專利名稱：：用載肝細胞生長因子聚乳酸-o-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝細胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：急性肝衰竭死亡率高達70%。肝細胞移植可以起到一定的肝功能支持和促進肝再生作用。由于其具有操作簡單、對機體生理環(huán)境干擾小、供體來源廣泛等優(yōu)點，己引起了眾多研究者的廣泛關(guān)注。然而，如何提高移植肝細胞的活性、降低免疫排斥反應(yīng)和促進受體肝再生是急需解決的三大問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可有效促進肝細胞生長、提高肝細胞活力的用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種用載肝細胞生長因子(HGF)聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，其特征是在肝細胞培養(yǎng)時，將載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子與肝細胞混合進行接種培養(yǎng)。所述載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子是通過下列步驟制得將載肝細胞生長因子加入到聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子懸浮溶液中，在4"C、800rpm電磁攪拌的條件下充分反應(yīng)4小時，然后10000rpm高速離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子。肝細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為3538。C，且5。/。C02條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時內(nèi)，每30分鐘振蕩一次，每次持續(xù)5分鐘。肝細胞與載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的用量關(guān)系為5xl()S個/ml肝細胞與40嗎/ml的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子相混合接種。本發(fā)明可有效促進肝細胞生長，提高肝細胞活力，必定對肝細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展起到巨大的推動作用。實驗證明，與普通肝細胞培養(yǎng)相比較，本發(fā)明培養(yǎng)的肝細胞形成球形聚集體的時間明顯縮短，球形聚集體的比例明顯增加，細胞形態(tài)好，培養(yǎng)后第2天至第7天，采用CCK-8體外細胞增殖試劑盒檢測培養(yǎng)肝細胞的活力，發(fā)現(xiàn)載HGF納米培養(yǎng)組生成黃色甲臢染料的量高于普通培養(yǎng)組(P<0.05)。表明載HGF納米培養(yǎng)組活細胞數(shù)目多于普通培養(yǎng)組，載HGF納米粒子在體外能夠持續(xù)地促進大鼠肝細胞生長和活性的保持。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1是載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子透射電鏡照片。圖2是載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子掃描電鏡照片。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。具體實施例方式聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖(PLA-O-CMC)納米粒子的制備將10ml濃度為0.03%的PLA(聚乳酸)二氯甲烷溶液與10ml濃度為0.15W的O-CMC溶液在超聲情況下充分反應(yīng)(約25分鐘左右)，待其中的有機溶劑揮發(fā)完全后得到乳光較重的均勻懸濁液。將此懸濁液先以2000rpm低速離心5分鐘，取低速離心后所得的上清液以14000rpm高速離心10分鐘，得到部分白色沉淀，吸去部分上清液，將沉淀用蒸餾水離心洗滌兩次后，將沉淀冷凍抽干取出并行鈷-60輻照消毒后備用。載HGF的聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的制備稱取5mgPLA-O-CMC納米粒子放入5ml去離子水中進行超聲波分散，制得納米粒子懸浮溶液。取5嗎HGF加入5mlPLA-OCMC納米粒子懸浮溶液中，在4"C、800rpm電磁攪拌的條件下充分反應(yīng)4小時，然后10000rpm離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載HGF的聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子。載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的表征透射電子顯微鏡觀察取5mg固化的載HGF的PLA-O-CMC納米粒子放入5ml去離子水中進行超聲波分散，制得納米粒子懸浮溶液。然后將少量懸浮溶液滴到已載膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余的液體，晾干后即制成樣品，透射電子顯微鏡觀察載HGF的PLA-O-CMC納米粒子的結(jié)構(gòu)、粒徑及表面形貌。激光粒度儀/zeta電位儀測試:用激光粒度儀/zeta電位儀檢測上述載HGF的PLA-O-CMC納米粒子懸浮溶液中載HGF納米粒子的粒徑和表面電位。載HGF的PLA-O-CMC納米粒子載藥率與包封率的測定載藥率(drugloading,LD)是指微粒中藥物的質(zhì)量百分比，包封率(embeddingmtio，ER)是指微粒中藥物量與投入制備體系中的藥物量的質(zhì)量百分比。分別通過以下公式計算載藥率和包封率載藥率=納米粒子中HGF含量/納米粒子質(zhì)量xl00。/a，包封率=納米粒子中HGF含量/HGF投入量xl00%。采用改良超聲乳化法制得的載HGF的PLA-O-CMC納米粒子具有較為光滑的表面形貌和相對均一的粒徑分布，其平均粒徑為B9.82nm，粒徑分布指數(shù)為0.108，粒子的表面電位為32.8eV，載藥率為0.12665%，包封率為76.32%。具有較為明顯的核-殼結(jié)構(gòu)存在，微粒表面有較為均勻的高聚物包裹，粒子的表面電位為32.8eV。這表明該納米粒子表面有較強的正電荷，便于載HGF納米粒子和帶負電荷的肝細胞相接觸實現(xiàn)藥物的靶向治療。稱取一系列載HGF納米粒子，每份lmg，分別裝入離心管中，加入lmlpH7.4的PBS溶液；將離心管放在37°C的水浴恒溫振蕩器內(nèi)(頻率60rpm)，并計時，間隔一段時間取出一個離心管離心沉淀(14000rpm)載HGF納米粒子，將上清液和沉淀分別收集。用ELLISA法檢測上清液中HGF的含量，并用酸度計測定釋放液的pH值，用冷凍抽干機冷凍干燥釋放后的納米粒子并精確稱重。重復試驗3次，取平均值，繪制載HGF微粒釋放曲線。通過動態(tài)觀察載HGF納米粒子體外降解過程發(fā)現(xiàn)初制的載HGF納米粒子呈球形，具有光滑的表面形貌和相對均一的粒徑，且具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)存在，表面有一層高聚物包裹。經(jīng)過15天的釋放和降解，粒子表面皺縮變形、體積變大、部分粒子崩塌失去球狀外形。45天后，載HGF納米粒子進一步釋放和降解，大多數(shù)粒子降解為絮狀物質(zhì)，少部分粒子仍有核-殼結(jié)構(gòu)。隨著納米粒子的不斷降解，將出現(xiàn)質(zhì)量損失，主要發(fā)生本體降解。對納米粒子在體外的釋藥行為研究發(fā)現(xiàn)載HGF納米粒子前24小時的降解可以分為高速釋藥，中速釋藥，低速釋藥3個階段，前24小時的釋藥動力學方程為Q=148.4266+189.0493t1/2(R=0.97589)，符合Huguchi方程。載HGF納米粒子在前30天內(nèi)的的釋藥行為可以分為早期藥物突釋階段，后期穩(wěn)定釋放階段。釋放動力學方程Q4086.28966+58.23938t(R=0.99716)，符合零級釋放方程。大鼠肝細胞的分離和培養(yǎng)采用Seglen原位兩步灌流法分離大鼠肝細胞。將分離所得肝細胞進行培養(yǎng)將肝細胞以5xl()S個/ml與40昭/ml的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子相混合接種到培養(yǎng)板上(lml/孔)，置于37'C，5%(302條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時內(nèi)，每30分鐘振蕩一次，每次持續(xù)5分鐘，以促進載納米粒子與肝細胞的結(jié)合且有利于細胞集聚形成球形體。培養(yǎng)12小時后，細胞與載HGF納米粒子緊密結(jié)合。培養(yǎng)48小時后，形成細胞粘附聚集的球形體，提高了細胞密度。培養(yǎng)24小時，大部分細胞仍保持圓球狀，部分肝細胞向多邊形轉(zhuǎn)變，多數(shù)肝細胞相互粘連，成束狀生長。約培養(yǎng)48小時后，大部分肝細胞重建細胞極性，呈現(xiàn)較典型、均勻的多邊形形態(tài)特征。為了更好地分析本發(fā)明的效果，同時建立了普通培養(yǎng)組對肝細胞進行培養(yǎng)將肝細胞以5xl()S個/ml的濃度接種到培養(yǎng)板上(lml/孔)，置6于37'C，濃度為5%的(302條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時內(nèi)，每30分鐘振蕩一次，每次持續(xù)5分鐘，以利于細胞集聚形成球形體。普通培養(yǎng)的肝細胞，接種后很快沉于培養(yǎng)板底并貼壁生長，其形態(tài)立即由剛分離的圓球形向單層扁平多邊形伸展，4872小時后細胞進一步變薄，漸失去多邊形特征，肝細胞連接成片生長。培養(yǎng)肝細胞活力檢測采用CCK-8體外細胞增殖檢測試劑盒檢測培養(yǎng)肝細胞活力。CCK-8所含的WST-8在電子載體作用下，能被活細胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的黃色甲臢染料(Formazen)，生成的甲臢染料的量與活細胞數(shù)目成正比。下面表中將用本發(fā)明方法的培養(yǎng)組稱為"載HGF納米粒子培養(yǎng)組"，與普通培養(yǎng)組作比較。表1CCK-8法比較兩組培養(yǎng)肝細胞的活力(mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>經(jīng)統(tǒng)計學處理，培養(yǎng)一天兩組細胞活力無較大差異(P〉0.05)，這可能與肝細胞分離培養(yǎng)后第一天正處于潛伏期有關(guān)。培養(yǎng)27天，HGF納米粒子組細胞活力明顯高于普通培養(yǎng)組(P<0.05)，說明載HGF納米粒子對體外培養(yǎng)大鼠肝細胞的增殖有明顯的持續(xù)的促進作用。通過研究載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子對體外培養(yǎng)大鼠肝細胞發(fā)現(xiàn)，該載HGF納米粒子在體外能夠持續(xù)地促進大鼠肝細胞生長。權(quán)利要求1、一種用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，其特征是在肝細胞培養(yǎng)時，將載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子與肝細胞混合進行接種培養(yǎng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，其特征是所述載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子是通過下列步驟制得將載肝細胞生長因子加入到聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子懸浮溶液中，在4°C、800rpm電磁攪拌的條件下充分反應(yīng)4小時，然后10000rpm高速離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用載肝細胞生長因子聚乳酸-0-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，其特征是肝細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為3538。C，且5%(302條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時內(nèi)，每30分鐘振蕩一次，每次持續(xù)5分鐘。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，其特征是肝細胞與載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的用量關(guān)系為5xl()S個/ml肝細胞與40)ig/ml的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子相混合接種。全文摘要本發(fā)明公開了一種用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養(yǎng)方法，在肝細胞培養(yǎng)時，將載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子與肝細胞混合進行接種培養(yǎng)。本發(fā)明可有效促進肝細胞生長，提高肝細胞活力，必定對肝細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展起到巨大的推動作用。文檔編號C12N5/06GK101250498SQ20081002347公開日2008年8月27日申請日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日發(fā)明者常仁安,李志峰,鐘陳申請人:南通大學附屬醫(yī)院