專利名稱：紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列的制作方法
紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，利用分子生物學(xué)基因技術(shù)分離一種新的植物金屬硫蛋白基因 及其所編碼多肽，以及該基因的應(yīng)用方法。技術(shù)背景1957年Margoshe和vaJle首次在馬腎中發(fā)現(xiàn)并分離出金屬硫蛋白(metallothiondn MT) (Margoshes, M.， Vallee, B丄.,1957. A cadmium protein from equine kidney cortex. J. Am. Chem. Soc. 79,4813-4814)以來(lái)，科學(xué)家們相繼在植物(Purdue University, West Lafayette, IN 47907. Regulation and function of metallothionein genes in plants)、微生物以及海洋生物中發(fā)現(xiàn)和證明 了具有相似結(jié)構(gòu)和生理功能基本一致的金屬硫蛋白(Classification of Metallothionein, P,A.Binz， J.H.R. Kagi, 1999)。到1997年第四屆國(guó)際MT會(huì)議止，共發(fā)現(xiàn)并確定氨基酸序列的MT有170多種(茹炳根.第四屆國(guó)際金屬硫蛋白會(huì)議簡(jiǎn)介.生命科學(xué)，1998， 10(3): 157 15)。金屬硫蛋白是一類低分子量、富含半胱氨酸、可吸附金屬的特異蛋白質(zhì)，(Viarerigo， A, 1989. Heavy metals in marine invertebrates: mechanisms of regulation and toxicity at cellular level. Crit. Rev. Aquat.Sci. 1,295-317)。到目前為此，金屬硫蛋白被認(rèn)為有以下功能(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞 內(nèi)微量金屬離子的動(dòng)態(tài)平衡；(2)保護(hù)有機(jī)生物體免受過(guò)多重金屬離子的傷害；(3)清除體內(nèi) 自由基；(4)貯存有機(jī)生物所必需金屬離子，以備其它金屬蛋白的利用；(5)保護(hù)細(xì)胞免受細(xì) 胞內(nèi)過(guò)氧化的損傷(Karin, M.， 1985. metallothioneins: proteins in search of function. Cell 41, 9-10; Hamer, D.H.， 1986. Metallothioneins. Ann. Rev. Biochem. 55,913-951 )。金屬硫蛋白研究已涉及 農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、衛(wèi)生毒理學(xué)、食品科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、保健科 學(xué)和方法學(xué)等領(lǐng)域。除了可以開發(fā)各種治療藥物、保健化妝品等以外，還可以利用轉(zhuǎn)基因金 屬硫蛋白生物進(jìn)行重金屬污染環(huán)境的修復(fù)。植物金屬硫蛋白到目前為止發(fā)現(xiàn)存在三種主要類型。用于此設(shè)計(jì)的為II型(plant metalllothioneintypell),發(fā)現(xiàn)于紅樹植物木欖中。根據(jù)半胱氨基酸的在金屬硫蛋白分子中的 分布規(guī)律，可以將植物金屬硫蛋白序列分成三個(gè)區(qū)域區(qū)域(1)中半胱氨的序列分布為 SCCGGnCGCGsgCKCgnGCgGCKmy;區(qū)域(2)序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)半胱氨酸的分布；區(qū)域(3) 中半胱氨的序列分布為gCKCGsxC[kt]C[dn]PCxC。半胱氨酸的分布規(guī)律序列為CC， CXC 和CXXXC，兩個(gè)保守序列區(qū)域(1)和(3)分布于分子兩端，形成啞鈴狀，富含巰基(-SH)， 與哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白分子中半胱氨基酸重復(fù)分布規(guī)律一致。植物金屬硫蛋白II型有十四個(gè) 半胱氨酸(Cys)，是目前發(fā)現(xiàn)在植物蛋白中含有巰基數(shù)目最多的類型。紅樹植物木欖是東方紅樹林中的廣普種之一，生活在富含多種重金屬的河口、海灣和海 岸，能吸附大量金屬離子于體內(nèi)(G. R. Macfarlae, M. D. Burchett, 2001. Photosynthetic pigmentsand peroxidase activity as indicators of heavy metal stress in the grey mangrove, Avicennia marina (Forsk.) Vierh. Marine Pollution Bulletin. 42 (2):233-240),研究它的相關(guān)金屬硫蛋白基因，對(duì)生 態(tài)環(huán)境中重金屬污染的凈化具有重要意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)從紅樹植物木欖分離總RNA，合成第一鏈cDNA，再根據(jù)植物type II MT相 對(duì)保守的(1)和(3)區(qū)域中氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，應(yīng)用快速末端擴(kuò)增(RACE)技術(shù) 克隆到木欖金屬硫蛋白的cDNA，該基因命名為BMT，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所述， 所編碼的蛋白命名為6MT，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所述。將木欖金屬硫蛋白的核苷酸 序列及其編碼的氨基酸序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源檢索和比較，發(fā)現(xiàn) 是一種新的植物type II金屬硫蛋白。將木欖金屬硫蛋白的cDNA插入到pET100-TOPO表達(dá) 載體上，將重組子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化子對(duì)重金屬Z^+和Cc^+具有抗性。因此，本發(fā)明的第一目的是提供從紅樹植物木欖中克隆到的金屬硫蛋白基因BMA以及 由此推斷的氨基酸序列，這個(gè)基因可以轉(zhuǎn)入高等植物中，培育轉(zhuǎn)基因金屬硫蛋白生物，對(duì)重 金屬污染的環(huán)境進(jìn)行修復(fù)。本發(fā)明的第二目的是提供利用載體表達(dá)所述金屬硫蛋白基因BMA的方法。本發(fā)明將在下述方面產(chǎn)生有益效果將紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)速度快、 生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)的生物中，培育轉(zhuǎn)基因金屬硫蛋白生物，對(duì)重金屬污染的環(huán)境進(jìn)行修復(fù)。


圖l是木欖金屬硫蛋白(II)的氨基酸序列與其它植物typeIIMT的同源比較。 (Comparison of amino acid sequence of ZjMT from 5r吸i/j'ara g,/ arr/w'za with other plant MT type II protein)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明，但本發(fā)明不限于 下述實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 )中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。實(shí)施例1:木欖BMT的cDNA序列的克隆和測(cè)序 1. BMT的局部cDNA的擴(kuò)增及測(cè)序 分離木欖總RNA稱0.2克木欖(嫩芽)于研缽中加入液氮，磨成粉末，并立即轉(zhuǎn)入無(wú)RNase的2 ml離心 管中，加入lml植物RNA提取液，充分混勻，水平放置離心管；混合液乳化5min后，在室溫中，13000rpm離心4min。將上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)RNase的2ml離心管中；加入0.2 ml 5 MNaCl于管中混勻，再加入0.6 ml的三氯甲烷，充分混勻后，在4 。C下，13000 rpm離心 10min;將上清液再轉(zhuǎn)入無(wú)RNase的2 ml離心管中，加等體積的異丙醇?；靹蚝螅胖?20 °C 15min后，在4 。C下；小心地廢棄上浮液，其沉淀物用1 ml無(wú)RNase的75%的乙醇漂洗， 13000 rpm離心1 min;倒掉上浮液，用40 pl無(wú)RNase DEPC水充分溶解RNA，并進(jìn)一步純 化，放入-70 。C備用。 合成第一鏈cDNA:根據(jù)試劑盒的要求和上述RNA的質(zhì)量，其第一鏈cDNA合成體系與反應(yīng)參數(shù)如下總RNA (5嗎) 5 pl10mMdNTPmix 1^101igo(dT)12-l8(0.5嗎) 1 pl2 nM GSP 1 JillDEPC-treated water 2 pl將上述溶液混合后，65。C反應(yīng)5min，立即放入冰中5 min后加入10 XRT Buffer 2^125 mM MgCl2 4 ^0.1MDTT 2^1RNaseOUT RNase Inhibitor (40U/nl) 1混合后，在離心機(jī)上輕離，其后將管在45 。C下反應(yīng)2 min，再加入1^1的反轉(zhuǎn)錄酶 (Superscript IIRT 200 U/pl),在45 'C下反應(yīng)60 min，其后在70 'C下反應(yīng)15 min。將 管放入冰上，再加入lpl的RNase H (40U/^)，在37 。C下20min。放入-20 。C下保存?zhèn)溆谩?以第一鏈cDNA為模板，用一對(duì)簡(jiǎn)并引物——A: 5'- ATGWSITGYGGIGGIAAYTG-3' 為正向引物，B: 5'-RCAIKTRCAIGGRTYRCAIKTRCA-3'為反向引物(其中W=A/T; S=G/C; Y=C/T; R=A/G; K=G/T)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94 。C預(yù)變性4 min; 94 °C 變性40s; 58 °C退火40s; 71 。C延伸1.5 min;循環(huán)40次；最后72 。C延伸10 min。將目 的片段與pUCm-T載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot，送上海生物技術(shù)服務(wù)有限公 司測(cè)序。 2. RACE反應(yīng)根據(jù)試劑盒RACE (Invitrogen)的要求，以上述的核苷酸序列為對(duì)象設(shè)計(jì)3'-RACE特 異引物(5'陽(yáng)CAG TTG CTT CCG CAC TTG-3')禾卩5'-RACE的特異引物 (5'-CTTCCGCACTTGCAGCCTCCGTTC T-3')，分別進(jìn)行RACE反應(yīng)，其PCR擴(kuò)增程 序，3'-RACE為94 。C預(yù)變性2min; 94 。C變性30s; 55 。C退火30s; 72 。C延伸1.5min;5循環(huán)35次；最后72 。C延伸7min。 5、RACE為94 。C預(yù)變性2min; 94 T變性30s; 72 。C， 1.5 min，循環(huán)5次；94 。C變性30s, 70 。C， 1.5 min，循環(huán)8次；94 。C變性30s， 68退 火30s; 71 'C延伸1.5min;循環(huán)30次；最后72 'C延伸7min。分別將目的片段與pUCm-T 載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，送上海生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。結(jié)合3'-和5'-RACE的結(jié)果分析獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共682 bp，其中開放閱讀框位于 89-328位核苷酸，這一閱讀框編碼79個(gè)氨基酸殘基。實(shí)施例2:同源比較用本發(fā)明的木欖BMT的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的蛋白，在GenBank+EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中， 用BLAST程序進(jìn)行核苷酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平上與蓖麻i /c/m^ cowwwm's (L02306)，軟木橡樹jgweraw w6er (AJ277599)，山毛櫸Fag^ sj;/ra"ca (AY574281)， 豇豆Wg朋a"gw/an':y (AB176561)，模式植物擬南芥爿ra&Wop^y (AY077669)的同源性大于60%。在氨基酸水平上6MT蛋白與上述植物金屬硫蛋白的同源性分別為82%， 81%， 81%， 79%， 70% (同源比較見圖l)。其蛋白序列中N-和C-端分別包含8和6個(gè)半胱氨基酸 殘基，并以Cys-Cys，Cys-X-Cys和Cys-X-X-Cys形式分布，因此，6MT是一種新的植物type II金屬硫蛋白。實(shí)施例3:木欖6MT在大腸桿菌中的表達(dá)1. 重組DNA工程菌的構(gòu)建實(shí)例在該實(shí)施例中，以實(shí)施例l中全長(zhǎng)cDNA為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)正向引物5'-CACCAT GTCTTGCTGTGGTGGAAAC -3 '和反向引物5'- TCATTTACAAGTG AGGG GTC -3 '進(jìn) 行RT-P CR反應(yīng)，擴(kuò)增BMT的開放閱讀框序列。根據(jù)試劑盒(Champion. pET Directional TOPO Expression Kits,購(gòu)自Invitrogen)的要求，將擴(kuò)增的片段插入至lJpET100-TOPO表達(dá) 載體上，該質(zhì)粒載體編碼抗生素性(Amp", —個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/0)、 一個(gè)核糖 體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、 一個(gè)6x組氨酸標(biāo)記物。質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)入100 14感受態(tài)大腸桿菌(BL21)中并在具有Amp的LB固體培養(yǎng)基中37 'C培養(yǎng)過(guò)夜。為了確定木欖BMT的存在，挑選白斑菌 落制備質(zhì)粒，并用上述引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖電泳分析，木欖6MT基因分子大小為240bp。2. 菌種培養(yǎng)及重金屬抗性實(shí)例從培養(yǎng)皿菌落中選擇具有6MT基因的菌種培養(yǎng)于含有Amp (100 Pg/ml)的100 ml LB 培養(yǎng)液，在溫度為37 。C的搖床中(200 rpm)培養(yǎng)至OD6。。達(dá)到0.5-0.8，加入IPTG誘導(dǎo)物 (終濃度為1.0mM)，涂布在分別含有不同濃度的Zn2、 Cu2+、 Pb2+、 Hg2，P Cc^+的LB固體 培養(yǎng)基上，在溫度為25 'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天(設(shè)對(duì)照組即不含6MT基因的菌種)。根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落生長(zhǎng)狀況可以得出，對(duì)照菌種在Zr^+濃度為1000 pM的培養(yǎng)基中已不 能生長(zhǎng)，而具有6MT的菌種能正常生長(zhǎng)，甚至Zr^濃度高至1500nM;對(duì)照菌種在CcP濃度為1000 nM時(shí)已不能生長(zhǎng)，而具有6MT的菌種在濃度為2000pM培養(yǎng)基中仍能正常生長(zhǎng); 無(wú)論是對(duì)照菌種還是具有6MT的菌種對(duì)重金屬Cu2+、 Pb2+、 Hg^的表達(dá)無(wú)差異。<110>中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所<120>紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列<160〉2<210>1<211>682〈212〉DNA〈213>木欖(i5r收〃j'ar3 g，/7orr力iza)〈220><221>CDS〈222〉 (89)…(328) 〈400>1g已a(bǔ)aactagttcaBtaCgCCattattatctatcatcggattatctgag^aaaataaccc 60ctcga33^c犯3gC33tCtcctg犯ggatgtcttgctgtggtgg3咖tgcggctgcgg 120agcaagctgcaagtgcggcaacggctgtgg鄉(xiāng)gtgcaagatgtacccagacatgggctt 180cgccg卿agaccactaccgagactctggttctcggcgtggggcctg卿gggcccactt 240tg鄉(xiāng)gagccg卿tgggcgtgccggccgagaacggaggctgcaagtgcggaagcaactg 300cacctgcgacccctgcacttgta犯tgagggg犯agtgac郷,ggtccgatctatta 360ttagtctatatgtgtgtgttgggagtcttgcttacaataaaccagtcatgccttgcgttt 420cctccatgctcagatcttaggttttaagttatctctctggtttctccaagctatggattt 480tcagtgtctagttttcctgtattacaaggaccgtatatgcatggtcggaa 540tccttccaaccatttcgtttgtctaaatatatatatctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttt 600gatggga犯gtgagcttctatatgttttatgactaatgc3aactcgcttcttctaagtta 660tgcttgca犯as682〈210>2<211>79<212〉PRT〈213〉木欖(^r〃卵iera g拜/ orr/w'za) <400>2Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Ser15 10 15Cys Gly Ser Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Met Ser20 25 30Leu Ala Glu Lys Thr Thr Thr Glu Thr Leu Val Leu Gly Val Ala35 40 45Pro Glu Arg Gly His Leu Glu Gly Ala Glu Met Gly Val Pro Ala50 55 60Glu Asn Gly Gly Cys Lys Cys Gly Ser Asn Cys Thr Cys Asp Pro65 70 75Cys Thr Cys Lys 79
權(quán)利要求
1.一種從紅樹植物木欖中分離的金屬硫蛋白基因，所述基因具有SEQ ID NO.1的第89位到328位堿基對(duì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因編碼的金屬硫蛋白，它具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。
3. —種在大腸桿菌中表達(dá)木欖金屬硫蛋白基因的方法，其包含將權(quán)利要求l的金屬硫 蛋白基因DNA分子與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到宿主體中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的表達(dá)載體是pET100-TOPO。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的宿主體是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種紅樹植物木欖金屬硫蛋白及其編碼的序列，該cDNA序列編碼蛋白含有SEQ ID NO.1的第89位到328位堿基對(duì)，屬于一種新的植物type II金屬硫蛋白。本發(fā)明還涉及該核苷酸的分離方法和bMT蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。將編碼bMT的DNA序列重組到質(zhì)粒載體pET-100 TOPO并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，在分別含有不同濃度重金屬的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性研究。具有bMT的菌種能抵抗一定濃度的Zn²⁺和Cd²⁺。金屬硫蛋白研究成果涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、衛(wèi)生毒理學(xué)、食品科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、保健科學(xué)和方法學(xué)等領(lǐng)域；可以開發(fā)各種治療藥物、保健化妝品等外，還可以利用轉(zhuǎn)基因金屬硫蛋白生物進(jìn)行重金屬污染環(huán)境的修復(fù)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101260402SQ200810027229
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者孫翠慈, 張鳳琴, 王友紹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所