專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株專(zhuān)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利涉及獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域的診斷技術(shù)，具體是一種檢測(cè)高致病性 豬繁殖與綜合癥病毒變異株診斷方法和專(zhuān)用試劑盒。2、 背景技術(shù)2006年夏天我國(guó)爆發(fā)豬"高熱病"，目前農(nóng)業(yè)部己確定高致病性豬繁殖與 綜合癥病毒變異株為此病的原發(fā)病原。針對(duì)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異 株國(guó)內(nèi)很多學(xué)者做了大量的工作。目前檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異 株的方法主要有病毒分離鑒定、過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)和RT-PCR診斷方 法。分離鑒定和過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)技術(shù)要求較高，只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，很難大規(guī)模應(yīng)用于現(xiàn)地檢驗(yàn)。針對(duì)目前我國(guó)國(guó) 內(nèi)普遍流行的高熱病的現(xiàn)狀，急需一種能夠應(yīng)用于大規(guī)?，F(xiàn)地檢樣的診斷方法。3、 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)目前我國(guó)"高熱病"普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng) 濟(jì)損失的現(xiàn)狀，提供一種能夠應(yīng)用于大規(guī)?，F(xiàn)地檢樣的診斷方法。本發(fā)明專(zhuān)利是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 1. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)2006年后發(fā)生的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥都是在Nsp2區(qū)域出現(xiàn)缺失的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，該引物能將此缺失片斷包 括在內(nèi)，擴(kuò)增變異株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為404bp，擴(kuò)增傳統(tǒng)的PRRSV擴(kuò)增片斷為 494bp。特異性引物如下PSX1: 5' -TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3，PSX2: 5， -GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3' 1.2病料的處理將病料剪碎放于滅菌的研磨器中磨碎，用無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液l: 4倍稀釋?zhuān)〔《緫乙?2(TC反復(fù)凍融3次，8000rpm離心10min，取上清液-80 "C保存?zhèn)溆谩?1.3病毒RNA的提?、?取研磨液300 uL加入600 yLRNAout，振蕩混勻室溫靜置5 min;② 加入200 UL氯仿用力顛倒，離心管混勻后靜置5 min， 12000 rpm離心 10 min。4③ 取上清，加入500 iiL異丙醇，振蕩混勻后，室溫放置10min， 12000 rpm 離心10 min。
④ 輕輕棄去上清，加入lmL75X乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500 rpm 離心5 min。
⑤ 棄上清，室溫靜置5-15min，使RNA沉淀干燥。
⑥ 加入10 u L的DEPC水溶解RNA，用于反轉(zhuǎn)錄。 1.4反轉(zhuǎn)錄
取提取的RNA7HL， Oligo(dT)l叱70。C作用10min，后于冰上加入5Xbuffer 4叱、dNTP Mixture 3叱、Rnase Inhibitor l叱、ddH20 3PL 、 M-MLV 1PL， 42 "C水浴lh。用下游引物PSX2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以此合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
1.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
IOX反應(yīng)緩沖液 5.0 iiL
dNTP (2.5 pMol/uL) 4. 0 u L
Primer (+)(25 pMol/uL) 1.0 uL
Primer (-)(25pMol/uL) 1.0 uL
MgCl2(25 mMol) 4. 0 y L
cDNA 5. 0 uL
Taq DNA聚合酶(5 u/uL) 0. 5 u L
無(wú)菌^0 加至 50.0 ix L
反應(yīng)條件為(D95。C 5min; (2)94°C 1 min， 54. 5°C 1 min， 72°C 1 min， 共28個(gè)循環(huán)；(3)72°C 5 min。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于-2(TC保存。 1. 6電泳電壓100 V電泳40 min，取凝膠在含10 mg/mL的溴化乙錠(EB)水 溶液中染色15 min，在DNA凝膠成像系統(tǒng)儀下觀察并拍照。
本發(fā)明自行設(shè)計(jì)特異性引物，提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在此基礎(chǔ)上 利用PCR方法檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株，并在此基礎(chǔ)上研制成 功了專(zhuān)用試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該診斷方法和專(zhuān)用試劑盒具有很強(qiáng)的特異 性、敏感性，與病毒分離和IPMA方法相比符合率可達(dá)90。/。以上，可廣泛用于臨 床高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株的檢測(cè)。

圖中M: DL2000 (2000， 1000， 750， 500， 250， 100bp); 1-8:臨床樣本，其余為空泳道。 具體實(shí)施例方式
1) 引物
根據(jù)2006年后發(fā)生的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥都是在Nsp2區(qū)域出現(xiàn) 缺失的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，該引物能將此缺失片斷包括在內(nèi)，擴(kuò)增 變異株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為404bp，擴(kuò)增傳統(tǒng)的PRRSV擴(kuò)增片斷為494bp。 由TaKaRa生物技術(shù)有限公司合成。
PSX1: 5' -TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3，
PSX2: 5， -GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3'
2) 病料的處理
將病料剪碎放于滅菌的研磨器中磨碎，用無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液l :4倍稀釋?zhuān)?病毒懸液-2(TC反復(fù)凍融3次，8000rpm離心10min，取上清液-80。C保存?zhèn)溆谩?br> 3) 病毒RNA的提取
① 取研磨液300 uL加入600 uLRNAout，振蕩混勻室溫靜置5 min;
② 加入200 uL氯仿用力顛倒，離心管混勻后靜置5 min， 12000 rpm離心 10 min。
③ 取上清，加入500 uL異丙醇，振蕩混勻后，室溫放置10min， 12000 rpm 離心10 min。
④ 輕輕棄去上清，加入lmL75X乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500 rpm 離心5 min。
⑤ 棄上清，室溫靜置5-15 min，使RNA沉淀千燥。
⑥ 加入10 u L的DEPC水溶解RNA，用于反轉(zhuǎn)錄。
4) 反轉(zhuǎn)錄
取提取的RNA7PL， Oligo(dT)lML 7(TC作用10min，后于冰上加入5Xbuffer 4PL、 dNTP Mixture 3叱、Rnase Inhibitor 1化、ddH20 3化、M-MLV l叱，42 。C水浴lh。用下游引物PSX2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以此合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
5) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
IOX反應(yīng)緩沖液 5. 0 uL
dNTP (2.5 pMol/uL) 4. 0 w LPrimer (+) (25 pMol/yL) Primer (-) (25pMol/uL) MgCl2(25 mMol)
1.0 uL
1.0 uL
4.0 ii L
5. 0 iiL
Taq DNA聚合酶(5 u/y L) 無(wú)菌H20 加至
0. 5
50.0 iiL
6) 不同引物分別采用如下溫度程序 PSX1/PSX2 :
(D95。C 5 min; (2)94°C 1 min， 54. 5°C 1 min， 72°C 1 min，共28個(gè)循 環(huán)；(3)72°C 5 min PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于-20。C保存。
試驗(yàn)設(shè)豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒陰性對(duì)照。
7) 電泳
電壓100 V電泳40 min，取凝膠在含10 mg/mL的溴化乙錠(EB)水溶液中 染色15 min，在DNA凝膠成像系統(tǒng)儀下觀察并拍照。 結(jié)果
1) RT-PCR的特異性
利用合成的引物對(duì)豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒均未擴(kuò)增出與 預(yù)期大小一致的條帶。
2) 病料的檢測(cè)
對(duì)山東省2006年以后采集的疑似為高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥的病料用 PSX1/PSX2引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果在病料中都擴(kuò)增出變異株特異性片段， 圖1所示為部分樣本的檢測(cè)結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株專(zhuān)用試劑盒，其特征在于用于臨床高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株的檢測(cè)的特異性引物PSX1/PSX2，特異性擴(kuò)增PRRSV NSP2變異株，擴(kuò)增變異株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為404bp，擴(kuò)增傳統(tǒng)的PRRSV擴(kuò)增片斷為494bp，制備步驟如下1)試劑盒采用的引物為PSX15’-TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3’PSX25’-GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3’，退火溫度為54.5℃，采用28個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增變異株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為404bp，擴(kuò)增傳統(tǒng)的PRRSV擴(kuò)增片斷為494bp；2)病料的處理將病料剪碎放于滅菌的研磨器中磨碎，用無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液1∶4倍稀釋?zhuān)〔《緫乙?20℃反復(fù)凍融3次，8000rpm離心10min，取上清液-80℃保存?zhèn)溆谩?)病毒RNA的提取①取研磨液300μL加入600μL RNAout，振蕩混勻室溫靜置5min；②加入200μL氯仿用力顛倒，離心管混勻后靜置5min，12000rpm離心10min。③取上清，加入500μL異丙醇，振蕩混勻后，室溫放置10min，12000rpm離心10min。④輕輕棄去上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500rpm離心5min。⑤棄上清，室溫靜置5-15min，使RNA沉淀干燥。⑥加入10μL的DEPC水溶解RNA，用于反轉(zhuǎn)錄。4)反轉(zhuǎn)錄取提取的RNA7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、Rnase Inhibitor 1μL、ddH2O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。用下游引物PSX2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以此合成的eDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。5)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)10×反應(yīng)緩沖液 5.0μLdNTP(2.5pMol/μL)4.0μLPrimer(+)(25pMol/μL)1.0μLPrimer(-)(25pMol/μL)1.0μLMgCl2(25mMol)4.0μLcDNA 5.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL)0.5μL無(wú)菌H2O 加至 50.0μL6)反應(yīng)條件為(1)95℃5min；(2)94℃1min，54.5℃1min，72℃1min，共28個(gè)循環(huán)(3)72℃5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存。1.6電泳電壓100V電泳40min，取凝膠在含10mg/mL的溴化乙錠(EB)水溶液中染色15min，在DNA凝膠成像系統(tǒng)儀下觀察并拍照。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株專(zhuān)用試劑盒。通過(guò)自行設(shè)計(jì)特異性引物PSX1/PSX2，提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR方法檢測(cè)高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株，擴(kuò)增變異株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為404bp，擴(kuò)增傳統(tǒng)的PRRSV擴(kuò)增片斷為494bp。該專(zhuān)用試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有很強(qiáng)的特異性、敏感性，與病毒分離和IPMA方法相比符合率可達(dá)90％以上。該引物對(duì)豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，能夠區(qū)分NSP2變異株與傳統(tǒng)株；該方法可檢出12.8ng/L的PRRSV，可廣泛用于臨床高致病性豬繁殖與綜合癥病毒變異株的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101220397SQ20081001406
公開(kāi)日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者任慧英, 劉玉慶, 吳家強(qiáng), 順 周, 張秀美, 時(shí)建立, 俊 李, 溫建新, 王金寶 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所