化瓊脂糖，隨后置于管中，放入恒溫水浴或干燥箱，保持在30至37°C。在微量離心管或類似容器中將樣品與瓊脂糖溶液小心混合，使得后者的濃度在0.3至1%;例如，70微升的瓊脂糖溶液+30微升的樣品。重要的是瓊脂糖溫度不能高于37。C，以便不破壞微生物。最后，為了獲得位于支持物上樣品，將涂覆好的載片置于平而冷卻的玻璃或金屬表面上，溫度在1至15°C，防止形成氣泡。推薦使用微量加液器滴加一滴5至200微升的混合物，將蓋片放置在液滴上面。為防意外，推薦各樣品均一式兩份進行處理，并且每次采用該技術(shù)時均使用對照樣品。將載有載片的盤放入4°C冰箱達2至30分鐘，直至形成合適的瓊脂糖膠凍。一旦形成膠凍，可在冰箱內(nèi)輕柔地移除蓋片，避免損壞微凝膠。B)—旦適當(dāng)制備了樣品，為了能夠簡便和重復(fù)處理樣品，根據(jù)本發(fā)明的方法使用裂解處理步驟來處理它們以便提取壁、膜和蛋白質(zhì)。為此，將各載片以水平位浸沒于含有裂解溶液的容器中。在優(yōu)選的實施方式中，溶液的組成為0.001至2M、優(yōu)選地0.01至0.8M的二硫蘇糖醇(DTT);0,001至2M、優(yōu)選地0.005-0.4M的2-氨基-2(羥甲基)-l，3-丙二醇(Tris);0.001至2M、優(yōu)選地0.01-1M的乙二胺四乙酸(EDTA)和0.1至3%、優(yōu)選地0.5-2.5。/。的十二垸基硫酸鈉(SDS)。將溶液的pH調(diào)整至6.5至10.5，優(yōu)選地調(diào)整至IO，例如使用NaOH調(diào)整。也有其他可選的裂解溶液，含有其他額外的添加劑，或者所述溶液的濃度和溫育時間和溫度可以變化，條件是保持其必需的功能性特征。因此，作為DTT的替代物的化合物例如為J3-巰基乙醇和其他還原劑。作為Tris的替代物的緩沖液例如可使用Hepes、Mops、Pipes。作為EDTA的替代物的螯合劑例如可使用EGTA等等。作為SDS的替代物可使用前面提到的其他陽離子或陰離子型去垢劑。根據(jù)使用的溶液和樣品的類型，制備物可在裂解溶液中溫育1至120分鐘、優(yōu)選地1至35分鐘，特別優(yōu)選地是5分鐘；溫度為1至45°C，優(yōu)選地為18°C-40°C，特別優(yōu)選地是37。C。裂解溶液處理之后，可洗滌制備物以清除殘余的溶液。為此，可將載片水平置于盡可能溫和的洗滌溶液中，避免螯合劑或去垢劑。例如，將其以水平位浸沒于含有大量蒸餾水或緩沖液或生理鹽水的容器內(nèi)，時間為1至60分鐘。.隨后將樣品脫水。為此，可使用濃度逐漸增加的醇。例如，將載片提起并水平浸沒于含有一系列濃度逐漸增加的乙醇的容器內(nèi)，乙醇濃度在5至100%，各持續(xù)30秒至60分鐘，然后使制備物風(fēng)干。醇的溫度可在-20°C至室溫。優(yōu)選地使用-20°C的醇以便促進DNA沉淀，各持續(xù)5分鐘。作為乙醇系列濃度的替代物，可將制備物在不同的醇溶液例如甲醇溶液中溫育脫水，或使之風(fēng)干或在干燥箱內(nèi)干燥。重要的是載片要完全干燥，使得DNA粘附于其上，這是因為當(dāng)暴露于熒光顯微鏡的光束之后DNA通常會脫離。為此，推薦使其在高溫下干燥長時間。例如，推薦在80°C溫育至少60分鐘。一旦完全干燥，可將處理過的含有樣品的載片避光存放于室溫的文件盒內(nèi)達數(shù)月。這有助于將根據(jù)本發(fā)明的方法的處理和隨后的評價微生物DNA完整性的步驟分離開。存檔使得能夠以不同的時間間隔重復(fù)評價同一種微生物的多個樣品。C)干燥之后，關(guān)鍵的是要使DNA類核溫度并牢固粘附于載片，這是因為當(dāng)暴露于熒光顯微鏡的光束之后DNA類核通常會脫離。為此，將干燥載片在微波爐內(nèi)溫育，功率為300-1000W，優(yōu)選地為500W，時間為5-10分鐘?；蛘?，盡管不是十分推薦，但也可在烤箱或干燥箱內(nèi)高溫溫育載片一或數(shù)小時。一旦完全干燥，可將處理過的含有樣品的載片避光存放于室溫的文件盒內(nèi)達數(shù)月。這有助于將根據(jù)本發(fā)明的方法的處理和隨后的評價微生物DNA完整性的步驟分離開。存檔使得能夠以不同的時間間隔重復(fù)評價同一種微生物的多個樣品。D)樣品經(jīng)上述方法處理之后，可進行染色和評價步驟。如上所述，多種方法可用于評價微生物的DNA完整性。在優(yōu)選的實施方式中，樣品被染色以便觀察評價。通過常規(guī)選擇染色條件，可獲得高質(zhì)量的圖像和高度一致性的評價結(jié)果。鑒于微生物的基因組相對較小，選擇熒光顯微鏡用于觀察DNA，因為其敏感性較高。用于熒光顯微鏡觀察的染色-根據(jù)所擁有的熒光濾鏡，樣品的染色可使用DAPI、Hoechst33258、溴化乙啶、碘化丙啶等類型的DNA特異性熒光染料。不過，優(yōu)選地是具有更高敏感性的熒光染料例如GelRed、EvaGreen和其他花青衍生物例如SYBR類、PicoGreen類的那些、TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO隱PRO、JO-PRO、PO-PRO、LO-PRO的變體，等等。熒光染料的數(shù)量和品質(zhì)目前在增加。為了避免熒光喪失，可加入抗衰減介質(zhì)(例如Vectashield-VectorH-1000,DABCO;等等)。不過，這些介質(zhì)通常導(dǎo)致彌散熒光，而明亮的背景對圖像的對比度造成影響。優(yōu)選地使用包封在水性緩沖液中的高敏感而相對不感光的熒光染料，并在其變干之前相對快速評價樣品。必要時，可洗滌載片并再次染色。最后，評價微生物的DNA完整性?？赏ㄟ^直接觀察分析研究所得圖像，或優(yōu)選地采用軟件分析通過偶聯(lián)于顯微鏡平臺的數(shù)字相機或類似物得到的數(shù)字化圖像(實施例9)。最初推薦每一樣品研究至少500-1000個微生物，采用以下DNA損傷分級(圖2):0級無片段化DNA的微生物DNA類核相對保持致密，無連續(xù)性溶液。l級具有輕度DNA損傷的微生物類核看起來致密，但具有DNA斷裂后的不連續(xù)周邊片段，相對較大。2級具有中度DNA損傷的微生物類核更加松散，占據(jù)較大面積，DNA斷裂后具有不連續(xù)周邊片段，相對較大。3級具有高度DNA損傷的微生物類核明顯更加松散且擴大，DNA斷裂后具有大量周邊片段。4級具有大量片段化DNA的微生物它們表現(xiàn)為或多或少的點狀DNA片段的寬而擴散的暈輪，DNA片段按照梯度擴散于瓊脂糖介質(zhì)中。在因片段擴散而造成的暈輪的大小與DNA片段化之間建立相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)來自采用DBD-FISH技術(shù)所獲得的結(jié)果(Fern&idezJL，GoyanesVJ，Ramiro-DiazJ，Gos&lvezJ.ApplicationofFISHforinsitudetectionandquantificationofDNAbreakage.CytogenetCellGenet1998;82:251-256;FernandezJL,Vdzquez-GundinF，DelgadoA，GoyanesVJ，Ramiro-DfazJ，delaTorreJ，GosSlvezJ.DNAbreakagedetection-FISH(DBD-FISH)inhumanspermatozoa:technicalvariantsevidencedifferentstructuralfeatures.MutatRes2000;453:77-82;FernandezJL,GosSlvezJ.ApplicationofFISHtodetectDNAdamage:DNABreakageDetection-FISH(DBD-FISH).MethodsMolBiol2002;203:203-216;FerndndezJL，GoyanesV,GosdlvezJ.DNABreakageDetection-FISH(DBD-FISH).In:RautenstmussB，LiehrT，eds.FISHtechnology-Springerlabmanual.Heidelberg:Springer-Verlag;2002;282-290)。此方法允許檢測和定量經(jīng)可控DNA變性處理的去蛋白質(zhì)化的細(xì)胞核內(nèi)的DNA斷裂。這種變性從斷裂端產(chǎn)生單鏈DNA節(jié)段，可通過使用熒光染料標(biāo)記的全基因組DNA探針通過原位雜交并通過熒光顯微鏡觀察而對其進行檢測。細(xì)胞DNA的斷裂水平越高，由變性溶液產(chǎn)生的單鏈DNA的量就越大，發(fā)生雜交的探針的量就越大且觀察到的熒光就越強。在裂解后，將根據(jù)本發(fā)明的方法處理后的樣品暴露于堿性變性溶液2.5分鐘，22°C。該溶液產(chǎn)生來自DNA中存在的斷裂端的單鏈DNA節(jié)段。因此，使用全基因組DNA探針的雜交強度將與細(xì)菌DNA中存在的斷裂的量有關(guān)。因此，已經(jīng)肯定的是，具有片段的松散類核顯示出DBD-FISH的強標(biāo)記，這證實它們的DNA存在大量片段化(實施例1和圖3)。其余類核顯示出該探針的標(biāo)記水平極低，相當(dāng)于對類核的實際處理所產(chǎn)生的雜交背景。所描述的方案對絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌有效。在所述細(xì)菌中，裂解溶液足以裂解細(xì)胞壁并觀察到整個細(xì)菌染色體以及在DNA片段化的情況下出現(xiàn)的DNA片段擴散。為了分析具有堅固細(xì)胞壁的細(xì)菌如革蘭氏陽性菌，在置于微凝膠內(nèi)之前需要先將它們在含有裂解壁的酶的懸液中溫育。例如，葡萄球菌需要重懸在含有溶葡萄球菌酶(20pg/ml)的Tris-EDTA(TE)緩沖液內(nèi)。腸球菌需要在含有溶菌酶(2mg/ml)和變?nèi)芫?50pg/ml)的混合物的Tris-EDTA(TE)緩沖液內(nèi)溫育。酵母細(xì)胞溫育在含1M山梨醇，0.1MEDTA,15mMP-巰基乙醇，pH7.5和消解酶(200U/ml)、溶細(xì)胞酶或葡聚糖酶(Glucalase)的緩沖液內(nèi)(LigozziM，F(xiàn)ontanaR.IsolationoftotalDNAfrombacteriaandyeast.AfrJBiotech2003;2:251-253)。溫育需要在37°C進行至少5-30分鐘，且微生物溶液需要與低熔點瓊脂糖混合以便納入微凝膠內(nèi)。其他一些酶目前不是很常用，但也可有效裂解革蘭氏陽性菌，例如無色肽酶且特別是Labiase(NiwaT，KawamuraY,KatagiriY,EzakiT.Lyticenzyme，labiaseforabroadrangeofGram-positivebacteriaanditsapplicationtoanalyzefiinctionalDNA/RNA.J.MicrobiolMethods2005;61:251-260)。另一種方法是與溶菌酶(5mg/ml)和24%聚乙二醇20,000在37°C溫育2小時(MaassenCBM.Arapidandsafeplasmidisolationmethodforefficientengineeringofrecombinantlactobacilliexpressingimmunogenicortolerogenicepitopesfororaladministration.JImmunolMethod1999;223:131-136)。7疑膠裂解物可以是堿性的。使用有機溶劑(丙酮、丁醇、甲苯等等)也可有助于破裂細(xì)菌壁(HarrisonSTL.Bacterialcelldisruption:akeyunitoperationintherecoveryofintracellularproducts.BiotechAdv1991;9:217-240)。不推薦通過超聲或使用破裂顆粒攪動這樣的機械系統(tǒng)來破裂細(xì)胞壁，因為它們可破壞所述微生物的DNA。本發(fā)明還預(yù)期用于評價微生物DNA片段化的試劑盒。試劑盒含有裂解溶液和熒光染料。試劑盒還含有經(jīng)瓊脂糖預(yù)處理的支持物，例如，以及用于制備介質(zhì)的溶液，所述介質(zhì)的特征類似于將含有樣品的懸液，例如，用于制備微凝膠的低熔點瓊脂糖溶液。以下詳述根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的試劑盒的內(nèi)容及其使用方式。試劑盒的內(nèi)容經(jīng)過預(yù)處理的載片*微量離心管，含有140微升的含1%低熔點瓊脂糖的蒸餾水或PBS，膠凍狀含裂解溶液*的管。組成0.01MTris，0.05MEDTA,0.1MDTT,2%SDS，pH10(以NaOH調(diào)整)。熒光染料有蓋的容器，用于與裂解溶液進行水平溫育小刀用于微量離心管的浮子*按說明書所述制備所需材料和儀器熒光顯微鏡(推薦浸沒透鏡)4。C冰箱37°C干燥箱80°C干燥箱或盤(任選)37°C水浴塑料手套玻璃蓋片(18x18mm，22x22mm或24x60mm)微量加液器4個盒子，用于水平溫育蒸餾水70%，90%,100%乙醇使用說明制備每一載片的樣品1)將有蓋的水平溫育容器內(nèi)的裂解溶液置于37。C干燥箱。2)在培養(yǎng)基或PBS內(nèi)稀釋微生物樣品，濃度為5-10x106/ml制備瓊脂糖微凝膠3)將含有膠凍狀瓊脂糖的微量離心管置于浮子內(nèi)，使之達到蓋子的水平，在90-100°C的水中漂浮5分鐘直至瓊脂糖融化?；蛘咴谖⒉t內(nèi)融化瓊脂糖。4)將微量離心管連同浮子轉(zhuǎn)移至37°C恒溫水浴，放置5分鐘直至溫度達到平衡。.7)使用微量加液器向微量離心管內(nèi)加入60微升的微生物樣品并重懸。8)在4。C冷表面(例如，如金屬或玻璃片)上放置預(yù)處理的載片。9)待載片冷卻后滴加微生物懸液和瓊脂糖并放置玻璃蓋片，避免形成氣泡。對于18x18mm、22x22mm或24x60mm的蓋片，分別推薦滴加一滴12、20或50微升。10)將冷表面和載片置于冰箱，讓樣品凝固5分鐘。處理樣品11)使用手套，通過輕輕滑動而移除蓋片，并立即將載片水平地置于含有裂解溶液的容器內(nèi)，加蓋并在37°C干燥箱或水浴中溫育5分鐘。12)使用手套，用小刀提起載片。保持其水平并將其水平放置于含有大量蒸餾水或緩沖液的盒內(nèi)以洗去裂解溶液，溫育5分鐘。13)將載片水平地置于含有70%乙醇的盒內(nèi)(5分鐘)，然后置于另一個含有90%乙醇的盒內(nèi)(5分鐘)，且最后是100。/。的乙醇(5分鐘)，-20。C。14)風(fēng)干，并置于微波爐內(nèi)以500-1000W加熱3-10分鐘，或默認(rèn)方式，80°C干燥箱內(nèi)至少一小時或過夜。干燥后，將處理過的載片存放于文件盒內(nèi)室溫避光存放達數(shù)月。染色樣品用于熒光顯微鏡觀察根據(jù)所擁有的熒光濾光片，以EvaGreen(綠色)或GdRed(紅色)類型的DNA特異性熒光染料染色樣品。SYBR類的熒光染料，特別是SYBRGold，具有良好的分辨率并具有一定程度的光穩(wěn)定性。儲存和穩(wěn)定性室溫儲存。有效期(Shdf-life):試劑和材料的穩(wěn)定期至少為6個月。推薦將裂解溶液保持在垂直位置并封嚴(yán)。針對本發(fā)明的一些特定方面給出以下實施例，它們在任何情況下均無意于限制本發(fā)明的范圍。實施例l:證實顯示片段擴散的類核內(nèi)存在DNA斷裂將所描述的方法用于對數(shù)生長期的大腸桿菌菌株TG1樣品，所述菌株生長在37°C的LB培養(yǎng)基中，以便在具有片段化DNA的細(xì)菌中自發(fā)產(chǎn)生DNA節(jié)段擴散暈輪。為此，以PBS或LB培養(yǎng)基將樣品稀釋至濃度為10-20x106/ml，與1%低熔點液體瓊脂糖混合以便使得后者的終濃度達到0.7%。待微凝膠在載片上凝結(jié)后將樣品在裂解溶液中37°C溫育5分鐘，所述裂解溶液的組成為0.01MTris,0.05MEDTA，0.1MDTT，2%SDS，pH10(以NaOH調(diào)整)。用生理鹽水洗滌載片5分鐘。隨后使用全基因組大腸桿菌DNA探針在實際的細(xì)胞上順序形成DBD-FISH(DNABreakageDetection-Fluorescence/"5VfwHybridization;Femdndezetal.,1998;2000;2002;FemdndezandGosdlvez，2002)。該方法允許檢測和定量浸沒于瓊脂糖微凝膠內(nèi)的細(xì)胞核的DNA斷裂，所述細(xì)胞的核是去蛋白質(zhì)化的并進行了可控的DNA變性。變性產(chǎn)生來自斷裂端的單鏈DNA節(jié)段，可使用標(biāo)記了發(fā)射紅色熒光(Cy3)的熒光染料的全基因組大腸桿菌DNA探針通過原位雜交對其進行檢測。DNA的斷裂水平越高，由變性溶液產(chǎn)生的單鏈DNA的量就越大，發(fā)生雜交的探針的量就越大且得到的紅色熒光就越強。根據(jù)本發(fā)明的方法，處理的樣品含有由變性溶液產(chǎn)生的來自DNA中存在的可能斷裂端的單鏈DNA。因此，使用全基因組DNA探針的雜交強度將與大腸桿菌類核中存在的斷裂的量有關(guān)。計數(shù)了250個隨機獲得的細(xì)胞。使用冷卻的具有兩種濾片的CCD相機捕獲了染色質(zhì)彌散暈輪的DAPI染色圖像，用于同時觀察呈現(xiàn)為藍(lán)色的彌散暈輪和呈現(xiàn)為紅色的雜交信號。目的在于確認(rèn)具有DNA片段擴散的類核存在這樣的DNA斷裂。通過DBD-FISH，結(jié)果證實具有DNA片段擴散的類核具有高強度的DNA斷裂標(biāo)記(圖3)。因此，通過簡單地確定DNA片段的擴散(所述片段是通過本發(fā)明的方法獲得的)，可簡便而直接地估計DNA片段化。實施例2:評價不同細(xì)菌菌種的自發(fā)性DNA片段化取9種生長于培養(yǎng)皿中的細(xì)菌并確定所述樣品中具有DNA片段化的細(xì)菌的頻率。處理的細(xì)菌如下大腸桿菌、陰溝腸桿菌(五"/ero^^/wc/oacae)、銅綠假單胞菌(尸sew(iowowasam^g/"osa)、奇異變形桿菌(/VofeMs脂'ra6/fe)、沙門氏菌屬(Sa/mowe〃asp;.)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stewofrop/zomoMos附a/to;/H7z'a)、鮑氏不動桿菌、催產(chǎn)克雷伯菌(X/e6w'e〃aox_y/ocfl)、月巿炎克雷伯菌(X/efes/e/A3p"gM7wo"/ag)。在瓊脂糖微凝膠內(nèi)溫育各樣品，在各載片上進行3個18x18mm微凝膠，每一個對應(yīng)于一種不同的細(xì)菌。各載片的一個微凝膠對應(yīng)于同一種大腸桿菌培養(yǎng)物，作為結(jié)果和處理的對照組。載片在裂解溶液溫育，鏡洗滌、脫水，在80。C干燥3小時，以SYBRGold染色，熒光顯微鏡檢查。每個菌種計數(shù)1000個細(xì)胞。結(jié)果顯示于表l。在所有被分析的菌種中裂解均可有效獲得類核(圖4)。還在所有菌種中觀察到具有類核的細(xì)胞，類核中的DNA大量片段化(4級)，擴散至瓊脂糖介質(zhì)。這種片段化是在培養(yǎng)物中以自發(fā)的、基線的方式發(fā)生的，沒有經(jīng)過任何藥劑的誘導(dǎo)，其頻率在各種培養(yǎng)物之間是不同的。'微生物DNA片段化大腸桿菌5,24奇異變形桿菌5.91鮑氏不動桿菌39.59銅綠假單胞菌3.35沙門氏菌屬嗜麥芽窄食單胞菌6.29表l:6種細(xì)菌中具有片段化DNA的細(xì)胞的百分比分布。實施例3:與不同抗微生物藥劑溫育后評價DNA片段化，外源藥劑引起的損傷作為示例性實施例，本研究設(shè)計用于確定由加入到大腸桿菌菌株TG1培養(yǎng)物內(nèi)的3種抗生素(氨芐青霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星)以及羥基產(chǎn)生劑(過氧化氫(11202))誘導(dǎo)的可能的DNA損傷，該菌株對上述所有藥劑均敏感，該菌株在LB培養(yǎng)基中處于對數(shù)生長期。這些藥劑具有不同的抗微生物作用機制。氨芐青霉素是卩-內(nèi)酰胺抗生素，其結(jié)合于PBP(青霉素結(jié)合蛋白)并激活自溶素后影響細(xì)胞壁肽聚糖合成。慶大霉素是氨基糖甙類抗生素，結(jié)合于細(xì)菌核糖體的蛋白p10，在30S亞單位水平影響蛋白質(zhì)合成。環(huán)丙沙星是喹諾酮類抗生素，通過抑制DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV而誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。這些藥劑與液體LB培養(yǎng)基混合，濃度和溫育時間見表2。經(jīng)過所述時間的溫育后，根據(jù)本發(fā)明的方法處理細(xì)菌，以確定具有片段化DNA的細(xì)菌的百分比。同時，另一測試量的樣品與活力染料溫育。這是一種染料排斥試驗，使用的是綠色熒光染料SYBRGreenII(其結(jié)合DNA并穿透所有細(xì)胞)和紅色熒光染料碘化丙啶(PI)(其僅穿透具有膜功能缺陷的細(xì)胞，這些細(xì)胞被認(rèn)為是"死"細(xì)胞)。"活"細(xì)胞因此被染色為綠色，因為它們排斥紅色染23料，而"死"細(xì)胞不能排斥紅色染料因此被PI染色。結(jié)果顯示于表2。在各個實驗點研究了5,000個細(xì)菌，觀察到慶大霉素、環(huán)丙沙星和過氧化氫僅誘導(dǎo)對PI具有通透性的膜的細(xì)胞出現(xiàn)非常離散的增加，而所述增加在氨芐青霉素組卻十分驚人。但氨節(jié)青霉素與慶大霉素類似，幾乎不增加具有片段化DNA的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。但環(huán)丙沙星和&02在高濃度則誘導(dǎo)所有被檢測的細(xì)胞出現(xiàn)大量DNA片段化(4級，圖5)。這一結(jié)果證實，作為活力指標(biāo)，評價膜通透性并非一個普遍適用的參數(shù)，而研究DNA可提供該染色所無法提供的有價值的補充信息，反之亦然?；盍θ旧巹┚哂型ㄍ感缘目涨v膜DNA片段化對照0.500.050.30氨芐青霉素[300|ig/ml](40min)50.005.004.20慶大霉素[300ng/ml](40min)10.000.503.70環(huán)丙沙星[25ng/ml](40min)5.000.30100.00H2O2[10mM](10min)5.000.30100.00表2:經(jīng)不同抗微生物藥劑作用后被活力染料染色的大腸桿菌的百分比和具有片段化DNA的細(xì)菌的百分比。實施例4:評價微生物對特定藥劑的敏感性和抗性研究了環(huán)丙沙星在DNA水平對敏感型大腸桿菌菌株(TG1)以及對該抗生素具有抗性的另一種菌株的作用，細(xì)菌生長于對數(shù)期。平均生長抑制濃度(MIC)為0.012|ig/ml。相反，商品化測試中所使用的最大濃度(MI032ng/ml)對抗性菌株的生長沒有影響。研究了給LB培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)物施加的6個濃度的環(huán)丙沙星，作用40分鐘，活力染色研究按照類似于前面實施例所述的方式進行(表3)，并根據(jù)本發(fā)明的方案研究DNA損傷水平。在敏感菌株中，當(dāng)抗生素劑量增加至所使用的最高劑量水平時，對PI具有通透性且具有空莢膜的細(xì)胞出現(xiàn)非常離散的增加?；?4力染色在抗性菌株中沒有檢測到任何效應(yīng)?；盍θ旧舾芯昕剐跃戥h(huán)丙沙星劑量具有通透性的空莢膜具有通透性的空莢膜對照(O.OOng/ml)0.400.000.660.030.50fig/ml0.950.050.650.001.00ng/ml1.040.000.720.102.50pg/ml2.600.150.870.105.00ng/ml2.670.241.080.1010.00ng/ml3.600.480.820.15表3:暴露于劑量逐漸增加的環(huán)丙沙星之后，敏感菌株和對抗生素具有抗性的另一菌株中被活力染料染色的大腸桿菌的百分比。在敏感菌株中，在實驗中所使用的最低濃度(0.5pg/ml)即觀察到DNA水平的損傷。此外，使用該濃度，損傷水平相當(dāng)于4級，即預(yù)先設(shè)立的等級中最高的一個(圖2)。所有這些微生物均顯示出大量的片段化DNA，具有點狀DNA片段的寬而擴散的暈輪，DNA片段按照梯度從類核的中心區(qū)域擴散于瓊脂糖介質(zhì)中。超過0.5pg/ml的劑量似乎并沒有改變片段化圖像，或許可觀察到稍微多一些的擴散，特別是在類核的中心區(qū)域。這可能代表環(huán)丙沙星引起的DNA損傷效應(yīng)接近飽和。實施例5:確定接近MIC的低劑量環(huán)丙沙星對DNA完整性的可能影響在確定了高濃度環(huán)丙沙星誘導(dǎo)大量DNA片段化之后，希望能夠確定這一技術(shù)是否能區(qū)分暴露于低濃度的該抗生素對敏感性大腸桿菌菌株(TG1)在DNA完整性水平的影響，所述濃度高于、低于和等于MIC水平(0.012pg/ml)。使用的劑量見表4，溫育時間為40分鐘，細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中，處于對數(shù)生長期。表4顯示了活力染色的結(jié)果。盡管當(dāng)劑量增加時出現(xiàn)了對PI具有通透性和具有空莢膜的細(xì)胞的百分比增加這一趨勢，但與所使用的低劑量相比并不顯著。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表4:敏感菌株暴露于劑量逐漸增加的低劑量環(huán)丙沙星之后，被活力染料染色的大腸桿菌的百分比。通過本發(fā)明的方法確定DNA損傷水平。最高劑量(O.lpg/ml)超過MIC，該劑量顯示出對所有被分析的細(xì)胞造成損傷。此類損傷在不同細(xì)胞之間趨向于是均一的，與使用0.5pg/ml及以上劑量的前一實施例中造成的大量破壞相比，程度較低。不過，損傷的程度也是可觀的，類似于3級(圖2)。該水平被定量為高度DNA損傷。類核看起來非常松散和擴大，具有DNA斷裂之后的大量周邊片段。類似于MIC的劑量在不同的類核之間也引起清楚而均一的損傷，但程度類似于分級的第2級(圖2)。這相當(dāng)于中度DNA損傷。類核看起來松散，與無處理的對照組相比占據(jù)更大的面積，具有DNA斷裂后的不連續(xù)周邊片段，相對較大。0,006pg/ml的劑量為二分之一MIC，也在不同的類核之間誘導(dǎo)清楚而均一的損傷，在主觀性損傷分級中其程度介于1級和2級之間(圖2)。最后，0.003]ug/ml的劑量為三分之一MIC，也誘導(dǎo)明顯的損傷，但為1級。這相當(dāng)于輕度DNA損傷，其中類核看起來致密，但具有DNA斷裂后的不連續(xù)周邊片段，相對較大(圖2)?？傊?，本發(fā)明的方法具有高分辨力，以至于甚至能夠檢測到非常低濃度的環(huán)丙沙星所誘導(dǎo)的損傷，所述濃度低于MIC，其不明顯抑制細(xì)菌的生長，也不影響由活力染色所確定的"活力"。有可能此類低損傷水平能夠被酶性DNA修復(fù)機制修復(fù)，使得細(xì)胞仍有活力。實施例6:確定能夠?qū)е聶z測到敏感型大腸桿菌菌株中的DNA損傷的環(huán)丙沙星最短溫育時間逐漸縮短對LB培養(yǎng)基內(nèi)的對數(shù)生長的大腸桿菌菌株TG1的溫育時間40分鐘、15分鐘、5分鐘、2.5分鐘和0分鐘，環(huán)丙沙星劑量為1pg/ml。也包括無環(huán)丙沙星對照。置于微凝膠內(nèi)并在冰箱內(nèi)冷卻所需的平均時間估計為1.5分鐘?？梢约俣股卦谶@一時間內(nèi)起作用，因此應(yīng)該給所分析的各時間加上1.5分鐘。40分鐘后，所有細(xì)菌顯示出大量DNA破壞(4級；圖6)。15分鐘的時間也被證明起作用。在這種情況中，不同的類核之間的損傷也趨向于是均一的，但具有明顯更低程度的中度損傷(2級)(圖6)。造成檢測到明顯DNA損傷的最短時間為5分鐘，為輕度損傷(l級)，不過與0分鐘和對照組相比，2.5分鐘似乎可觀察到類核損傷略有增加，但難以評價。因此，通過本發(fā)明的技術(shù)發(fā)現(xiàn)，致死性的環(huán)丙沙星劑量引起的DNA損傷是隨時間而累積的，其不是即刻的，也不是在相對短的時間內(nèi)產(chǎn)生的。使用1^g/ml的劑量時，造成檢測到DNA水平的最低效應(yīng)的最短的溫育時間為5分鐘+1.5分鐘=6.5分鐘。實施例7:在培養(yǎng)物與不作用于DNA水平的抗生素溫育24小時后觀察DNA損傷目的是觀察既便最初沒有DNA水平的損傷，細(xì)胞死亡是否意味著DNA后期出現(xiàn)片段化。為此，將生長于液體LB培養(yǎng)基內(nèi)的對數(shù)生長期大腸桿菌菌株TG1與氨節(jié)青霉素(300ng/ml)溫育24小時。這種|3-內(nèi)酰胺抗生素在結(jié)合PBP(青霉素結(jié)合蛋白)并激活自溶素之后影響細(xì)胞壁肽聚糖合成。為進行比較，測試量的培養(yǎng)物經(jīng)處理40分鐘后，用于活力染色或通過本發(fā)明的技術(shù)確定DNA損傷。表5所示為活力染色的數(shù)據(jù)。與P-內(nèi)酰胺抗生素溫育20分鐘后，具有改變的壁、具有通透性或具有空莢膜表現(xiàn)的細(xì)胞百分比顯然增加。溫育一天后，更是顯著增加，特別是具有空莢膜表現(xiàn)的細(xì)胞，從活力染色這一點來看幾乎所有細(xì)胞看起來均是死亡的。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表5:與氨芐青霉素溫育后通過活力染料被染色的大腸桿菌的百分比。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)確定的DNA損傷證實，溫育20分鐘后與對照相比沒有觀察到區(qū)別。但'24小時后，類核幾乎沒有密度，并顯示出松散的表現(xiàn)，缺乏清楚的中心區(qū)域。最為驚人的是在制備物的底部均勻分布的大量點狀的降解DNA片段(圖7)。本發(fā)明的方法證實，盡管細(xì)胞的死亡最初不是因直接的DNA損傷所致，但隨著時間可間接導(dǎo)致大量DNA損傷。實施例8:環(huán)丙沙星在敏感型大腸桿菌菌株中產(chǎn)生的DNA損傷的進展，使用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)評價損傷將400微升LB培養(yǎng)基內(nèi)的對數(shù)生長期大腸桿菌菌株TG1與10pig/ml環(huán)丙沙星溫育40分鐘。隨后離心細(xì)菌并重懸于400微升無環(huán)丙沙星的培養(yǎng)基中。該操作重復(fù)一次以洗去抗生素。細(xì)菌溫育0、15、30、60和卯分鐘后，按照本發(fā)明的方法處理細(xì)菌。在各時間點的同一載片上同時處理無抗生素處理的對照組。經(jīng)SYBRGold染色后使用冷的高敏感性CCDKX32ME相機(ApogeeInstruments,Roseville,CA)捕獲圖像。隨后通過用Visilog5.1程序(Noesis,France)設(shè)計的宏指令分析圖像。這樣可以對視野的底部和照度等的差異進行分區(qū)和校正。將以像素表示的細(xì)菌染色總面積、殘留莢膜面積和分散的DNA環(huán)區(qū)或片段暈輪的面積(總面積一莢膜面積)等結(jié)果輸入Excel表。最后通過SPSS12.5程序采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-WallisH檢驗對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)研究(p0.05)。結(jié)果證實環(huán)丙沙星引起的雙鏈DNA斷裂在該抗生素自培養(yǎng)基中被清除之后是可修復(fù)的。處理后即刻可觀察到高度片段化(3級-4級)。15分鐘后開始檢測到片段擴散暈輪面積的下降，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，所述片段較大。在30至60分鐘期間所述暈輪繼續(xù)緩慢縮小，片段越來越少，90分鐘后明顯減小，程度更大。(圖8A)。在這種情況中，不再檢測到片段，而與無處理的對照組(0級)相比，DNA松散環(huán)區(qū)沒有區(qū)別。這樣便得到了DNA斷裂修復(fù)動力學(xué)，溫育卯分鐘后，所述DNA看起來己經(jīng)完全修復(fù)。不過，這并不代表修復(fù)總是正確的。有趣的是，與其余的檢測時間相比，在60和90分鐘之后，細(xì)菌莢膜的大小平均增大約兩倍(圖8B)。這種增大在不同細(xì)菌之間是不規(guī)則的，具有異質(zhì)性。本發(fā)明的方法證實了一個具有高度臨床意義的事實，即保持長時間的正確的抗生素劑量是重要的。如果提前停用抗生素，最初給細(xì)菌造成的損害是可恢復(fù)的。實施例9:產(chǎn)生自動化測定DNA片段化水平的軟件采用本發(fā)明實施例6所述的方法，已經(jīng)設(shè)計了一種基本的方法學(xué)，其確定了采用常規(guī)的圖像分析系統(tǒng)對具有片段化DNA和非片段化DNA的細(xì)菌所產(chǎn)生的圖像進行形態(tài)學(xué)表征的基礎(chǔ)。該方法可自動地辨別這兩種類型的細(xì)菌，因此是客觀的。該總體方法包括兩種策略的設(shè)計1)用于交互式捕獲圖像并基于所分析的元素的數(shù)量進行決策的模塊(圖9)。2)用于選擇ROI(興趣區(qū))的分區(qū)規(guī)程(圖IO)。在這一實施例中，使用冷的具有12-bit色深度的單色CCD相機在熒光顯微鏡(xl00)下直接捕獲。圖像保存為.tiff格式，并釆用公眾域ScionImage程序(NIHIMAGEUSA)進行處理。該程序含有用于進行分區(qū)操作所需的最少的工具，并可測定所處理的圖像中摻入的熒光的密度。所摻入的密度通過減去背景而使得AOI中不同灰度級的總和與面積相關(guān)聯(lián)。采用這一工具，進行了9個系列的實驗，其中捕獲了100個含有非片段化DNA的細(xì)菌和100個具有片段化DNA的細(xì)菌。結(jié)果顯示，當(dāng)分組和比較標(biāo)準(zhǔn)是具有片段化DNA的細(xì)菌對不具有片段化DNA的細(xì)菌時，在各系列之間產(chǎn)生了非常相似的值。因此可以基于圖像分析環(huán)境進行客觀觀察而區(qū)分這兩種類型的細(xì)菌DNA狀態(tài)。盡管在這種情況中測定的僅是熒光區(qū)域和所選區(qū)域的強度，但也有與各種類型的圖像所產(chǎn)生的特質(zhì)相關(guān)的其他標(biāo)準(zhǔn)，因此可以對兩種群體進行表征和區(qū)分。權(quán)利要求1、用于評價微生物的DNA完整性的方法，包括以下步驟a)通過將所述微生物置于惰性介質(zhì)內(nèi)，不經(jīng)固定作用(fixing)而使之固定化(immobilizing)于載片上；b)以裂解溶液處理以提取細(xì)胞壁、膜和蛋白質(zhì)；c)穩(wěn)定化所述載片上的所述微生物的DNA類核；和d)染色并評價DNA完整性。2、權(quán)利要求l的方法，其中步驟a)是任選的。3、權(quán)利要求1和2中任一項的方法，其中所述裂解溶液包含離子型蛋白質(zhì)變性去垢劑。4、權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述離子型去垢劑選自十二烷基硫酸鈉(SDS)、烷基苯磺酸鹽、N-十二垸基肌氨酸鹽(Sarkosyl)、水合乙醇酸鹽、及其混合物。5、權(quán)利要求4的方法，其中所述離子型去垢劑優(yōu)選地是十二烷基硫酸鈉(SDS)。6、權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述裂解溶液包含0.001至2M的二硫蘇糖醇(DTT);0.001至2M的2-氨基-2(羥甲基)-l，3-丙二醇(Tris);0.001至2M的乙二胺四乙酸(EDTA)、和0.1%至3%的十二烷基硫酸鈉(SDS)。7、權(quán)利要求6的方法，其中所述裂解溶液的pH值被調(diào)整為6.5至10.5。8、權(quán)利要求6和7中任一項的方法，其中所述裂解溶液優(yōu)選地包含0.1M二硫蘇糖醇(DTT);0.01M(羥甲基)-l,3-丙二醇(Tris);0.05M乙二胺四乙酸(EDTA)和2n/。十二垸基硫酸鈉(SDS)。9、權(quán)利要求8的方法，其中使用NaOH將所述裂解溶液的pH值調(diào)整為大約10。10、權(quán)利要求1的方法，其中使用熒光染料溶液進行步驟d)的所述染色。11、權(quán)利要求1的方法，其中含有所述微生物的所述樣品包括于惰性微凝膠中。12、權(quán)利要求11的方法，其中含有所述微生物的所述樣品優(yōu)選地包括于瓊脂糖微疑膠中。13、權(quán)利要求1的用于評價微生物的DNA完整性的方法，其中通過干熱法、在微波爐內(nèi)溫育具有裂解樣品的載片而快速進行所述微生物的DNA的穩(wěn)定化和粘附。14、權(quán)利要求1的用于評價微生物的DNA完整性的方法，其中通過直接觀察分析進行所述評價。15、權(quán)利要求1的用于評價微生物的DNA完整性的方法，其中使用分析數(shù)字化圖像的軟件自動進行所述評價，所述數(shù)字化圖像是通過偶聯(lián)于顯微鏡平臺的相機獲得的。16、用于在前述權(quán)利要求的方法中對微生物的DNA完整性進行評價的計算機程序。17、用于評價微生物的DNA完整性的試劑盒，其包含a)經(jīng)過預(yù)處理的載片；b)瓊脂糖溶液；C)裂解溶液；和d)熒光染料。18、權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述裂解溶液包含0.001至2M的二硫蘇糖醇(DTT);0.001至2M的2-氨基-2(羥甲基)-l,3-丙二醇(Tris);0.001至2M的乙二胺四乙酸(EDTA)、和0.1%至3%的十二烷基硫酸鈉(SDS)。19、權(quán)利要求16和17中任一項的試劑盒，其中所述裂解溶液的pH值被調(diào)整為6.5至10.5。20、權(quán)利要求16至18中任一項的試劑盒，其中所述裂解溶液優(yōu)選地包含O.IM二硫蘇糖醇(DTT);0.01M(羥甲基)-l,3-丙二醇(Tris);0.05M乙二胺四乙酸(EDTA)、和2M十二烷基硫酸鈉(SDS)。21、權(quán)利要求16至19中任一項的試劑盒，其中使用NaOH將所述裂解溶液的pH值調(diào)整為大約10。全文摘要本發(fā)明涉及確定微生物的DNA完整性的方法和用于評價其中的DNA完整性的試劑盒。由于細(xì)胞死亡意味著DNA片段化，因此使用本發(fā)明的方法可以簡單、快速而精確的方式清楚地辨別微生物內(nèi)的DNA片段化水平。文檔編號C12Q1/68GK101589156SQ200780043246公開日2009年11月25日申請日期2007年11月8日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者G·巴烏阿雷瓦洛,J·L·費爾南德斯加爾恰,J·戈薩瓦茲貝倫格爾,L·穆列爾里奧斯,M·卡爾泰利赫斯塔爾,V·戈亞內(nèi)斯比利亞埃斯庫薩申請人:馬德里自治大學(xué)