硬蜱科蜱蟲coiii基因全長序列的擴(kuò)增引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及硬蜱科蜱蟲C0III基因全長序列的 擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 硬蜱科（Ixodidae)隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda)，蛛形綱（Arachnida)，蜱 目（Ixodida)。目前，全世界已知硬蜱種類超過700種，我國硬蜱記錄有效種分屬于硬蜱屬 (Ixodes)、花蜱屬（Amblyomma)、血蜱屬（Haemaphysalis)、革蜱屬（Dermacentor)、璃眼蜱 屬（Hyalomma)、扇頭蛛屬（Rhipicephalus)以及異扇蛛屬（Anomalohimalaya)7 個屬共 106 種。蜱類在宿主體上吸食血液，對人和家畜危害很大。蜱蟲的叮咬，不僅造成宿主血液損失， 還可引起宿主皮膚出現(xiàn)炎癥、潰瘍等癥狀。更重要的是，硬蜱作為媒介可傳播人、畜疫病，包 括病毒病（森林腦炎、出血熱）、立克次體?。≦熱）、細(xì)菌?。ú际蠗U菌）、螺旋體?。ㄈR姆 ?。┮约霸x?。ò拓愃瓜x、泰勒蟲）等。蜱蟲的物種鑒定及蜱媒分布調(diào)查是蜱媒及蜱傳疫 病防控的重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)蜱蟲物種的分類鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)，然而形態(tài)學(xué)的鑒定需要經(jīng) 驗豐富的專家，而且形態(tài)學(xué)對蜱蟲未成熟個體（卵、幼蟲）及蟲體不完整的標(biāo)本難以鑒定。 分子生物學(xué)技術(shù)可解決上述難題。
[0003] 利用分子技術(shù)對物種進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種有效的方法。線粒體 C0III基因具有較高的進(jìn)化速率和種內(nèi)保守性，是鑒定物種和研究物種間進(jìn)化關(guān)系較為理想 的靶標(biāo)基因。然而，Genbank數(shù)據(jù)庫中硬蜱COIII序列較少，且缺少擴(kuò)增硬蜱科COIII基因的 通用引物，嚴(yán)重制約了C0III序列在蜱蟲系統(tǒng)發(fā)生及蜱媒流行病學(xué)調(diào)查研究中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種硬蜱科蜱蟲C0III基 因全長序列的擴(kuò)增引物。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種硬蜱科蜱蟲C0III基因全長序列的擴(kuò) 增引物，其包括：
[0006] C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ；
[0007] C0III-TR:5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。
[0008] 本發(fā)明還提供一種含有所述引物的用于檢測硬蜱科蜱蟲的試劑盒。
[0009] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液中的至 少一種。
[0010] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述引物或所述試劑盒在檢測硬蜱科蜱蟲中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了硬蜱科蜱蟲的特異性PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0013] 1)提取樣品DNA;
[0014] 2)以步驟1)提取的DNA為模板，利用所述的引物C0III-TF和C0III-TR進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)；
[0015] 3)分析PCR產(chǎn)物。
[0016] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)體系以50μ1計為：5yL10XPCRbuffer，2yL引物 〇)111-丁？，2以1^引物〇)111-丁1?，2 4 1^(1^138(101111)，4 4 1 2. 5mMMgCl2,1μLTaq酶，蜱蟲 DNA模板基因組2μL(10~20ng)，加滅菌雙蒸水至50μ1。
[0017] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)條件為：PCR擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30S，45°C 退火30S，72°C延伸lmin，共36個循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明提供的硬蜱科蜱蟲coin基因的擴(kuò)增引物，可有效擴(kuò)增硬蜱科線粒體com 基因全長序列，擴(kuò)增效率達(dá)到98. 5%。
【附圖說明】
[0020] 圖1為用本發(fā)明所述引物對11種蜱蟲DNA樣本進(jìn)行PCR檢測的1%瓊脂糖凝膠電 泳圖；
[0021] 其中：1 :全溝硬蜱Ixodespersuleatus;2 :邊緣革蜱Dermacentormarginatus; 3 :嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna;4 :長角血蜱Haemaphysalislongicornis;5 :亞 洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum;M:DL2000Marker;6 :日本血蜱Haemaphysalisjaponica; 7:微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus;8:小亞璃眼蜱Hyalommaanatolicum;9:草原 革蜱Dermacentornuttalli;10 :草原血蜱Haemaphysalisverticalis;11 :殘緣璃眼蜱 Hyalommadetritum。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實施例1
[0024] 1、數(shù)據(jù)收集：從Genbank中下載硬蜱科不同蜱蟲物種線粒體COIII基因序列 (NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
[0025] 2、序列比對：利用MEGA軟件中的ClustalW程序?qū)⑹占降挠豺缈乞缦xCOIII序列 進(jìn)行序列比對，找出較保守、堿基變異度最小的序列片段。
[0026] 3、引物合成：根據(jù)上述的比對結(jié)果，利用引物設(shè)計軟件Primerf在堿基變異度最 小的序列片段設(shè)計出1對兼并擴(kuò)增引物。
[0027] 引物序列為：
[0028] C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ；
[0029] C0III-TR:5' -AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。
[0030] 4、引物擴(kuò)增：將上述引物分別應(yīng)用于PCR擴(kuò)增所采集的表1所示的硬蜱科5個屬 11個種265個個體的COIII序列的PCR擴(kuò)增。
[0031] 表1硬蜱科5個屬11個種
[0032]
[0033] 5、擴(kuò)增結(jié)果檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5倍的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（見圖1)。結(jié)果 顯示，該引物可有效擴(kuò)增硬蜱科線粒體COIII基因序列，共獲得265個硬蜱樣本中的261個 個體的C0III全長序列，擴(kuò)增效率達(dá)到98. 5%。利用此對引物擴(kuò)增出的DNA片段長度約為 780bp〇
[0034] 針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲取了全溝硬蜱Ixodespersuleatus、邊緣革蜱 Dermacentormarginatus、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna、長角血蜱Haemaphysalis longicornis、亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、曰本血蜱Haemaphysalisjaponica、 微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus、小亞璃眼蜱Hyalommaanatolicum、草原革蜱 Dermacentornuttall、草原血蜱Haemaphysalisverticalis和殘緣璃眼蜱Hyalomma detritum共11個種的線粒體COIII基因序列，其具體的核苷酸序列見SEQIDNo. 3-13。
[0035] 特異性擴(kuò)增引物條件：
[0036] 上述C0III-TF與C0III-TR擴(kuò)增引物的50yL PCR反應(yīng)體系為：5yL10XPCR buffer，2 μL引物CO III -TF，2 μL引物CO III -TR，2 μL dNTPs (10mM)，4 μ1 2. 5mM MgCl2， 1 μL Taq酶，蜱蟲DNA模板基因組2 μL (10~20ng)，加滅菌雙蒸水至50 μ1。
[0037]PCR反應(yīng)條件：預(yù)熱 94°C，5min;94°C30s，45°C30s，72°Clmin，共 36 個循環(huán)；末次 延伸 72°(：，711^11，4°(：保存。
[0038] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 硬蜱科蜱蟲COIII基因全長序列的擴(kuò)增引物，其特征在于，其包括： COIII-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ； C0III-TR:5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。2. 含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測硬蜱科蜱蟲的試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚 合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。5. 權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測硬蜱科蜱蟲中的應(yīng) 用。6. 硬蜱科蜱蟲的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品DNA; 2) 以步驟1)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物C0III-TF和C0III-TR進(jìn) 行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 分析PCR產(chǎn)物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以50μ1計為：5μL 10XPCRbuffer，4yl2.5mMMgCl2,2yL引物C0lII-TF(10mM)，2yI^|*C0lII-TR(10mM)， 2yLdNTPs(10mM)，lyLTaq酶（lU/μΙ)，蜱蟲DNA模板基因組 2yL(10 ~20ng)，加滅菌 雙蒸水至50μ1。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為：PCR擴(kuò)增程序：94°C 預(yù)變性5min;94°C變性30S，45°C退火30S，72°C延伸lmin，共36個循環(huán)；72°C延伸7min，4°C 保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體提供了硬蜱科蜱蟲COIII基因全長序列的擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的硬蜱科蜱蟲COIII基因的全長序列擴(kuò)增引物如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示，其可有效擴(kuò)增硬蜱科線粒體COⅢ基因序列全長(778bp)，擴(kuò)增效率達(dá)到98.5％。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105462965
【申請?zhí)枴緾N201510159290
【發(fā)明人】呂繼洲, 韓雪清, 王慧煜, 袁向芬, 賈廣樂
【申請人】中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年4月3日