專利名稱：細胞陣列或矩陣組件以及電穿孔的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞陣列和矩陣組件，具體而言涉及懸浮于流體內(nèi)的 細胞從該流體到基板的轉移。
背景技術：
在基因治療和藥物發(fā)現(xiàn)領域的研究中的一個重要步驟是將細胞分
配(disposition)到基板上的陣列或矩陣內(nèi)。通常通過制備流體內(nèi)包含 特定濃度的細胞的樣品且隨后從針配給(dispense)來達成這一點。為 了保證期望的細胞尺寸，制備樣品可包括過濾的步驟。該技術的限制 之一為可以構建該陣列或矩陣的速度。另一限制為，難以可靠地從懸 浮液單獨地配給細胞。在膜片箝(patch clamp)技術中，玻璃板內(nèi)的 亞細胞尺寸的孔陣列可用于通過負壓來附著細胞，見例如Fertig等人， Biophysics Journal, June 2002， 82(6)， p. 3056。
基因治療和藥物發(fā)現(xiàn)領域內(nèi)的研究經(jīng)常涉及例如用于引入諸如 DNA的物質到細胞內(nèi)的電穿孔。這通常是通過將小滴的物質分配到每 個細胞并施加電場來達成，其中該電場臨時增大細胞膜的滲透性。
因此，用于將細胞從流體轉移到基板的更高效技術將是有益的， 特別是使得細胞的在先過濾變得多余的技術將是有益的。

發(fā)明內(nèi)容
相應地，本發(fā)明優(yōu)選地旨在單一地或者任意組合地減輕、減緩或 者消除一個或多個前述缺點。具體而言，本發(fā)明的目的可看作是改善 細胞從其所懸浮的流體轉移以在基板上形成細胞陣列或矩陣的效率。 本發(fā)明的另一目的可看作是能夠實現(xiàn)預定尺寸范圍內(nèi)的細胞的轉移。 這些目的以及若干其它目的基于本發(fā)明第一方面通過提供一種用于將 懸浮于流體內(nèi)的細胞從該流體轉移到基板的設備來實現(xiàn)，該設備包括 容器，用于容納該流體；以及轉移裝置，具有外表面、內(nèi)腔和多個通 道，每個通道具有位于該外表面的第一端以及與該腔流體連通的第二端，且每個通道具有與待轉移的細胞的預定尺寸相對應的直徑，且該
設備還包括壓力調(diào)節(jié)裝置，能夠調(diào)節(jié)該腔內(nèi)的壓力從而在每個通道 的第一和第二端之間建立壓力差；以及流動裝置，在與該流體接觸時 能夠致使該流體流過該外表面。
通過恰當?shù)剡x擇通道直徑、壓力差和流體流速，該轉移裝置可用 于拾取預定尺寸范圍內(nèi)的細胞。比通道直徑小的細胞通過該通道被吸 入，且非常大的細胞不保持抵住通道的第一端，這是因為太大流體拖 曳作用在這些非常大的細胞上。因此，通過使用本發(fā)明的設備，從生 物樣品選擇靶細胞類型的復雜樣品制備步驟可以簡化或者甚至略去。 此外，細胞被單獨地處理，使得細胞所轉移到的基板上的細胞陣列或 矩陣在每個分離的位置僅具有一個細胞。該轉移裝置例如可以對應于
在打印機中使用的噴墨頭，或者是在一側可以加壓的具有噴嘴陣列的 平坦基板。
本發(fā)明的設備可包括檢測器，用于檢測通道何時被細胞阻擋； 以及控制器，用于致使該轉移裝置移動到第二位置，其中在該第二位 置，該壓力差是可控的，使得該細胞將從該通道釋放且附著到該基板。 例如，在細胞轉移之前，要求預定比例的通道被阻擋。
附著細胞的平均位置附近的該容器內(nèi)的該流體的速度V優(yōu)選地在 0.1 Vcha八V〈10Vchw的范圍，其中特征速度為
Vchar = Dpassage.Ap/12ll
Dpassage為該通道的直徑，Ap為該容器內(nèi)和該腔內(nèi)的流體之間的壓 力差，并且11為該流體的動態(tài)速度.然而，任何其它參數(shù)關系以及任 何速度范圍均被本發(fā)明的范圍所涵蓋。
該轉移裝置也可以用于將物質分配到轉移細胞上，其中該物質包 含將置于一個或多個細胞內(nèi)的一種或多種材料。這種物質例如可以為 DNA、反義制劑或基因治療或藥物發(fā)現(xiàn)領域中正在研究的藥物。
在本發(fā)明的實施例中，該轉移裝置還包括電極，可以通過該電極 向轉移細胞施加電勢。這例如可用于進行電穿孔和轉染，但是施加電 勢的任何目的將落在本發(fā)明范圍內(nèi)。該電極優(yōu)選地形成圖案，該圖案 使得可以施加電勢以進行一個或多個細胞的選擇性電穿孔。藉此，例 如可以研究僅選定細胞的轉染效果或者在特定時間間隔進行電穿孔以 研究時間依存效果。本發(fā)明的另一方面通過使用如上所述的設備將細胞從流體轉移到
基板的方法來提供。該方法包括以下步驟建立該流體和該外表面之 間的接觸；建立每個通道的第一和第二端之間的壓力差；建立流經(jīng)該 外表面的流體，使得大于預定尺寸的細胞不保持抵住該通道的該第一 端；使每個通道的該第一端與該基板相互緊鄰；以及改變該壓力差， 使得該細胞附著到該基板。
在可以通過施加電勢來進行電穿孔的本發(fā)明的實施例中，電極可 以布置在基板上，且如上所述對于該轉移裝置，這些電極可形成圖案， 該圖案可以實現(xiàn)一個或多個細胞的選擇性電穿孔.電極既位于轉移裝 置上也位于基板上，這也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


現(xiàn)在，將參考附圖僅以示例的方式解釋本發(fā)明，附圖中
圖1為拾取懸浮于流體內(nèi)的細胞的轉移裝置的示意圖2為釋放細胞使其在基板上形成矩陣的轉移裝置部分的示意以及
圖3為將物質分配到附著于基板的細胞上的示意圖。 附圖中的圖不是按比例的。
具體實施例方式
本發(fā)明的設備1使得可以從生物樣品構建細胞2的陣列或矩陣。 細胞2最初懸浮于填充在容器4內(nèi)的流體3內(nèi)，該容器4具有入口 5 和出口6，如圖l示意性所示。容器4連接到能夠形成流體3的流動的 流動裝置7，這種流動裝置7例如可以是電動泵。在本發(fā)明的實施例中， 流體3再循環(huán)到容器4，流體3和細胞2的總量由此可以保持最小。該 圖示意性示出具有外表面9、內(nèi)腔10和多個通道11的轉移裝置8。通 道11具有位于外表面9的第一端12以及與腔10流體連通的第二端13。
設備l包括壓力調(diào)節(jié)裝置14，通過該壓力調(diào)節(jié)裝置14，可以在每 個通道11的第一端12和第二端13之間建立壓力差，由此在腔10和容 器4中的流體3之間建立壓力差.當轉移裝置8的外表面9與流體3 接觸時，該壓力差致使流體3經(jīng)由通道11流入腔IO。比通道ll的直 徑小的細胞2由此可以被吸入并經(jīng)由腔IO被引走，而較大的細胞2保持抵在通道ll的第一端12。流體3可以從腔IO被引導到第二容器(未 示出)。在圖l所示情形中，除了一個通道以外的所有通道11被細胞2 阻擋。
轉移裝置8可用于拾取預定尺寸范圍內(nèi)的細胞2。這是通過如上所 述恰當?shù)剡x擇通道ll的直徑以及在容器4內(nèi)應用流體流來獲得的?？?以調(diào)整流體3的速度以及壓力差，使得太大的細胞2不會保持抵在通 道11的第一端12，而是經(jīng)由容器4的出口 6被沖走。通過利用本發(fā)明 的該實施例，因此無需過濾流體3內(nèi)細胞2的樣品，這簡化了工藝。 細胞2會附帶地粘在一起。如果發(fā)生這種情形，細胞或者會由于其較 大的總尺寸而被沖走，或者將通過橫向流動被分離。
理論模擬已經(jīng)用于確定對于給定應用的參數(shù)設定選擇的恰當關 系。發(fā)現(xiàn)可以使用下述方程。附著細胞2的平均位置附近的容器4內(nèi) 流體3的速度V應優(yōu)選地在0.1 Vchar<V<10 Vchar的范圍內(nèi)，其中該特 征速度為
Vchar = Dpassage.Ap/12t]
Dpassage為通道11的直徑，Ap為容器4內(nèi)和腔10內(nèi)的流體3之間 的壓力差，且ti為流體3的動態(tài)速度。然而，任何其它參數(shù)關系以及 任何速度范圍均被本發(fā)明的范圍所涵蓋。當細胞2附著到通道11時， Ap為細胞2上的壓力差，即，位于細胞2的面向容器4的一側的流體 3與位于面向通道ll的另一側的流體3之間的壓力差。
在圖1所示實施例中，檢測器15檢測全部或預定比例的通道11 何時被細胞2阻擋。隨后，控制器16致使轉移裝置8移動到緊鄰基板 17的位置(見圖2)，其中細胞2將附著到該基板17供進一步處理。 該檢測例如涉及當越來越多的通道11被阻擋時離開腔10的流體減少。 該檢測備選地涉及為了維持該壓力差所需的壓力調(diào)節(jié)。
圖2示意性示出如何通過一次將一行細胞2轉移到基板17來構建 細胞2矩陣。在本發(fā)明的另一實施例(未示出)中，轉移裝置8包括 超過一行的通道11，使得一次可以轉移更多行的細胞2。通過去除壓 力差，即腔10內(nèi)的負壓，且需要時通過施加輕微的正壓，從轉移裝置 8釋放細胞2。
移動轉移裝置8的一種備選方案為，將轉移裝置8保持在固定位 置，移動容器4和基板17。如果需要的話，對于不同行可以使用不同的流速。由此可以改變
行之間的細胞2尺寸范圍的上限.例如如果來自細胞尺寸的影響或者 與之直接相關的另 一參數(shù)在給定研究中是所要研究的變量，則這是恰 當?shù)摹?br> 在本發(fā)明(未示出)實施例中，轉移裝置8取向為使得在細胞2 釋放之前通道11的第一端12指向朝上。由此可以確?？赡艽嬖诘牧黧w 3殘留物不離開通道11。
在本發(fā)明的實施例中，轉移裝置8不僅如上所述用于構建細胞2 的矩陣陣列，而且用于進行后續(xù)的電穿孔和轉染。在陣列或矩陣已經(jīng)
構建之后，轉移裝置8的通道11和腔10被清空、清洗并填充有DNA、 反義制劑、藥物或者將置于一個或多個細胞2內(nèi)的另一物質18。轉移 裝置8隨后移動到通道11的第一端12緊鄰基板17上的細胞2的位置， 且物質18分配在一個或多個細胞2上。圖3為將物質18分配在細胞2 上的示意性說明?；?7優(yōu)選應是疏水的，諸如具有大于50°的接觸 角。這將保持所分配的物質18緊靠細胞2，使得物質18層的厚度被嚴 格定義。
隨后通過施加電勢到細胞2可進行電穿孔。該電勢可以經(jīng)由位于 轉移裝置8和基板17其中之一或二者上的電極19來施加。圖3示出電 極19布置在轉移裝置8上的示例。取決于轉移裝置8和基板17之間的 距離，該電勢通常約為幾伏特到幾百伏特。視電極圖案而定，可以進 行單個細胞電穿孔或多個細胞電穿孔。電勢的施加也可以用于將小滴 的物質18引出通道ll。
作為使用同一轉移裝置8來轉移細胞及物質18的備選，使用用于 轉移細胞2的轉移裝置以外的一個或多個其它轉移裝置(未示出)來 分配物質18。該備選可提高工作速度，最小化流體3和物質18的浪費， 并且最小化由于流體3及物質18的殘余物的不期望混合引起的污染的 風險。這些其它轉移裝置可具有與用于轉移細胞2的轉移裝置不同的 設計，因為它們例如可以不包括腔10和壓力調(diào)節(jié)裝置14。
在所有上述實施例中，通常而言重要的是保證細胞2在預定位置 附著到基板17以及包括將置于細胞2內(nèi)的材料的物質18精確地分配 在細胞2上。用于此目的的恰當?shù)膶始夹g的選擇對于本領域技術人 員而言是顯而易見的。通道11可劃分為分別連接到各自的腔的多個組(未示出)，使得
一次可以釋放一組或多組細胞2。由此例如可以將細胞2在基板17上 布置成一圖案，該圖案不同于由轉移裝置8的通道11的位置形成的圖 案。備選地，通過使用例如從噴墨打印機的噴墨頭已知的壓電設備， 可以實現(xiàn)這種可能性。這些選項也可用于將物質18僅應用到一些細胞 2。
盡管本發(fā)明已經(jīng)結合具體實施例予以描述，但本發(fā)明并不限于此 處所述的具體形式。相反，本發(fā)明的范圍僅由所附權利要求界定。在 權利要求中，措辭"包括"不排除存在其它元件或步驟.另外，盡管單 獨的特征可包括在不同權利要求中，這些特征有可能可以有利地組合， 且包括在不同的權利要求中并不意味著特征的組合不可行和/或不利。 此外，單數(shù)引用并不排除多數(shù)的情形。因此"一"、"一個"、"第一"、"第
二，，等用語并不排除多數(shù)的情形。此外，權利要求中的參考符號不應理 解為限制其范圍。
權利要求
1.一種用于將懸浮于流體(3)內(nèi)的細胞(2)從該流體(3)轉移到基板(17)的設備(1)，該設備(1)包括容器(4)，用于容納該流體(3)；轉移裝置(8)，具有外表面(9)、內(nèi)腔(10)和多個通道(11)，每個通道(11)具有位于該外表面(9)的第一端(12)以及與該腔(10)流體連通的第二端(13)，且每個通道(11)具有與待轉移的細胞(2)的預定尺寸相對應的直徑；壓力調(diào)節(jié)裝置(14)，能夠調(diào)節(jié)該腔(10)內(nèi)的壓力從而在每個通道(11)的第一和第二端(12，13)之間建立壓力差；以及流動裝置(7)，在與該流體(3)接觸時能夠致使該流體(3)流過該外表面(9)。
2. 根據(jù)權利要求1的設備(1 )，其中該轉移裝置(8)具有 第一位置，其中在該第一位置，該通道(11)的第一端(12)與該容器(4)內(nèi)的該流體(3)流體連通，且其中該壓力差或者流經(jīng)該 外表面(9)的流體至少之一是可控的，以保持具有預定尺寸的細胞(2) 抵住該通道(11)的第一端(12);以及第二位置，其中在該第二位置，該壓力差是可控的，使得該細胞 (2)將從該通道(11)釋放且附著到該基板(17)。
3. 根據(jù)權利要求2的設備(1 )，還包括檢測器(15)，用于檢測通道(11)何時被細胞(2)阻擋；以及 控制器(16)，用于致使該轉移裝置(8)移動到該第二位置。
4. 根據(jù)權利要求1的設備(1)，其中附著細胞(2)的平均位置 附近的該容器(4)內(nèi)的該流體(3)的速度V在如下范圍0.1 Vchar<V<10Vchar， 其中特征速度為Vchar = Dpassage'Ap/12tlDpassage為該通道(11)的直徑，Ap為該容器(4)內(nèi)和該腔(10) 內(nèi)的流體(3)之間的壓力差，且T1為該流體(3)的動態(tài)速度。
5. 根據(jù)權利要求1的設備(1)，其中該轉移裝置(8)可以取向 為使得在該細胞(2)附著到該基板(17)之前該通道(11)的該第一端(12)指向朝上。
6. 根據(jù)權利要求l的設備(l)，其中每個通道(11)的該第一和 第二端(12， 13)之間的壓力差可以單獨地或者分組地控制，從而選 擇性地釋放細胞(2)。
7. 根據(jù)權利要求1的設備(1)，其中該轉移裝置(8)也可以用 于將物質(18)分配到轉移細胞(2)上，其中該物質(18)包含將置 于一個或多個細胞(2)內(nèi)的一種或多種材料。
8. 根據(jù)權利要求1的設備(1)，其中該轉移裝置(8)還包括電 極(19),電勢可以通過該電極(19)施加到轉移細胞(2)。
9. 根據(jù)權利要求8的設備(1 )，其中該電極(19)形成圖案，該 圖案使得可以施加該電勢以進行一個或多個細胞(2)的選擇性電穿孔。
10. —種使用根據(jù)權利要求(1)的設備(1)將細胞(2)從流體 (3)轉移到基板(17)的方法，該方法包括步驟建立該流體(3)和該外表面(9)之間的接觸； 建立每個通道(11)的笫一和第二端(12, 13)之間的壓力差； 建立流經(jīng)該外表面(9)的流體，使得大于預定尺寸的細胞(2) 不保持抵住該通道(11)的該第一端(12);使該通道(11)的該第一端(12)與該基板(17)相互緊鄰；以及改變該壓力差，使得該細胞(2)附著到該基板(17)。
11. 根據(jù)權利要求10的方法，還包括步驟 清空和清洗該轉移裝置(8)的通道(11)和腔(10); 使用包括將置于一個或多個細胞(2)內(nèi)的一種或多種材料的物質(18)填充該通道(11)和腔(10);移動該基板(17)或該轉移裝置(8)到一位置，其中在該位置， 該通道(11)的第一端(12)緊鄰該基板(17)上的細胞(2); 將該物質(18)分配在一個或多個細胞(2)上；以及 向電極(19)施加電勢以進行電穿孔。
12. 根據(jù)權利要求10的方法，還包括步驟移動該基板(17)或者包括通道(11)的一個或多個附加轉移裝 置到一位置，其中該通道(11)包含將置于一個或多個細胞(2)內(nèi)的 一種或多種材料的物質(18)，其中在該位置，該通道(ll)緊鄰該基板(17)上的細胞(2);將該物質(18)分配在一個或多個細胞(2)上；以及 向電極(19)施加電勢以進行電穿孔。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將懸浮于流體(3)內(nèi)的細胞(2)從流體(3)轉移到基板(17)的設備(1)。該設備(1)包括具有外表面(9)、內(nèi)腔(10)和多個通道(11)的轉移裝置(8)，每個通道(11)具有位于外表面(9)的第一端(12)以及與腔(10)流體連通的第二端(13)，且每個通道(11)具有與待轉移的細胞(2)的預定尺寸相對應的直徑。該設備還包括壓力調(diào)節(jié)裝置(14)，能夠調(diào)節(jié)腔(10)內(nèi)的壓力從而在每個通道(11)的第一和第二端(12，13)之間建立壓力差；容器(4)，用于容納流體(3)；以及流動裝置(7)，在與流體(3)接觸時能夠致使流體(3)流過外表面(9)。通過恰當?shù)剡x擇通道直徑、壓力差和流體流速，該轉移裝置可用于拾取和轉移預定尺寸范圍內(nèi)的細胞(2)。本發(fā)明還涉及使用這種設備(1)轉移細胞(2)的方法。
文檔編號C12M3/00GK101541945SQ200780043802
公開日2009年9月23日 申請日期2007年11月28日 優(yōu)先權日2006年11月29日
發(fā)明者D·B·范達姆, J·M·倫森, S·I·E·武爾托, T·J·德胡格 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司