專利名稱：一種超臨界CO₂溶劑中的微生物誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物誘變方法，尤其是一種超臨界C02溶劑中的 微生物誘變方法。
(二)
背景技術(shù)：
微生物誘變是一項(xiàng)十分常用的工業(yè)生物技術(shù)，現(xiàn)行的誘變方法主要分 化學(xué)法與物理法兩類?；瘜W(xué)法就是以化學(xué)誘變劑，如硝基胍、硫酸二乙酯 等在水中對微生物進(jìn)行誘變，提高微生物的性能，特別是提高所需目的產(chǎn) 物的表達(dá)量。物理法誘變是以物理的手段，如紫外線照射、Y射線照射等 方法對微生物進(jìn)行誘變，從誘變后的微生物中篩選性能提高的菌林。目前， 對微生物誘變較有效的化學(xué)誘變劑，對人體均有致癌、致畸作用，安全性 非常差，使用后對環(huán)境生產(chǎn)嚴(yán)重危害。物理誘變的方法中，誘變效果較好 的方法，對人體也有致癌、致畸作用，誘變過程對環(huán)境有嚴(yán)重影響，而對 人體和環(huán)境較安全的方法，則對微生物誘變的效果較差。
因而，急需發(fā)明一種誘變效果較理想、而對人體和環(huán)境安全性高的微
生物i秀變方法。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具較理想的誘變效果而對人體無致癌致畸 致突變作用，對環(huán)境無影響，有良好安全性的微生物誘變方法。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種超臨界C02溶劑中的微生物誘變方法，所述微生物-秀變在超臨
界C02溶劑中進(jìn)行。本發(fā)明要點(diǎn)在于以超臨界C02為溶劑進(jìn)行誘變，所述臨界C02溶劑中，除了加入菌液外，還可添加各種化合物(如二曱亞 砜或肼、雙氧水或丙酮等)以促進(jìn)誘變，也可不額外添加任何物質(zhì)，直接
將菌液置于臨界co2溶劑中進(jìn)行誘變。
具體的，所述方法可包括將微生物菌種接種至適合所述微生物菌種 的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到細(xì)胞數(shù)約為1.0xl()S個(gè)的菌液； 將菌液移入高壓釜中，壓入C02至釜內(nèi)壓強(qiáng)為8 12MPa，控制溫度為 30 45°C,恒溫恒壓保持20 60分鐘后，緩慢釋放002,至釜內(nèi)壓力降至 0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，進(jìn)行篩選，選出成活菌抹即為誘變 的微生物菌林。
或者，所述方法包括將微生物菌種接種至適合所述微生物菌種的液 體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到細(xì)胞數(shù)約為1.0xl()S個(gè)的菌液；將菌 液移入高壓釜中，按5~30g/L菌液的添加量加入有機(jī)物二曱亞石風(fēng)或肼或丙 酮或30%體積分?jǐn)?shù)的雙氧水，壓入C02至釜內(nèi)壓強(qiáng)為8 12MPa,控制溫 度為30 45。C,恒溫恒壓保持20 60分鐘后，緩慢釋放032,至釜內(nèi)壓力 降至0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，進(jìn)行篩選，選出成活菌林即為 誘變的微生物菌抹。
本發(fā)明以超臨界co2為溶劑，在超臨界co2中以有機(jī)化合物與微生 物接觸，對微生物產(chǎn)生誘變。所選的有機(jī)物均對人體無致癌致畸致突變作
用，因而安全性非常高。而在超臨界C02介質(zhì)中，C02可將有機(jī)物帶入微
生物細(xì)胞中，有機(jī)化合物與微生物細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)作用，起到誘變微生 物的效果。
優(yōu)選的，所述^f敬生物菌種為黃桿菌屬(Hawkzcten'M附)的水生黃桿 菌(F/awZ^cfen'ww a《M油7e )，所述液體培養(yǎng)基按如下終濃度組成配制牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%, NaOH調(diào)pH為7.5,溶劑為水。 或者，所述微生物菌種為枯草芽孢桿菌(Bacz7/wwwZ^7/s)，所述液體
培養(yǎng)基按如下終濃度組成配制牛肉膏0.3%,蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，
葡萄糖1%, NaOH調(diào)pH為7.2,溶劑為水。
上述培養(yǎng)基組成以質(zhì)量體積百分比表示，某物質(zhì)濃度1%表示100mL
培養(yǎng)基中含有l(wèi)g該物質(zhì)。 具體的，所述方法如下
(1 )液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.5%，蛋白胨1%,氯化鈉0.5%, NaOH 調(diào)pH為7.5,溶劑為水，滅菌，4妄入黃桿菌，30°C、 200r/min 條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度為1.0xl()S個(gè)/mL,得菌液；
(2)將菌液轉(zhuǎn)入高壓釜中，按照5g/L菌液的添加量加入二曱亞砜， 壓入干水級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為8MPa，控制溫度為35。C,恒溫 恒壓保持30分鐘，然后緩慢排出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa 時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，篩選出活菌，得到誘變的黃桿菌 菌株。
或者，所述方法如下
(1) 液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%,葡萄糖 1%， NaOH調(diào)pH為7.2,溶劑為水，滅菌，接入枯草芽孢桿菌，30°C、 200r/min條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度為1.0 x 108個(gè)/mL,得菌液；
(2) 將菌液轉(zhuǎn)入高壓釜中，按照10g/L菌液的添加量加入二曱亞砜，壓 入干水級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為10MPa,控制溫度為35。C，恒溫恒壓 保持40分鐘，然后緩慢排出C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)， 將菌液壓入無菌容器中，篩選出活菌，得到誘變的枯草芽孢桿菌菌林。
超臨界C02是高安全性的綠色溶劑，用于誘變的有機(jī)物均對人體無 致癌致畸致突變作用，因而，本發(fā)明相對現(xiàn)有的微生物誘變技術(shù)，突出的 優(yōu)點(diǎn)是誘變試劑對人體安全性高，無致癌致畸致突變作用，對環(huán)境無影響， 而誘變效果比較理想。 具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍
并不僅限于此 實(shí)施例1:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，置250ml三角瓶中，滅菌。
將黃桿菌(黃桿菌屬(F/avo&cteWwm )的水生黃桿菌(Havo6(3C^fww a^ari/e),為現(xiàn)有已知菌種，本實(shí)施例中所用為從杭州市浙江工業(yè)大學(xué) 校園內(nèi)土壤中篩選得到，下同)，接種入三角瓶中，在30。C, 200轉(zhuǎn)/分鐘 搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0x1 ()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入已滅菌的1 升高壓釜中，加入0.25g的二曱亞石風(fēng)，壓入干冰級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為 8MPa,控制溫度為35°C,保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩慢放出C02,至高壓 釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角jf瓦中，篩選出活菌，與出 發(fā)菌抹在相同條件(種子液體培養(yǎng)基中，30 °C、 200r/min培養(yǎng)16h,制 成種子液，各取1 mL種子液轉(zhuǎn)接至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C 、200 r/min 培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基配制蛋白胨0.25g，酵母粉O.lg，牛肉膏0.15g， K2HP04 0.05g， NaCl 0.05g, MgS04'7H20 0.005g和裙t欖油0.5g，用NaOH 調(diào)pH7.5，去離子水補(bǔ)足至50mL)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高36.5%，表明誘變效果較好。 實(shí)施例2:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(HavoZ acten'wm agwa"/e)接種入三角瓶中，在30°C ， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1 .Ox 108個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.5g的二曱亞砜，壓入干冰級C02，至釜 內(nèi)壓強(qiáng)為8MPa,控制溫度為35°C,保持壓強(qiáng)達(dá)60分鐘，緩慢放出C02， 至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌， 與出發(fā)菌株在相同條件(種子液體培養(yǎng)基中，30 。C、 200r/min培養(yǎng)16h, 制成種子液，各取1 mL種子液轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 。C、 200 r/min培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基配制蛋白胨0.25g,酵母粉O.lg,牛肉膏0.15g， K2HP04 0.05g， NaCl 0.05g, MgS04'7H20 0.005g和橄欖油0.5g,用NaOH 調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高46.7%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例3:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5，去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將7JC生黃桿菌(F/m;oZj"cte"'Mw a《z^/z7e)接種入三角瓶中，在30。C ， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()8個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入1.0g的二甲亞砜，壓入干水級C02,至釜 內(nèi)壓強(qiáng)為lOMPa,控制溫度為40°C,保持壓強(qiáng)達(dá)60分鐘，緩慢放出C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角jf瓦中，篩選出活菌， 與出發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指 標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高38.6%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例4:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/avo6acten'ww "^Wz7e)接種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.5g的二曱亞砜，壓入干冰級C02,至釜 內(nèi)壓強(qiáng)為12MPa,控制溫度為30°C,保持壓強(qiáng)達(dá)20分鐘，緩慢放出C02， 至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌， 與出發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指 標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高43.2%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例5:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角弁瓦中。
將水生黃桿菌(Hm^6acfen'ww"^^"/e)接種入三角瓶中，在30。C， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入l,25g的二曱亞砜，壓入干冰級C02,至釜 內(nèi)壓強(qiáng)為10MPa，控制溫度為45°C,保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩慢放出C02， 至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa日于，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌， 與出發(fā)菌林在相同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高32.3%,表明誘變效果較好。 實(shí)施例6:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(HavoZwcteWMw ^waW/e)接種入三角并瓦中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.25g的肼，壓入干冰級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為8MPa,控制溫度為35。C,保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩慢放出C02,至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高58.3%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例7:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g，用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角弁瓦中。
將水生黃桿菌(F/aw 6a"eWww )接種入三角瓶中，在30°C,
200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.5g的肼，壓入干水級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為10MPa,控制溫度為40。C,保持壓強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出C02,至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角并瓦中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌株在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高66.7%,表明誘變效果較好。
10實(shí)施例8:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(FA2vo&cten'ww <a^a"7e)接種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.75g的肼，壓入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為12MPa,控制溫度為3(TC,保持壓強(qiáng)達(dá)60分鐘，緩慢放出C02，至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌株在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高51.4%，表明誘變效果較好。
實(shí)施例9:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/awM"er/Mm a《認(rèn)"/e) 4妻種入三角瓶中，在30°C ， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入1.0g的肼，壓入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為9MPa,控制溫度為45。C,保持壓強(qiáng)達(dá)50分鐘，緩慢放出C02,至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角^L中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高42.0%，表明誘變效果較好。
實(shí)施例10:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，用NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/avo^c&Www ^wa"/e )接種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入1.5g的肼，壓入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為12MPa,控制溫度為40。C,保持壓強(qiáng)達(dá)20分鐘，緩慢放出C02，至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角并瓦中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌株在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高38.5%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例11:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角弁瓦中。
將水生黃桿菌(F/avo6acten'ww a wa"/e)接種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0x1 ()8個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，壓入干冰級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為8MPa,控制溫 度為3(TC，保持壓強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa 時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與出發(fā)菌抹在相同條件(同 實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活 力提高28.6%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例12:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/avc^acfen'w附"g冊"7e )接種入三角瓶中，在30°C,200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，壓入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為10MPa，控制 溫度為35°C，保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩慢放出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為 0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與出發(fā)菌林在相 同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃 桿菌產(chǎn)酶活力提高27.5%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例13:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g，用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/avo6"c^7'ww "《wa^7e)接種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入0.5g 30%體積分?jǐn)?shù)的雙氧水，壓入干水級 C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為9MPa,控制溫度為35°C，保持壓強(qiáng)達(dá)50分鐘，緩 慢放出C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中， 篩選出活菌，與出發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的 活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高38.3%,表明誘變效果較 好。
實(shí)施例14:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/m^Mcfer/Mm "《wa"/e )接種入三角瓶中，在3CTC ， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入已滅菌的1升高壓釜中，加入l.Og 30%體積分^:的雙氧水，壓入干冰級 C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為12MPa,控制溫度為30。C，保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩 慢放出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中， 篩選出活菌，與出發(fā)菌林在相同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的 活力為考察指標(biāo)，誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高35.8%,表明誘變效果較 好。
實(shí)施例15:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g,蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5，去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將7jC生黃桿菌(F/avo6""e〃'ww )接種入三角瓶中，在30°C,
200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入1.0g丙酮，壓入干冰級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng) 為9MPa,控制溫度為35。C,保持壓強(qiáng)達(dá)60分鐘，緩慢放出C02,至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌株在相同條件(同實(shí)施例l)發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高33.7%，表明誘變效果較好。
實(shí)施例16:
種子液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.25g，蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g,用 NaOH調(diào)pH7.5，去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml三角瓶中。
將水生黃桿菌(F/avoZ^cten'wm a《wa"/e)接種入三角瓶中，在30°C ， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入 已滅菌的l升高壓釜中，加入2.0g丙酮，壓入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為llMPa，控制溫度為30。C,保持壓強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出C02，至高 壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與 出發(fā)菌林在相同條件(同實(shí)施例1 )發(fā)酵，以產(chǎn)脂肪酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的黃桿菌產(chǎn)酶活力提高37.2%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例17:
種子液體培養(yǎng)基配制酵母膏0.15g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，葡 萄糖0,25g,用NaOH調(diào)pH7.2，去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml 三角瓶中。
將枯草芽孢桿菌(Bac/〃M )(浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏
菌M妻種入三角瓶中，在30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0x108 個(gè)/ml。將50ml培養(yǎng)液移入已滅菌的1升高壓釜中，加入0.5g的二甲亞 砜，壓入干水級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為10MPa,控制溫度為35。C,保持壓 強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓 入無菌的三角瓶中，篩選出活菌，與出發(fā)菌抹在相同條件(種子液體培養(yǎng) 基中，30 °C、 200 r/min培養(yǎng)16 h,制成種子液，各取lmL種子液轉(zhuǎn)接 至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 。C、 200 r/min培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基配制蛋白 胨0.25g,酵母粉O.lg,牛肉膏0.15g, K2HP04 0.05g, NaCl 0.05g, MgS(V7H2O0.005g和葡萄糖0.5g，用NaOH調(diào)pH7.2，去離子水補(bǔ)足至 50mL)發(fā)酵，以產(chǎn)淀粉酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的枯草芽孢桿菌產(chǎn) 酶活力提高47.6%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例18:
種子液體培養(yǎng)基配制酵母膏0.15g，蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g，葡萄糖0.25g，用NaOH調(diào)pH7.2,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml 三角并瓦中。
將枯草芽孢桿菌(浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌)接種入三角瓶 中，在30。C， 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml 培養(yǎng)液移入已滅菌的1升高壓釜中，加入0.5g的肼，壓入干冰級C02, 至釜內(nèi)壓強(qiáng)為9MPa，控制溫度為40。C，保持壓強(qiáng)達(dá)30分鐘，緩慢放出 C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角jf瓦中，篩選 出活菌，與出發(fā)菌株在相同條件(同實(shí)施例17)發(fā)酵，以產(chǎn)淀粉酶的活 力為考察指標(biāo)，誘變后的枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活力提高53.7%,表明誘變效 果較好。
實(shí)施例19:
種子液體培養(yǎng)基配制酵母膏0.15g,蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g,葡 萄糖0.25g，用NaOH調(diào)pH7.2，去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml 三角瓶中。
將枯草芽孢桿菌(浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌)接種入三角瓶 中，在30。C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml 培養(yǎng)液移入已滅菌的1升高壓釜中，壓入干冰級co2,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為 lOMPa,控制溫度為35。C,保持壓強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出C02，至高壓 釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角弁瓦中，篩選出活菌，與出 發(fā)菌抹在相同條件(同實(shí)施例17)發(fā)酵，以產(chǎn)淀粉酶的活力為考察指標(biāo)， 誘變后的枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活力提高29.5%,表明誘變效果較好。
實(shí)施例20:種子液體培養(yǎng)基配制酵母膏0.15g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，葡 萄糖0.25g，用NaOH調(diào)pH7.2,去離子水補(bǔ)足至50mL，滅菌，置250ml 三角瓶中。
將枯草芽孢桿菌(浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌)接種入三角瓶 中，在30。C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml 培養(yǎng)液移入已滅菌的l升高壓釜中，加入0.5g30。/。體積分?jǐn)?shù)的雙氧水，壓 入干冰級C02,至釜內(nèi)壓強(qiáng)為9MPa，控制溫度為35°C,保持壓強(qiáng)達(dá)60 分鐘，緩慢放出C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的 三角瓶中，篩選出活菌，與出發(fā)菌林在相同條件(同實(shí)施例17)發(fā)酵， 以產(chǎn)淀粉酶的活力為考察指標(biāo)，誘變后的枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活力提高 42.4%，表明誘變效果較好。
實(shí)施例21:
種子液體培養(yǎng)基配制:酵母膏0.15g，蛋白胨0.5g,氯化鈉0.25g，葡 萄糖0.25g，用NaOH調(diào)pH7.2,去離子水補(bǔ)足至50mL,滅菌，置250ml 三角瓶中。
將枯草芽孢桿菌(浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌)接種入三角瓶 中，在30。C, 200轉(zhuǎn)/分鐘搖床上培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0xl()S個(gè)/ml。將50ml 培養(yǎng)液移入已滅菌的1升高壓釜中，加入1.0g的丙酮，壓入干水級C02, 至釜內(nèi)壓強(qiáng)為12MPa,控制溫度為30°C，保持壓強(qiáng)達(dá)40分鐘，緩慢放出 C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌的三角瓶中，篩選 出活菌，與出發(fā)菌林在相同條件(同實(shí)施例17)發(fā)酵，以產(chǎn)淀粉酶的活 力為考察指標(biāo)，誘變后的枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活力提高35.7%,表明誘變效 果較好。
權(quán)利要求
1.一種超臨界CO2溶劑中的微生物誘變方法，其特征在于所述微生物誘變在超臨界CO2中進(jìn)行。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括將微生物菌種接種至適合 所述微生物菌種的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到細(xì)胞數(shù)約為 1.0xl()S個(gè)的菌液；將菌液移入高壓釜中，壓入C02至釜內(nèi)壓強(qiáng)為 8 12MPa，控制溫度為30 45°C,恒溫恒壓保持20 60分鐘后，緩慢釋 放C02,至釜內(nèi)壓力降至0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，進(jìn)行篩 選，選出成活菌林即為誘變的微生物菌林。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括將微生物菌種接種至適合 所述微生物菌種的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到細(xì)胞數(shù)約為 1.0xl()S個(gè)的菌液；將菌液移入高壓爸中，按5~30g/L菌液的添加量加 入有機(jī)物二曱亞砜或肼或丙酮或30%體積分?jǐn)?shù)的雙氧水，壓入C02至 釜內(nèi)壓強(qiáng)為8 12MPa，控制溫度為30 45°C,恒溫恒壓保持20 60分 鐘后，緩慢釋放C02,至釜內(nèi)壓力降至0.3MPa時(shí)，將菌液壓入無菌容 器中，進(jìn)行篩選，選出成活菌林即為誘變的微生物菌林。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述微生物菌種為水生 黃桿菌(F/avoZ^"en'ww a《wo^7e)，所述液體培養(yǎng)基4安如下終濃度組成 配制牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%， NaOH調(diào)pH為7.5, 溶劑為水。
5. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述微生物菌種為枯草 芽孢桿菌(5a"7/wwMto)，所述液體培養(yǎng)基按如下終濃度組成配制酵母膏0.3%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,葡萄糖1%, NaOH調(diào)pH為 7.2,溶劑為水。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )液體培養(yǎng)基配制牛肉膏0.5%，蛋白胨1%,氯化鈉0.5%, NaOH 調(diào)pH為7.5,溶劑為水，滅菌，4妄入水生黃桿菌，30°C、 200r/min 條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度為1.0xl()S個(gè)/mL,得菌液；(2)將菌液轉(zhuǎn)入高壓釜中，按照5g/L菌液的添加量加入二曱亞砜，壓 入干冰級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為8MPa,控制溫度為35。C，恒溫恒 壓保持30分鐘，然后緩慢釋^:C02,至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa 時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，篩選出活菌，得到誘變的水生黃桿 菌菌才朱。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 液體培養(yǎng)基配制酵母膏0.3%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%，葡萄 糖1%, NaOH調(diào)pH為7.2,溶劑為水，滅菌，接入枯草芽孢桿 菌，30°C、 200r/min條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度為1.0 x108 個(gè)/mL,得菌液；(2) 將菌液轉(zhuǎn)入高壓釜中，按照10g/L菌液的添加量加入二曱亞砜， 壓入干水級C02，至釜內(nèi)壓強(qiáng)為10MPa,控制溫度為35。C,恒溫 恒壓保持40分鐘，然后緩慢釋方欠C02，至高壓釜內(nèi)壓強(qiáng)為0.3MPa 時(shí)，將菌液壓入無菌容器中，篩選出活菌，得到誘變的枯草芽孢 桿菌菌才朱。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超臨界CO₂溶劑中的微生物誘變方法、本發(fā)明以超臨界CO₂為溶劑，在超臨界CO₂中以有機(jī)化合物與微生物接觸，對微生物產(chǎn)生誘變。所選的有機(jī)物均對人體無致癌致畸致突變作用，因而安全性非常高。而在超臨界CO₂介質(zhì)中，CO₂可將有機(jī)物帶入微生物細(xì)胞中，有機(jī)化合物與微生物細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)作用，起到誘變微生物的效果。超臨界CO₂是高安全性的綠色溶劑，用于誘變的有機(jī)物均對人體無致癌致畸致突變作用，因而，本發(fā)明相對現(xiàn)有的微生物誘變技術(shù)，突出的優(yōu)點(diǎn)是誘變試劑對人體安全性高，無致癌致畸致突變作用，對環(huán)境無影響，而誘變效果比較理想。
文檔編號C12R1/125GK101314771SQ20081006310
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日
發(fā)明者張巧艷, 錢俊青 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)