專利名稱：：一種低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種寄生蟲的保存方法，具體涉及一種低溫保存剌激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法。技術(shù)背景刺激隱核蟲(Co^ocao;朋/m'ta"5Brown1951)是一種魚類專性寄生蟲，寄生于熱帶、亞熱帶海水魚的鰓和皮膚表皮下，引起高致死性的"白點(diǎn)病"。為了系統(tǒng)地研究刺激隱核蟲，我們用卵形鯧鰺作為模型動物，建立起一套高效的傳代、繁殖系統(tǒng)，能借此獲得大量的蟲體樣本，為進(jìn)一步研究該蟲奠定了基礎(chǔ)。但是，要想在宿主魚體上保存蟲株，傳代過程就不能中斷，即使在不需要寄生蟲的時候，傳代工作也必須不間斷地持續(xù)進(jìn)行下去，這將造成經(jīng)濟(jì)和時間的巨大浪費(fèi)。此外，Burgesset等(1994)在傳代過程中發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲的活力會隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減弱，即"老化現(xiàn)象"，蟲體"老化"終會導(dǎo)致蟲株的傳代中斷。Houghton等(1986)和Noe等(1995)發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲(/cM^op/z由WMsmM/^//^)蟲株的傳代也具有老化現(xiàn)象。因此研究者在傳代時盡量想辦法延長寄生蟲每個生命周期時間所需的，減少傳代次數(shù)，以延長蟲株的生存時間。在傳代中降低溫度被認(rèn)為是一個好的方法，NoeandDickerson(1995)在多子小瓜蟲的傳代過程中把溫度從25t:降低到9'C，使得寄生蟲在魚體上寄生的時間從5~6天延長到了20.4天。在本方法中，我們成功地在低溫下離體保存了剌激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，這樣，在我們不需要寄生蟲時就讓它們在低溫下保持休眠狀態(tài)，當(dāng)我們需要時，就讓它們恢復(fù)到發(fā)育狀態(tài)，重新在魚體上傳播，這樣就從根本上解決了傳代過程中遇到的難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊。本發(fā)明的另一個目的是提供上述低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法。本發(fā)明的低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法，包括如下步驟1.刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊的保存方法采集刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，在8-15"C下保存于人工氣候箱中，相對濕度90%，光照12hr黑暗/12hr光照。每隔5d換一次滅菌海水，換水量20%。2.低碌保存刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊方法的有效性檢驗(yàn)每隔1個月檢測一次滋養(yǎng)體和包囊在27.(TC的孵化率和孵出幼蟲的感染力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12'C下保存了4個月的滋養(yǎng)體和保存了3個月的包囊還能孵出具有感染能力的幼蟲，這些幼蟲在條件合適的情況下能繁殖出大量的后代，而且后代的毒力沒有下降。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果用本發(fā)明的方法來保存刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，可以使保存了4個月的滋養(yǎng)體和保存了3個月的包囊還能孵出具有感染力的幼蟲，這些幼蟲在條件合適的情況下能繁殖出大量的后代，而且后代的毒力沒有下降。這樣，在我們不需要寄生蟲時就讓它們在低溫下保持休眠狀態(tài)，當(dāng)我們需要時，就讓它們恢復(fù)到發(fā)育狀態(tài)，重新在魚體上傳播，以減少刺激隱核蟲傳代工作中造成的經(jīng)濟(jì)和時間的巨大浪費(fèi)，同時可以延緩蟲株的老化。附表說明表i經(jīng)過12i:低溫保存后寄生蟲的孵化率和感染力<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注每一孵化率的數(shù)據(jù)為2個樣本的平均值；每一鰓片上滋養(yǎng)體總數(shù)的數(shù)據(jù)為5個樣本的平均值；表2低溫保存前、后刺激隱核蟲幼蟲對卵形鯧鰺的致死劑量^5ig染劑量卵形鯧鯪死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注兩次實(shí)驗(yàn)所用的卵形鯧鰺質(zhì)量分別為127.5±7.9g(n=120，低溫保存前)和130.5±6.5g(n=120，低溫保存后)，每個劑量組20尾魚兩次實(shí)驗(yàn)所用的刺激隱核蟲幼蟲分別是由沒有經(jīng)過低溫保存和在12.0X〕下保存了4個月的滋養(yǎng)體孵出具有感染力的幼蟲。具體實(shí)施方式實(shí)施例1刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊的保存方法采集剌激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，分別放入24孔組織培養(yǎng)板(每孔50個寄生蟲)和5cm培養(yǎng)皿(每個培育皿IOOO個寄生蟲)中，在8-15"C下保存于人工氣候箱中，相對濕度卯。/。，光照12hr黑暗/12hr光照。為了確保保存條件一致，把所有裝有寄生蟲的24孔組織培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿一起放入一個10L的燒杯中，加入5L滅菌海水，保持微量充氣，每隔5d換一次滅菌海水，換水量2L。培育寄生蟲的海水先過濾，再于120°C中滅菌30min，使用前加入100IU/ml的青霉素和:00ul/ml的鏈霉素。實(shí)施例2.低溫保存刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊方法的有效性檢驗(yàn)收集刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊，按上述方法在8-15。C下保存，每隔L個月檢測一次滋養(yǎng)體和包囊在27.0。C的孵化率和孵出幼蟲的感染力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的增加，滋養(yǎng)體和包囊的孵化率和幼蟲的感染力都會逐漸降低，在12"C下保存了4個月的滋養(yǎng)體和保存了3個月的包囊還能孵出具有感染能力的幼蟲。在12t:下保存了4個月的滋養(yǎng)體所孵出的幼蟲在條件合適的情況下能繁殖出大量的后代，而且后代的毒力沒有下降，因?yàn)榕c保存前相比較，它們對相同大小卵形鯧鰺的致死劑量沒有降低。權(quán)利要求1.一種低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法，其特征在于包括如下步驟(1)刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊的保存方法采集刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，在8-15℃下保存于人工氣候箱中，相對濕度90％，光照12hr黑暗/12hr光照。為了確保保存條件一致，把所有裝有寄生蟲的24孔組織培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿一起放入一個10L的燒杯中，加入5L滅菌海水，保持微量充氣，每隔5天換一次滅菌海水，換水量2L；培育寄生蟲的海水先過濾，再于120℃中滅菌30分鐘，使用前加入100IU/ml的青霉素和100ul/ml的鏈霉素。(2)低溫保存刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊方法的有效性檢驗(yàn)每隔1個月檢測一次滋養(yǎng)體和包囊在27.0℃的孵化率和孵出幼蟲的感染力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在8-15℃保存了4個月的滋養(yǎng)體和保存了3個月的包囊還能孵出具有感染能力的幼蟲，這些幼蟲在條件合適的情況下能繁殖出大量的后代，而且后代的毒力沒有下降。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的在8-15。C下保存于人工氣候箱中，相對濕度90%，光照12hr黑暗/12hr光照。3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的每隔5d換一次滅菌海水，換水量2L。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的為了確保保存條件一致，把所有裝有寄生蟲的24孔組織培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿一起放入一個10L的燒杯中，加入5L滅菌海水，保持微量充氣，每隔5天換一次滅菌海水，換水量2L。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的培育寄生蟲的海水先過濾，再于12(TC中滅菌30分鐘，使用前加入100IU/ml的青霉素和100ul/ml的鏈霉素。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的每隔1個月檢測一次滋養(yǎng)體和包囊在27.0'C的孵化率和孵出幼蟲的感染力。7.—種低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法，其特征在于由權(quán)利要求1所述方法保存。全文摘要本發(fā)明公開了一種低溫保存刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和包囊的方法，包括(1)采集刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，在8-15℃下保存于人工氣候箱中，相對濕度90％，按12hr黑暗/12hr光照。每隔5d換一次滅菌海水，換水量20％；(2)每月對低溫保存的滋養(yǎng)體和包囊進(jìn)行檢測1次，測定其在溫度回復(fù)至27.0℃時的孵化率和孵出幼蟲的感染力。用本發(fā)明的方法來保存刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體和包囊，可以使保存了4個月的滋養(yǎng)體和保存了3個月的包囊還能孵出具有感染力的幼蟲，這些幼蟲在條件合適的情況下能繁殖出大量的后代，而且后代的毒力沒有下降。文檔編號C12N1/10GK101260367SQ20081002754公開日2008年9月10日申請日期2008年4月22日優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日發(fā)明者但學(xué)明,李安興申請人:中山大學(xué)