專利名稱：磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法。
背景技術(shù)：
磷脂酶D，即磷脂酰膽堿磷脂水解酶(EC3丄4.4),屬于催化磷酸二脂酯 鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，其主要生理功能是參與細胞脂質(zhì)代 謝、信號轉(zhuǎn)導及生物膜形成等。
磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)是磷脂酶D家族 成員之一，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，目前在細菌、酵母和哺乳動 物細胞中均有發(fā)現(xiàn)。其中，源自大腸桿菌的磷脂酰絲氨酸合成酶具有該家族 明顯的序列特征，即含有兩個間隔出現(xiàn)的H(x)K(x)4D保守序列，它能夠催 化合成大腸桿菌自身所需的大部分磷脂類物質(zhì)，而不同于其它革蘭氏陰性菌 的磷脂類物質(zhì)合成酶，并不緊密連接于細胞膜結(jié)構(gòu)。對其進一步定位研究發(fā) 現(xiàn)，該酶是一種外膜蛋白，主要通過脂類底物和弱酸性磷脂物質(zhì)的電子傳遞 鏈與膜表面互相作用。
但是磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)在大腸桿菌中含量低(不到蛋白總含量的 0.1%)，不利于直接工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)；而枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)是一種較為理 想的異源蛋白表達系統(tǒng)，可以高效地表達具有生物活性的異源蛋白并將其分 泌到培養(yǎng)基中，且具有較高的生物安全性。本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)表 達磷脂酰絲氨酸合成酶基因，解決了出發(fā)菌株磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)表 達量低的問題，發(fā)酵后粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、中空纖維膜除鹽濃縮、離子交 換層析、凝膠層析等步驟可獲得高純度的磷脂酰絲氨酸合成酶，具有制備工 藝簡單、酶活力高等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備工藝簡單，適合 工業(yè)化生產(chǎn)且制備獲得的合成酶酶活力高的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方 法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，包括以下步驟 (l).制備粗發(fā)酵液
將工程菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，36 38t:振蕩培養(yǎng)10~14h，培養(yǎng)后產(chǎn) 物按3~7%的接種量轉(zhuǎn)接至相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 3h，然后加入10~20%的蔗糖水溶液，誘導26 30h，誘導后產(chǎn)物在3 5。C、 8000 r/min的條件下離 心15 25min，收集上清，制得粗發(fā)酵液；
(2) .鹽析
粗發(fā)酵液在3 5。C、 8000 r/min的條件下離心15 25min，收集上清，加 入硫酸銨至75%飽和度，3 5""C靜置1(M4h后，在3 5。C、 8000r/min的條件 下離心15 25min，傾去上清，沉淀溶于pH7.0、 10mM的Tris-HCl緩沖液中；
(3) .脫鹽
將第(2)步的產(chǎn)物采用截流分子量為10kDa 20kDa的中空纖維膜進行超 濾濃縮；
(4) . SP-Sepharose HP離子交換層析
采用pH7.0、 lOmM的Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，將脫鹽后的活性組 分用同樣的緩沖液溶解，8000r/min離心15 25min，取上清，上樣1 3mL后 先用該緩沖液洗脫未吸附的蛋白，再用含0 lmol/L NaCl的該緩沖液進行梯 度洗脫，收集活性組分；
(5) . Sephadex G-75凝膠層析
離子交換層析得到的活性組分，先用含1.0 % NaCl的Tris-HCl緩沖液溶 解，8000r/min離心15 25min，取上清，上樣1 3mL后用相同緩沖液進行洗 脫，收集的活性組分即為磷脂酰絲氨酸合成酶。
而且，所述的工程菌是保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏 編號為CGMCC 1.1395的枯草芽孢桿菌。
而且，所述的步驟(l)中的LB培養(yǎng)基含有濃度為30|_ig/mL的卡那霉素。
而且，所述的步驟(1)中的蔗糖水溶液的濃度為20%。
而且，所述的步驟(4)或(5)中的洗脫條件均為洗脫速度0.5mL/min，每 管收集2mL。
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點
1. 本發(fā)明對來源于大腸桿菌K,2的磷脂酰絲氨酸合成酶基因(p^)進行克 隆，與表達型質(zhì)粒pBES連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在枯草芽孢桿菌DB104中進行 活性表達，提高了磷脂酰絲氨酸合成酶的表達量，改變了出發(fā)菌株中該酶含 量低的現(xiàn)狀(不到蛋白總含量的0.1%)。
2. 本發(fā)明將工程菌發(fā)酵離心后粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、中空纖維膜除鹽濃 縮、SP-SepharoseHP離子交換層析、Sephadex G-75凝膠層析等步驟純化獲得 磷脂酰絲氨酸合成酶，由該方法制得的磷脂酰絲氨酸合成酶酶活力高、制備 工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明磷脂酰絲氨酸合成酶基因的PCR擴增電泳圖；圖2為本發(fā)明重組表達載體pBES-;ws的構(gòu)建示意圖3為本發(fā)明重組表達載體pBES-戸s的酶切驗證圖4為本發(fā)明重組表達載體pBES-; ^的PCR驗證圖5為本發(fā)明磷脂酰絲氨酸合成酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是 限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，包括磷脂酰絲氨酸合成酶工程菌 的構(gòu)建及其酶的表達、重組磷脂酰絲氨酸合成酶的分離純化兩部分內(nèi)容，下 面分別予以敘述
一.磷脂酰絲氨酸合成酶工程菌的構(gòu)建及其酶的表達
采用的工程菌是保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)， 保藏編號為CGMCC 1.1395的枯草芽孢桿菌，其構(gòu)建方法是
1. 大腸桿菌Esc/ m'c/H'a co// K12染色體DNA的提取
(1) .挑取大腸桿菌co// K,2的單菌落接種到5mL LB培養(yǎng)基 中，于37°C、 180r/min培養(yǎng)12h。
(2) .取lmL培養(yǎng)液于1.5mLEP管中，12000r/min離心IO分鐘，倒盡上 清，將細菌沉淀重懸于200jiL冰預冷的堿裂解液I中，劇烈振蕩。
(3) .加入50pL濃度為50mg/mL的溶菌酶，4'C下消化lh。
(4) .加入150pL濃度為2%的SDS溶液，反應10min至菌懸液呈現(xiàn)粘稠狀。
(5) .加入400jiL飽和苯酚:氯仿(l:l)，混合均勻，12000r/min離心10min， 將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈EP管中，棄去下層有機相及蛋白沉淀，重復l次。
(6) .加入400pL氯仿，混合均勻，12000r/min離心10min，將上清轉(zhuǎn)移 到另一干凈EP管中，去除痕量苯酚。
(7) .加入800^L的無水乙醇沉淀DNA， 12000r/min離心10min，棄去上 清，50(VL70。/o乙醇洗滌2次。
(8) .將EP管倒置于濾紙上，晾干后用TE緩沖液溶解，-20°0保存?zhèn)溆谩?br> 2. 引物設計及PCR擴增磷脂酰絲氨酸合成酶基因 (l).PCR擴增目的基因參照數(shù)據(jù)庫ExPASy上報道的磷脂酰絲氨酸合成
酶基因(^s)序列(序列號P23830)設計引物，引物由上海英俊公司合成。 上游引物P1:
5'-AACTGCAGAATTGTCAAATTTAAGCGTAATAAAC-3'(下劃線部分為 加入的PW I酶切位點) 下游引物P2:5'-CCCMSQHTTAC AGGATGCGGCTAATTAAT-3'(下劃線部分為加入 的歷'"dIII酶切位點)
以提取的大腸桿菌染色體DNA(10ng)為模板，PCR擴增條件為94°C， 預變性5min; 94。C變性lmin， 5(TC退火lmin40s, 72。C延伸lmin，反應30 個循環(huán)；最后72'C，延伸10min。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳(如 圖l)，將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收純化。
(2) .大腸-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒pBES的提取
① .取一環(huán)保存有pBES質(zhì)粒的^^7/^ 斜面接種，劃線分離于 LB固體培養(yǎng)基(含30pg/mLKan)平板上，37。C倒置培養(yǎng)12h。
② .挑取單菌落，接入到5mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、 180r/min培養(yǎng)12h。
③ .將1.5mL菌液轉(zhuǎn)入干凈的微量離心管中，12000r/m離心30s收集菌 體，棄上清。
④ .將沉淀重懸于IO(VL預冷的堿裂解液I中，混合均勻后添加10pL 50mg/mL的溶菌酶，37"C保溫30min。
⑤ .加入200pL堿裂解液II，蓋緊管口，輕輕搖勻，確保離心管的整個 內(nèi)表面菌與堿裂解液II接觸，將離心管放置冰上2min至液體清亮。
⑥ .加入150pL預冷的堿裂解液III，溫和轉(zhuǎn)動離心管，使堿裂解液III 在粘稠的細菌裂解液中混合均勻，冰浴5min。
⑦ .12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，力B 400|iL的Tris 飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)混合溶液，混合均勻后，12000r/min離心5min， 將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
⑧ .加入80(HiL的無水乙醇，混合均勻后，-20匸放置30min， 12000r/min 離心5min收集沉淀。
⑨ .加入lmL70。/。乙醇，洗滌沉淀2次，棄去殘液，空氣中干燥20min， 用20^L滅菌的去離子水溶解沉淀。
(3) .重組載體pBES-p^構(gòu)建將PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒pBES分別用 尸^1和///"(1111進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用Solution I于16°C 連接過夜得到重組質(zhì)粒pBES-p^，質(zhì)粒構(gòu)建如圖2。
3.重組載體的轉(zhuǎn)化及在宿主細菌中的表達
(l).重組載體的轉(zhuǎn)化及鑒定枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化在參照Spizizen方法的 基礎上進行了改進。取枯草芽孢桿菌DB104劃LA平板，37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12h。挑單菌落至3mLSPI培養(yǎng)基中，37'C、250r/min培養(yǎng)12h。次日取100pL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至5mL SPI培養(yǎng)基，37°C 、 250 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(OD600 約為0.9)，取0.2mL培養(yǎng)液至2mLSPII培養(yǎng)基中，37°C、 150r/min培養(yǎng)90min。分裝成0.5mL每管，各加入20pL重組質(zhì)粒，再于37。C、 100r/min震 蕩培養(yǎng)30 min，然后250r/min培養(yǎng)90min， 離心去處上清液，保留IOOjjL 上清液與菌液混合均勻后涂布篩選平板。
利用Spizizen法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌DB104中，通過卡那霉 素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，酶切和PCR驗證結(jié)果如圖3與圖4所示，表明重 組質(zhì)粒上已經(jīng)正確連接有目的基因。
(2) .重組菌的誘導表達——磷脂酰絲氨酸合成酶粗發(fā)酵液的制備接種重 組枯草桿菌DB104/pBES-; M和對照菌DB104/pBES于5 mL含30ng/mL卡那 霉素的LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)12h。按5%的接種量轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物于 30 mL含30pg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)2 h后加入20%蔗糖 溶液至終濃度為2%，誘導24 h。發(fā)酵液離心后，各取重組菌和對照菌上清 10pL，分別與10pL上樣緩沖液混合，沸水浴10min，離心取上清進行 SDS-PAGE(12。/。分離膠，5%濃縮膠)電泳，檢測蛋白表達情況如圖5，發(fā)酵液 上清可直接用于酶活力測定。
(3) .酶活檢測采用酶聯(lián)比色法進行活性檢測。
磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)催化水解L-a-卵磷脂生成膽堿，膽堿在膽堿氧 化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化酶的作用下與4-氨基氨替比 林和苯酚生成醌亞胺顯色物質(zhì)，在A-500nm下具有吸光值。
反應體系將220mg的L-a-卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6 mLlMNaOAc緩沖液(pH=8.0)、 39 mL的去離子水、0.272 mL 17.9%的乙醇 溶液(終濃為1%)的混合體系作為底物溶解液。將39mg4-氨基氨替比林、 80mg苯酚及8mg過氧化物酶溶于溶于5.5 mL的1 OOmM Tris HC1 (pH:8)緩 沖液中作為膽堿顯色劑。取2.4mL底物溶液、0.3 mL的500mM CaCl2溶液、 0.2mL的去離子水混合并置于35'C水浴。然后加入0.1 mL的酶液，混合均勻， 于35'C反應10min，沸水浴終止反應，待冷卻至室溫加入0.05mL2MTris HCl(pH-9)緩沖液，混合并離心后，上清用0.45pm微孔濾膜過濾，取濾液2 mL與O.lmL膽堿顯色劑、O.lmL膽堿氧化酶溶液室溫反應2.5h。在反應混合 物中加入2.0mL去離子水，離心得到澄清透亮的粉紅色溶液，最后于A500nm 檢測吸光值。
酶活定義pH=8.0、T=35°C^t，磷脂酰絲氨酸合成酶lh內(nèi)催化水解L-a-卵磷脂釋放1.(^mol的膽堿所需要的酶量。 二.重組磷脂酰絲氨酸合成酶的分離純化 1.制備粗發(fā)酵液
將工程菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)后產(chǎn)物按 5%的接種量轉(zhuǎn)接至相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后加入10%的蔗糖水溶液，
7誘導28h，誘導后產(chǎn)物在4。C、 8000 r/min的條件下離心20min，收集上清， 制得粗發(fā)酵液。
2. 鹽析
取28h發(fā)酵液，在4""C、 8000r/min的條件下離心20min，收集上清，加 入硫酸銨至75%飽和度，4"C靜置12h后，在4。C、 8000 r/min的條件下離心20 min，傾去上清，沉淀溶于pH7.0、 lOmM的Tris-HCl緩沖液中。
3. 脫鹽
將鹽析沉淀溶解于pH 7.0、 lOmM的Tris-HCl緩沖液后，用截流分子量為 10kDa 20kDa的中空纖維膜超濾，對樣品進行脫鹽濃縮，除鹽效果用BaCl2 溶液檢測，以濾出液滴入BaCl2溶液中無沉淀析出為終點。
4. SP-Sepharose HP (2.4cmx30cm)離子交換層析
采用pH7.0、 lOmM的Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，將脫鹽后的活性組 分用同樣的緩沖液溶解，8000 r/min離心20min，取上清，上樣2mL后先用 該緩沖液洗脫未吸附的蛋白，再用含O.lmol/L NaCl的該緩沖液進行梯度洗 脫，收集活性組分。
5. SephadexG-75(1.6cmx80cm)凝膠層析
離子交換層析得到的活性組分，先用含1.0y。NaC110mM的Tris-HCl緩沖 液溶解，8000 r/min離心20min，上樣2mL后用相同的緩沖液以0.5mL/min 的速度洗脫，每管收集2.0mL，收集活性組分，即為磷脂酰絲氨酸合成酶。SEQUENCE LISTING
〈110〉天津科技大學
<120>可高效異源表達磷脂酰絲氨酸合成酶的工程菌的構(gòu)建方法
〈130〉 20080703
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
〈211> 1356
<212> DNA
〈213〉磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)的DNA序列
〈400> 1
atgttgtcaa33ttt犯gCgtaataaacatcaacaacaccttgcccaactacccaagatt60
tctcaatcagttgatgatgtcgatttcttttacgctcccgccgacttccggg卿cgctg120
tagccagcgcga^gcsgcgcatttgcattgtcgccctgtatctcgaacag180
gatgacggtggC3犯ggC3ttctgaacgcgUgtatgaggCt犯犯ggC3ggacgatccg240
g認tggstgtgcgggtgctggtcg已ctggcatcgtgcac咖gtggacgcattggcgct300
gcggcatcta3C8Ct33CgCtgactggtactgccgcatggcgcaggaaaatccgggcgta360
gatgttccggtttatggcgttccaatc犯tactcgtgaagcccttggtgttctgcacttt420
aaaggctttatcatcgacgatagcgtactttatagcggtgccagcctgaacgatgtttac480
ctgcatcagctcgctacgaccgttatcatctgatccgtaaccgtaagatg540
tcagacattatgtttgaatgggttacacagatggccgcggcgttaatcgt600
ctggatgatgtt犯tcggcc3aaaagcccggaaatcaagaacgatattcgtctgttccgc660
c鄉(xiāng)agctgcgtgatgccgcttatca/tttcc鄉(xiāng)gcgatgCCg3C犯Cg6Ltcagctttct720
gtaacgccgctagtggggctgggg^stcgagtctgttgatttccatctt780
stgccttgtgccgagcagaei3Ct犯CC3tCtgtacgccatacttcaacctgccagcaatc840
cttgtgcgcaatattatccagttgctgcgcgaaggg犯犯tattgttggt900
gataaaaccgcgaatgacttctacattccgg犯g8tgaacctttcaagataattggcgca960
ttgccttatctctatgagatcaatttgcgtcgtttcctgagccgtttgcagtattacgtc1020
aatactgaccagctagtggttcggttatgga^gatgacgacaacacctatc3cctg33a1080
gggatgtggggtggatgttgatcaccggtacccgcgcgcc1140
tggcgtctgga<tCtgg￡L3￡L8cgccattttgatccacgatccgcaacttgagctggcgcca1200
C3gCg3g卿aag犯ctggagctgatccgcccatcgttaagcactatcgc1260
gatctgcaaagtattgccgattatccggtgaaggttcgtaaactcatccgccgttcgcgc1320cgtatccgca tcgaccgatt aattagccgc atcctg 1356
〈210〉 2 〈211〉 451 <212> PRT
〈213>磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)的氨基酸序列 〈400〉 2
Met Leu Ser Lys Phe Lys Arg Asn Lys His Gin Gin His Leu Ala Gin
1
Leu Pro
Pro Ala
Gin Arg 50
Lys Gly 65
Leu Asp
lie Gly
Ala Gin
Asn Thr 130 Asp Asp 145
His Gin
Arg Lys
Asn Gly
Pro Glu 210
Lys
Asp
35
lie
lie 20 Phe
5
Ser
Gin Ser Val
Arg Glu Thr Cys lie Val
lie Leu Asn
Val Arg
Ala
Glu 115 Arg
Ala 100 Asn
Val
85
Ala
Ala
70
Leu
Ala 55 Leu
Val
Leu
40
Leu
Tyr
Asp
Ser Asn Thr
Pro Gly Val
Glu Ala Leu
Ser Val Leu
His Asp
Met
Arg 195 lie
Ser 180 Gly
Lys 165 Asp
Tyr 150 Tyr
Gly 135 Ser
Asp 120 Val
Asp
25
Leu
Tyr
Glu
Trp
Asn 105 Val
10 Asp
Glu
Leu
Ala
His
90
Ala
Val
Lys
Glu
Lys
75
Arg
Asp Phe
lie
Gin
60
Arg
Ala
45
Asp
Gin
Ala Gin
Pro Val
Asp Trp Tyr Tyr
Leu His Phe
Gly Arg Tyr Asp lie Met Phe
Ala Ser
Val Asn Arg
Lys Asn Asp lie 215
Leu 200 Arg
Glu 185 Asp
Leu
Arg 170 Trp
Asp
Phe
Leu 155 Tyr
Lys 140 Asn
His
Gly 125 Gly
Asp
Leu
Val Thr Gin
Val Asn
Arg
Gin 220
Arg 205 Glu
Phe
30
Ser
Asp
Arg
Arg
Cys 110 Val
15 Tyr
Ala
Gly
Pro
Gly
95
Arg
Pro
Phe lie
Val Tyr
lie Arg 175 Asn lie 190 Pro
Leu
Lys Arg
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Lys
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80
Arg
Met
lie
lie
Leu 160 Asn
Met
Ser
AspAla Ala Tyr His 225
Thr Pro Leu Val
Phe
Gly 245 Pro
Gin Gly 230
Leu Gly
Asp Lys
Cys Ala Glu
Leu Asn Lys
Leu 280 lie
Glu
Phe His Leu Met 260
Tyr Phe Asn Leu Pro Ala lie 275
Arg Glu Gly Lys Lys Val Glu 290 295 Asp Phe Tyr lie Pro Glu Asp 305 310 Pro Tyr Leu Tyr Glu lie Asn Leu 325
Tyr Tyr Val Asn Thr Asp Gin Leu 340
Asp Asn Thr Tyr His Leu Lys 355
Leu lie Thr Gly Asn Asn 370
Glu Asn Ala lie 385
Arg Glu Lys Glu
Ala Asp Asn Asp Gin Leu 235
Ser Ser Leu
250 Gin Lys Leu 265
Val Arg Asn
Thr
lie
Asn lie
Ser Val 240 Thr lie 255
Thr Pro
Cys 270
Gin Leu Leu
lie Val Gly Asp 300 lie
lie 285
Lys Thr Ala Asn
lie
Pro Phe Lys 315
Arg Arg Phe Leu Ser 330
Val Val Arg Leu Trp 345
Met Trp Val
Leu
Leu 405 Leu
lie 390 Glu
Leu 375 His
Leu
Gly 360
Asn Pro Arg Ala
Asp
Asp 365 Arg
Gly
Arg
Lys 350 Lys
Leu
Ala Leu 320 Leu Gin 335
Asp Asp Trp Met Asp Leu
Asp lie
His Tyr Arg Asp Leu Gin Ser lie 420
Lys Leu lie Arg Arg Leu Arg Arg 435 440 Arg lie Leu 450
Pro Gin Leu 395
Arg Glu His
410 Ala Asp Tyr 425
lie Arg lie
Trp 380
Glu Leu Ala Pro Gin 400
Thr Thr lie Val Lys 415
Pro Val Lys Val 'Arg
Asp
Arg 445
Lys 430 Leu
lie Ser
權(quán)利要求
1、一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1).制備粗發(fā)酵液將工程菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，36～38℃振蕩培養(yǎng)10～14h，培養(yǎng)后產(chǎn)物按3～7％的接種量轉(zhuǎn)接至相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，誘導26～30h，誘導后產(chǎn)物在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，收集上清，制得粗發(fā)酵液；(2).鹽析粗發(fā)酵液在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，收集上清，加入硫酸銨至75％飽和度，3～5℃靜置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，傾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris-HCl緩沖液中；(3).脫鹽將第(2)步的產(chǎn)物采用截流分子量為10kDa～20kDa的中空纖維膜進行超濾濃縮；(4).SP-Sepharose HP離子交換層析采用pH 7.0、10mM的Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，將脫鹽后的活性組分用同樣的緩沖液溶解，8000r/min離心15～25min，取上清，上樣1～3mL后先用該緩沖液洗脫未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的該緩沖液進行梯度洗脫，收集活性組分；(5).Sephadex G-75凝膠層析離子交換層析得到的活性組分，先用含1.0％NaCl的Tris-HCl緩沖液溶解，8000r/min離心15～25min，取上清，上樣1～3mL后用相同緩沖液進行洗脫，收集的活性組分即為磷脂酰絲氨酸合成酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于 所述的工程菌是保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為 CGMCC 1395的枯草芽孢桿菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于 所述的步驟(l)中的LB培養(yǎng)基含有濃度為3(Vg/mL的卡那霉素。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于 所述的步驟(l)中的蔗糖水溶液的濃度為20%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于 所述的步驟(4)或(5)中的洗脫條件均為洗脫速度0.5mL/min，每管收集2mL。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其技術(shù)方案是將工程菌發(fā)酵離心后粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、中空纖維膜除鹽濃縮、SP-Sepharose HP離子交換層析、Sephadex G-75凝膠層析等步驟純化獲得磷脂酰絲氨酸合成酶。本發(fā)明制備磷脂酰絲氨酸合成酶具有制備工藝簡單、酶活力高等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)；并且由磷脂酰絲氨酸合成酶催化卵磷脂和絲氨酸合成的磷脂酰絲氨酸，在醫(yī)藥、食品及保健品領域具有良好的應用前景。
文檔編號C12N9/16GK101319203SQ20081005381
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者張業(yè)尼, 玉 李, 杜連祥, 王建玲, 王春霞, 路福平, 明 黎 申請人:天津科技大學