專利名稱：天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶解制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)分離處理方法，尤其涉及天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶解 制備方法，用于處理從蜂蠟中獲得甾體類植物生長調(diào)節(jié)劑--蕓苔素內(nèi)酯類物質(zhì)。
背景技術(shù)：
蕓苔素內(nèi)酯類物質(zhì)(Brassinolide，簡稱BR)又名油菜素內(nèi)酯，是美國Mirchdl 博士等人，于1970年首次從油菜花粉中分離發(fā)現(xiàn)。經(jīng)深入研究證明，蕓苔素內(nèi) 酯有多種獨特的調(diào)節(jié)植物生長的生理活性，與已知的生長素、細(xì)胞分裂素、赤 霉素(920)、脫落酸、乙烯等植物生長調(diào)節(jié)劑相比，生物活性更強(qiáng)，使用量更 低，安全性更高，在農(nóng)業(yè)上增產(chǎn)增收的效果更好。1982年第八屆國際植物生長 物質(zhì)大會上，被一致公認(rèn)為新一代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料即世界第六大植物生長調(diào)節(jié)劑。
Grand和Mandeve等各國科學(xué)家在600多種植物花粉中分離出這種具有生 理活性的蕓苔素內(nèi)酯化合物，并進(jìn)一步證明具以下基本結(jié)構(gòu)加上不同的側(cè)鏈基 團(tuán)，構(gòu)成的4種同系物生理活性最強(qiáng)。蕓苔素內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 3</formula>蕓苔素內(nèi)酯為特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，已經(jīng)證實任何一種化學(xué)合成方法，只能得到一種與之相近而不是完全相同的化合物，化學(xué)合成無法在立體結(jié)構(gòu)上做 到與天然物質(zhì)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同，這就大大降低了其效果。而且化學(xué)合 成法的生產(chǎn)工藝時間長，反應(yīng)物不易提純，對環(huán)境有污染，生產(chǎn)成本高。
從生物源中提取蕓苔素內(nèi)酯，如從蜂蠟、榨油后的餅渣中提取，專利
85102899以蜂蠟采用NaOH皂化，鹽酸中和，硅膠柱層析分離的方法。但此方 法使用大量的四氯化碳、氯仿作萃取溶劑，消耗大量的酸堿，環(huán)保壓力巨大， 嚴(yán)重危害工人健康，污染環(huán)境，而且生產(chǎn)消耗大，生產(chǎn)成本相對較高，副產(chǎn)物 作為廢物不能綜合利用，不能適應(yīng)市場的需求。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有合成技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種原料易得，工藝 操作簡便，生產(chǎn)過程能耗低，產(chǎn)品純度高，環(huán)保節(jié)約的蕓苔素內(nèi)酯制備方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
蕓苔素內(nèi)酯的生物酶制備方法，經(jīng)過下列步驟
A、 在培養(yǎng)基中接種假單胞菌液，調(diào)節(jié)液溫至25 3(TC，攪拌40 50r/min;
B、 通氣培養(yǎng)，發(fā)酵時間15 25h;
C、 發(fā)酵規(guī)模從2L放大至IOOL、 500L罐，加入發(fā)酵液體積從0. 8L、 40L擴(kuò) 大到200L,酶活力達(dá)到900 1400U/L;
D、 反應(yīng)發(fā)酵液加入絮凝劑再離心除去菌體，獲得粗酶液；
E、 粗酶液經(jīng)中空纖維系統(tǒng)超濾濃縮，同時去掉無機(jī)鹽及部分小分子物質(zhì)， 得到2000 2500U/L的濃縮酶液；
F、 將濃縮酶液加到分散的蜂蠟乳化液中，調(diào)pH7.0 8. 5，攪拌，升溫到30 40°C,定向水解不少于3h，水解接近終點時，加入適量的生成物萃取劑；
G、酶解液經(jīng)乙醇萃取，板框壓濾機(jī)過濾，濃縮罐濃縮后，采用吸附樹脂柱分離純化，真空濃縮，結(jié)晶，得到99%蕓苔素內(nèi)酯產(chǎn)品。
所述的步驟A中的培養(yǎng)基組成為，油脂0.75%， NaNO40.2%，酵母膏0. 5%,K2HP040.2%，消泡劑0. 010 0. 018%, pH7.5。
所述的步驟A中所用菌株為熒光假單胞菌(/>se^omo asy7"omsce s),購買自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保歲號為CGMCC No. 1. 867。
所述的步驟F中蜂蠟乳化液制作工藝為每100L水中，加入蜂蠟20 30kg，乳化劑0. 6 0. 9kg,在70 80。C攪拌50 60r/min ，乳化2 3h。
本發(fā)明所用原料蜂蠟是由高級一元醇和高級脂肪酸形成的酯，極具油溶性而非水溶性，選用乳化性極強(qiáng)而又不干擾酯酶定向水解活性的乳化劑，將蜂蠟制成高分散乳化液體。在酯酶的發(fā)酵過程中，采用低溫延時發(fā)酵技術(shù)，酯酶在發(fā)酵液中獲得最佳積累，以中空纖維超過濾系統(tǒng)濃縮發(fā)酵酯酶液，中空纖維超濾系統(tǒng)由若干空心纖維絲成束地裝配組成，每根纖維絲即成為一個微細(xì)管型膜(相當(dāng)于一個超濾單位)。纖維絲膜切面內(nèi)壁的表層細(xì)密，向外逐漸疏松，形成各向異性微孔膜管結(jié)構(gòu)，在除去發(fā)酵液中無機(jī)鹽及部分小分子雜質(zhì)的同時，獲得高活性、高濃度的液體酯酶。假單胞菌產(chǎn)生的酯酶為一種專一水解蜂蠟中酯鍵的酶，對蜂蠟中的酯鍵產(chǎn)生高親和性，加到高度分散的蜂蠟乳化液中，實現(xiàn)定向水解，在水解接近終點時，加入適暈的生成物萃取劑，打破酯酶催化的平衡點，使酯酶定向水解更徹底，水解率達(dá)到86%以上。
蜂蠟中含有多種蕓苔素類似物，這些混合的類似物對農(nóng)作物的效應(yīng)沒有加和作用。粗混合物活性很低，即使加大施用濃度也不會提高生物活性，而分離純化的蕓苔素在極低濃度下也表現(xiàn)出極高生物活性。因此，蕓苔素的分離純化及純度是保障蕓苔素產(chǎn)品質(zhì)量的又一關(guān)鍵。本發(fā)明采用樹酯吸附柱分離純化技術(shù)取代硅膠柱分離純化，獲得高純度的蕓苔素產(chǎn)品。
產(chǎn)品經(jīng)質(zhì)譜檢測分析，GC-EI-MS質(zhì)圖譜顯示樣品中屬于蕓苔素內(nèi)酯的有3
個峰
對21.89峰言其碎片峰為479 (M-1)、 412、 398、 383、 380 (C22~C23斷裂，H轉(zhuǎn)移)、379、 365、 314 (M-1， C20-C22斷裂,2、 3位羥基斷裂，基峰)、299、 285、 271、 173。
對24.97峰言起碎片峰為479 (M-1)、 451、 412、 397、 380 (C20-C22斷裂、H轉(zhuǎn)移)、379、 314 (M-1, C20-C22斷裂，2、 3位羥基斷裂，基峰)、299、285、 271、 173。
對28.63峰言其碎片峰為479 (M-l)、 416、 401、 440、 380(C20-C22斷裂、H轉(zhuǎn)移)、379、 355、 337、 314 (M-l, C20-C22斷裂，2、 3位羥基斷裂，基峰)、299、 285、 271、 173。
即2L89， 24.91， 28.64,為蕓苔素內(nèi)酯的三個異構(gòu)體。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點.-
1. 原料易于獲得，成本低廉。本發(fā)明以十字花科植物(油菜等)蜂蠟為原料生產(chǎn)蕓苔素。蜜蜂采食花粉分泌蜂蠟的過程是對蕓苔素的富集過程，以蜂蠟為原料比用油菜花粉生產(chǎn)成本更低廉。作為四川的優(yōu)勢資源，油菜源蜂蠟?zāi)戤a(chǎn)5000噸。因此用蜂蠟作原料生產(chǎn)蕓苔素，資源有保障。
2. 工藝先進(jìn)。本發(fā)明以自主開發(fā)的生物酶解技術(shù)生產(chǎn)蕓苔素內(nèi)酯。采用專一水解蜂蠟中酯鍵的酯酶定向水解經(jīng)高分散乳化處理的蜂蠟，并加入生成物萃取劑打破酯酶催化平衡點，提高酯酶水解率，最后采用強(qiáng)吸附型樹脂柱取代硅膠柱，分離純化制備得到蕓苔素內(nèi)酯。生物酶水解蜂蠟生產(chǎn)蕓苔素內(nèi)酯屬于國內(nèi)首創(chuàng)，是應(yīng)用發(fā)酵工程、酶工程、化學(xué)工程技術(shù)的綜合技術(shù)，達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先和國際先進(jìn)水平。
3. 產(chǎn)品純度高質(zhì)量好。酶解法制得的蕓苔素內(nèi)酯純度》99%,產(chǎn)品至少可獲得三個以上最具生理活性的結(jié)構(gòu)'與天然產(chǎn)物完全一致的組分，與化學(xué)合成相比，具有特別突出的生理活性，最強(qiáng)的調(diào)控能力。其使用效果(按增產(chǎn)、增收的標(biāo)準(zhǔn)計)超過目前國內(nèi)所有化學(xué)合成的同類產(chǎn)品，也優(yōu)于包括脫落酸等其他植物生長調(diào)節(jié)劑。經(jīng)廣泛的試驗檢測證明，產(chǎn)品具有多種獨特調(diào)節(jié)植物生長的生理活性功能，生物活性強(qiáng)，使用量低，增產(chǎn)效果明顯，且能改善作物品質(zhì)，沒有化學(xué)合成植物調(diào)節(jié)劑的毒副作用。
4. 生產(chǎn)過程節(jié)能環(huán)保。生產(chǎn)過程中水解溫度低(40°C),時間短(3h)，水解率達(dá)到86%以上，能耗少，對設(shè)備腐蝕小，產(chǎn)品收率高(99%)。用酒精取代了皂化法中使用的有害溶劑，酒精的回收率達(dá)到93%，同時加強(qiáng)了密封及冷卻等設(shè)施的構(gòu)建。生產(chǎn)設(shè)備均考慮了通風(fēng)除塵、節(jié)約能源、降低耗能、循環(huán)利用水資源的問題，并予以實施，符合國家"三同時"制度的規(guī)定，不但減輕了環(huán)境污染，也降低了成本。廢渣可提取三十烷醇和二十八烷醇，綜合利用可進(jìn)一步降低成本，基本實現(xiàn)廢渣的零排放。


圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實施方式
具體實施例
1. 高選擇性酯酶的發(fā)酵及純化；
發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(油脂0. 75%， NaNOA 2%，酵母膏0. 5%， K2HPO40. 2%， pH7. 5)120。C滅菌30min，冷卻至28。C接入種子，28 3(TC攪拌45r/min。通氣培養(yǎng)，發(fā)酵時間為76h。
發(fā)酵液加入絮凝劑再離心除去菌體獲得粗酶液，通過板框壓濾機(jī)過濾后進(jìn)入中空纖維濃縮柱進(jìn)行超濾濃縮，得到2000 2500U/L的濃縮酶液。
2. 蜂蠟的高分散乳化處理
每100L水中，加入蜂蠟30kg,乳化劑(食品用)0. 8kg, 8(TC攪拌(60r/min)乳化2h。
3. 酯酶對蜂蠟中酯鍵的定向水解
向蜂蠟乳化液中加入0.4倍量濃縮酶液(2500u/L),攪拌(45r/min),調(diào)pH7.2 (此酶的最適pH)，溫度40°C (此酶的最適溫度)，定向水解3h,加入生成物萃取劑乙醇，蜂蠟酯鍵的水解率達(dá)到86%以上。
4. 對蕓苔素內(nèi)酯的分離純化(樹脂分離純化技術(shù))
(1) 蕓苔素的萃取
向酶解液中加入5.0倍(W/W) 95%乙醇，升溫至65'C，回流20min，萃取時間2h，冷卻至室溫。
(2) 萃取液的壓濾
經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾蜂蠟渣，過濾壓力0. 3Mpa。
(3) 萃取液的濃縮將濾液在75"C條件下真空濃縮，濃縮真空為0. 085Mpa,蒸去溶劑和水后得到膠狀物。將膠狀物溶于10倍(W/W)異丙醇中，加熱至6(TC攪拌，冷卻后過濾。濾液真空濃縮(75°C)至0.5倍體積得濃縮液。
(4)樹脂分離純化
選用山東魯能集團(tuán)樹脂分廠生產(chǎn)的CD~180樹脂作為分離純化樹脂，柱床體
積①0.5X8邁，洗脫液為乙酸乙酯甲醇乙酸=3: 16: 8混合液，用分光光
度計進(jìn)行檢測，收集紫外線吸收部分，真空濃縮，結(jié)晶，制得99%的高純度蕓苔
素內(nèi)酯。
9
權(quán)利要求
1、天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶解制備方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟A、在培養(yǎng)基中接種假單胞菌液，調(diào)節(jié)液溫至25～30℃，攪拌45r/min；B、通氣培養(yǎng)，發(fā)酵時間20h；C、發(fā)酵規(guī)模從2L放大至100L、500L罐，加入發(fā)酵液體積從0.8L、40L擴(kuò)大到200L，酶活力達(dá)到900～1400U/L；D、反應(yīng)發(fā)酵液加入絮凝劑再離心除去菌體，獲得粗酶液；E、粗酶液經(jīng)中空纖維系統(tǒng)超濾濃縮，同時去掉無機(jī)鹽及部分小分子物質(zhì)，得到2000～2500U/L的濃縮酶液；F、將濃縮酶液加到分散的蜂蠟乳化液中，調(diào)pH7.0～8.5，攪拌，升溫到30～40℃，定向水解不少于3h，水解接近終點時，加入適量的生成物萃取劑；G、酶解液經(jīng)乙醇萃取，板框壓濾機(jī)過濾，濃縮罐濃縮后，采用樹脂吸附柱分離純化，真空濃縮，結(jié)晶，得到99％蕓苔素內(nèi)酯產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶解制備方法，其特征在于 所述的步驟A中的培養(yǎng)基組成為，油脂0.75%， NaM)40.2%，酵母膏0. 5%， K風(fēng)0.2呢，消泡劑0. 010 0. 018%, pH7.5。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶解制備方法，其特征在于 所述的步驟F中蜂蠟乳化液制作工藝為每100L水中，加入蜂蠟20 30kg,乳化 劑0.6 0.9kg，在70 80。C攪拌50 60r/min，乳化2 3h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物酶的制備方法，具體為天然蕓苔素內(nèi)酯的生物酶制備方法。本方法包括接種發(fā)酵，壓濾，超濾，乳化，酶解，萃取，壓濾，濃縮，樹脂吸附，濃縮結(jié)晶，真空吸濾，干燥包裝步驟。本發(fā)明工藝方法操作簡便，生產(chǎn)過程能耗低，產(chǎn)品純度高，環(huán)保節(jié)約。
文檔編號C12P33/00GK101684483SQ20081004618
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者何其明 申請人:何其明