專利名稱：甲3型流感病毒的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種甲3型流感病毒的環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP )才企測i式劑盒及4企測方法。
(二)
背景技術：
流行性感冒(流感)的臨床癥狀易與普通感冒相混淆，最終必須通過 實驗室的方法加以確診。在實驗室診斷手段中，最直接最經(jīng)典的是采集患 者的含漱液，接種雞胚或狗腎傳代細胞(MDCK)進行病毒分離定型來進 行確定。但采用這種方法常常需要花費較長的時間，難以適應暴發(fā)疫情快 速診斷的需要。
1985年聚合酶4連反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 4支術的i延生 極大的推動了核酸檢測技術甚至整個分子生物學技術的發(fā)展，并日漸成為 核酸;險測技術中的重要手段。隨后又不斷的出現(xiàn)了諸如逆轉錄酶-聚合酶 鏈反應(Reverse Transcriptase-PCR, RT-PCR)、實時焚光定量聚合酶鏈反 應(Real Time Fluorescent Quantified PCR )等一系列的核酸擴增檢測技術， 可實現(xiàn)對核酸樣品的擴增及定性定量檢測。近年來，國內(nèi)外采用RT-PCR 方法對流感病毒核酸進行檢測，較經(jīng)典的病毒分離方法更為敏感快速。熒 光定量PCR技術，利用了 PCR技術對DNA的高效擴增，探針技術的高 特異性與光譜技術的敏感性以及定量的優(yōu)點，在實驗工作中得到了很好的 應用。但由于熒光定量PCR儀器價格昂貴，使該技術在基層推廣使用上 受到很大的限制。
環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP )技
術是近年來發(fā)展出的一種可替代PCR的敏感、特異、方便快捷的核酸擴 增技術。其原理是釆用能特異識別耙序列上6個位點的4條引物及一種 具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在65。C左右，不到lh的時間里進行核 酸的擴增，其擴增效率可達到109個~ 101()個拷貝數(shù)量級。在擴增反應中 產(chǎn)生莖-環(huán)結構，保證引物與其雜交啟動新一輪核酸合成，反應副產(chǎn)物焦 磷酸鎂沉淀可用肉眼觀測到，以判斷是否發(fā)生擴增。該擴增法具有簡單、 快速、準確、廉價、易檢測等特點。
LAMP技術與PCR技術有著相同的靈敏度，但其技術平臺卻比PCR 更優(yōu)越。由于其反應是多種引物共同啟動，提高了反應結果的特異性；由 于實行的是等溫擴增，使得反應在恒溫水浴箱中便可完成，不僅節(jié)約了儀 器成本，而且使核酸檢測操作方法更簡便，適用于大量樣品同時檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便、經(jīng)濟的曱3型流感病毒的環(huán)介 導等溫檢測試劑盒及檢測方法。 本發(fā)明采用的技術方案是
一種曱3型流感病毒環(huán)介導等溫擴增檢測檢測試劑盒，所述的試劑盒 包括如下特異性引物序列
F3: GCAGAATAAGCATCTATTGGA; B3: GCCCCATATGTGATCCTG;
FIP: CGTATTTTGAAGTAACCCCKAGGAGGGAGACATACTT
TTGATTAACAGC;
BIP:
AAGCTCAATAATGAGRTCAGATGCAGTCATTGGGAATG
CTTCCAT;
LB: GCAATTCTGAATGCATCACTCCA 。
此外本試劑盒中還包括dNTP， MgS04， AMV逆轉錄酶，Bst-DNA polymerase, Bst-DNA polymerase Buffer等，這些組分對于本領域技術人 員來說屬于公知常識，可根據(jù)需要選用。
本發(fā)明還涉及甲3型流感病毒的環(huán)介導等溫4企測方法，所述方法包
括
(1 )根據(jù)甲3型流感病毒血凝素基因設計特異性引物序列如下 F3: GCAGAATAAGCATCTATTGGA; B3: GCCCCATATGTGATCCTG;
FIP: CGTATTTTGAAGTAACCCCKAGGAGGGAGACATACTTT TGATTAACAGC;
BIP :
AAGCTCAATAATGAGRTCAGATGCAGTCATTGGGAATG
CTTCCAT;
LB: GC AATTCTGAATGC ATC ACTCC A; (2)提取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為模板、步驟(1)中序
列F3 、 B3 、 FIP、 BIP和LB為引物進4亍LAMP反應； (3 ) LAMP反應結束后，進行分析，若LAMP反應結果為陽性，則 待測樣品含有曱3型流感病毒。 本發(fā)明關鍵在于引物的設計選擇，LAMP反應體系組成、反應條 件選擇和反應結果判斷均可按本領域常規(guī)方法進行，本發(fā)明LAMP擴 增反應體系要求F3、 B3、 FIP和BIP4條引物完全匹配才能進行擴增， 因此反應體系中的其它外源污染核酸或引物對反應的干擾很小。通過
設計與2條引物啞鈴狀結構5，末端的單鏈莖環(huán)區(qū)域互補的環(huán)引物， 可提高LAMP方法中DNA合成的開始位點的數(shù)量，使得LAMP反應 可在30分鐘內(nèi)完成，從而更加提高了反應的速度。 優(yōu)選的，本發(fā)明LAMP反應體系終濃度組成如下F3, 0.2/amol/L; B3， 0.2|amol/L; BIP, 1.6jumol/L; FIP， 1.6nmol/L; LB, 0.8鋒ol/L; dNTP, 1.4 mM; MgS04, 6 mM; AMV逆轉錄酶，0.4U/ju L; Bst-DNA polymerase, 0.32U/juL; Bst畫DNApolymerase Buffer,終濃度為1 x ;樣 品RNA;溶劑為DEPC處理水。所述Bst-DNA polymerase Buffer終濃度 為1 x ，是指緩沖液各組分在反應體系中的終濃度與1 x Bst-DNA polymerase Buffer中各組分的濃度相同。通常采用反應體系1/10體積的 10 x Bst-DNA polymerase Buffer。 LAMP反應體系中樣品RNA用量為常 規(guī)用量，本領域技術人員可以根據(jù)實際需要確定，通常RNA樣品在LAMP 反應體系中應至少包含10拷貝。
優(yōu)選的，所述LAMP反應條件為60 65。C反應30 60min，然后80°C 2 min終止反應。
所述的對LAMP反應結果進行分析判定的方法包括1):肉眼直接 觀察反應濁度，2): DNA電泳，3):實時濁度檢測；在加入熒光染料后 還可以通過4):肉眼觀察反應液顏色變化，5):紫外照射下檢測熒光，6): 實時;f企測熒光等上述6種方法中的一種或多種。其中
1 ):肉眼直接觀察反應濁度在核酸大量合成時，乂人dNTP析出的焦 磷酸根離子與反應液中的Mg"的結合，產(chǎn)生焦磷酸4^沉淀，且沉淀的量 隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。定性觀察在反應結束后，實驗結果可通過肉
眼觀察直接判讀。
2) : DNA電泳取少量反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射 下，EB染色的凝膠中出現(xiàn)典型的梯狀條帶，則說明該管擴增反應陽性。
3) :實時濁度檢測通過濁度儀及配套軟件，實時反映混合液中濁度 的變化并進行圖形處理，判定結果。
4 ): 5 )和6 )均是根據(jù)在在加入熒光染料SYBR Green I后如果含有 擴增產(chǎn)物，反應混合液變?yōu)榫G色，否則保持SYBR Green I的橙色不變的 現(xiàn)象進行的反應結果判定；實時熒光檢測是通過熒光檢測儀器檢測SYBR Greenl發(fā)出的熒光。
優(yōu)選的，所述結果判斷方法如下LAMP反應結束后，取LAMP反
應液進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下，EB染色的凝膠中出現(xiàn)梯形
條帶，則LAMP擴增結果為陽性。
所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進行，如采用Qiagen RNeasy Mini
Kit或其它試劑盒所提取。
本發(fā)明中，所述樣品RNA的提取步驟可為
1 )離心管中加入500 ju 1 RLT和6 |i L (3隱巰基乙醇；
2)向上述溶液中加入200 juL樣本(包括含漱液、咽拭子、呼吸道吸出 物等)，振蕩混勻1 min;
3 )加入等體積的70%乙醇混勻；
4 )取700 |a 1混合液加入收集管內(nèi)的離心柱中，12000rpm離心15 s;
5) 重復步驟4一次；
6) 力口入700 julRWl緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15s; 7 )加入500 |i 1 RPE緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15 s;
8
8 )重復步驟7 —次；
9) 倒盡收集管中液體，空離一次；
10) 加入適量無RNA酶的水溶解RNA并離心收集，置于-70。C保存。 用于LAMP反應的特異性分析的毒抹包括流感病毒Hl/北京/53/97,
B/深圳/12/97與B/北京/184/9;麻滲病毒林滬191，風滲病毒GOS林，流 行性腮腺炎病毒Jeny-Ly皿株，呼吸道合胞病毒Long抹；禽流感病毒 H5N1 Zhejiang/16/2006，上述病毒提取核酸后利用設計的H3 LAMP引物 進行反應；經(jīng)試驗驗證，采用本發(fā)明檢測方法，只有H3流感病毒抹擴增 反應呈陽性，上述病毒株均呈陰性，說明本發(fā)明方法具有良好的特異性。
LAMP技術以其簡便、經(jīng)濟、快速、靈敏和特異的特點，結果判斷 方法靈活簡便，適合于在臨床或實驗室診斷中的應用，本發(fā)明提供的 LAMP甲3型流感病毒檢測技術具有廣闊的應用前景。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
1) 簡便的反應體系在恒溫條件下實現(xiàn)了等溫擴增環(huán)節(jié)與定量^^測 環(huán)節(jié)的交互進行,在核酸等溫擴增的同時，實現(xiàn)了濁度或熒光信號的積累， 整個反應在一個體系中完成；
2) 等溫高效的擴增體系本發(fā)明是基于具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶進行的等溫擴增技術，在提供相應的反應成分的條件下，實現(xiàn)了待 檢耙基因的指數(shù)增力口。在提高擴增效率的同時降低了檢測儀器的成本，而 且減少了反應中不必要的非特異性擴增產(chǎn)物污染；
3) 檢測速度快；本發(fā)明的核酸檢測技術，將擴增與檢測兩個反應過 程相融合在一個反應體系中完成，整個過程沒有升降溫循環(huán)，節(jié)省了時間； 同時通過設計與引物啞鈴結構區(qū)域互補的滾環(huán)引物，可大大提高反應的速 度；4 )檢測靈敏度高本發(fā)明的核酸才企測技術，可在0.5 1小時的時間 內(nèi)實現(xiàn)對樣本的106 109倍的擴增，最小可對10 ng的核酸分子進^f定量 檢測，提高了檢測的靈敏度；
5)檢測設備筒單相對于其它的核酸定量檢測技術，本發(fā)明不需要 特定的反應和檢測儀器，只要普通的恒溫水浴箱(如需實時檢測還需要濁 度計或熒光檢測儀)即可進行，便于應用和推廣。
(四)


圖1為H3 LAMP反應電泳圖譜；圖中M: DL2000 DNA ladder; 1為陰 性對照；2 7分別為103、 102、 IO1、 10°、 10"、 10-2 TCID5。的病毒液提取 的核酸為模板進行LAMP反應的產(chǎn)物電泳圖譜；
圖2為熒光定時定量LAMP圖譜；其中A、 B、 C、 D、 E分別表示反應 中包含102、 IO1、 10°、 10-、 10—2 TCID50的病毒液提取的核酸為模板進 行熒光實時定量LAMP反應的圖譜。
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一 步描述，但本發(fā)明的保護范圍 并不僅限于此
實施例1: LAMP方法檢測曱3型流感病毒基因組RNA
曱3型流感病毒選用流感病毒A3/滬/1/98病毒抹，來源于國家流感 中心。通過流感病毒對細胞感染情況的觀察、計算半數(shù)細胞感染劑量 (TCIDso)的方法標定濃度，并通過梯度稀釋的方法得到不同濃度的病毒液 (IO3、 102、 IO1、 10。、 10"、 10-2 TCID5。)，對各濃度病毒液按下述步驟 進行RNA提取
1.曱3型流感病毒基因組RNA提取
1 )離心管中加入500jiL RLT和6jiL |3-巰基乙醇；
2) 向上述;容液中加入200 "L病毒液，l展蕩混勻lmin;
3) 加入等體積的70% (v/v)乙醇混勻；
4 )取700 ju L混合液加入收集管內(nèi)的離心柱中，12000rpm離心15 s;
5) 重復步驟4一次；
6) 力口入700 iuL RW1緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15 s;
7) 加入500 juL RPE緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15s; 8 )重復步驟7 —次；
9) 倒盡收集管中液體，空離一次；
10) 加入適量無RNA酶的水溶解RNA并離心收集，置于-70。C保存。 2. LAMP反應和凝膠電泳
LAMP反應體系組成(引物由上海英駿生物技術公司合成) F3， 5pmol; B3, 5 pmol; BIP， 40 pmol; FIP， 40 pmol; LB， 20pmol; dNTP， 1.4 mM; MgS04, 6 mM; AMV逆轉錄酶(Promega )， 10U; Bst-DNA polymerase (NEB ), 8U; 10 x Bst-DNA polymerase Buffer, 2.5 juL;病毒 RNA7.5jiL; DEPC處理水補足至25 u L,混勻；
反應混合液在63 。C反應50min，然后80 °C 2min以終止反應，各反應 取5 iaL進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果,見圖1。 結果說明LAMP方法能敏感地4企測甲3型流感病毒RNA。
實施例2:實時熒光LAMP方法檢測甲3型流感病毒基因組RNA 以實施例1不同濃度病毒液提取得到的RNA按下述方法步驟進行LAMP 反應
LAMP反應體系組成(引物由上海英駿生物技術公司合成)F3, 5pmol; B3， 5 pmol; BIP, 40 pmol; HP， 40 pmol; LB, 20 pmol; dNTP, 1.4 mM; MgS04， 6 mM; AMV逆轉錄酶(Promega), 10U; Bst-DNA polymerase (NEB ), 8U; 10 x Bst畫DNApolymerase Buffer, 2.5jaL; 實施 例1得到的病毒RNA 7.5 u L; SYBR Green I 1 ja L, DEPC處理水補足至 25 uL,混勻。
LAMP反應條件MJOpticon2儀器實時檢測熒光，反應條件為63 °C 45 s，讀板；共進行40個循環(huán)。
圖2中A、 B、 C、 D、 E分別表示反應中包含102、 101、 10。、 10"、 10-2 TCID5Q的病毒液提取的核酸為模板進行熒光實時定量LAMP反應的圖 語。
反應結果說明實時熒光LAMP方法能敏感地檢測曱3型流感病毒RNA。
實施例3:待測樣品(病人含漱液)LAMP反應4企測
按照實施例1提取曱3型流感病人含漱液樣本的RNA方法和反應體 系進行LAMP方法檢測，反應混合液在63 °C反應50 min,然后80°C 2 min 以終止反應，各反應取5 )aL進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠可見典型梯 狀擴增條帶，說明LAMP方法能用于檢測臨床病例樣本中包含的曱3型 流感病毒。序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110>浙江省疾病預防控制中心
<120〉甲3型流感病毒的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
<130〉
<160〉 5
〈170〉 Patentln version 3. 4
<210〉 1
<211> 21
〈212> 腿
<213> Unk,n
<220〉
〈223〉 人工序列 〈400〉 1
gcagaataag catctattgg a 21
<210〉 2
<211> 18
<212> DNA
〈213> Unknown
〈220>
<223〉 人工序列
<400> 2
gccccatatg tgatcctg 18
〈210〉 3 <211> 49 <212> DNA
<220〉
<223〉人工序列 <400> 3
cgtattttga agtaacccck aggagggaga catacttttg attaacagc 49
<210〉 4
〈211> 45
<212〉 腿
<213〉 Unknown
〈220〉
<223〉 人工序列
〈400> 4
aagctcaata atgagrtcag atgcagtcat tgggaatgct tccat 45
<210〉 5
<211〉 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
〈400> 5
gcaattctga atgcatcact cca 2權利要求
1. 一種甲3型流感病毒環(huán)介導等溫擴增檢測檢測試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒包括如下特異性引物序列:F3:GCAGAATAAGCATCTATTGGA；B3:GCCCCATATGTGATCCTG；FIP:CGTATTTTGAAGTAACCCCKAGGAGGGAGACATACTTTTGATTAACAGC；BIP:AAGCTCAATAATGAGRTCAGATGCAGTCATTGGGAATGCTTCCAT；LB:GCAATTCTGAATGCATCACTCCA。
2. —種曱3型流感病毒的環(huán)介導等溫擴增4企測方法，所述方法包括 (1 )根據(jù)甲3型流感病毒血凝素基因設計特異性引物序列如下F3: GCAGAATAAGC ATCTATTGGA; B3: GCCCCATATGTGATCCTG;FIP: CGTATTTTGAAGTAACCCCKAGGAGGGAGACATACTTT TGATTAACAGC;BIP: AAGCTC AATAATGAGRTC AGATGC AGTC ATTGGGAATG CTTCCAT;LB: GCAATTCTGAATGCATCACTCCA;(2) 提取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為模板、步驟(1 )中序 列F3 、 B3 、 FIP、 BIP和LB為引物進4亍LAMP反應；(3) LAMP反應結束后，進行分析，若LAMP反應結果為陽性，則待測樣品含有甲3型流感病毒。
3. 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述LAMP反應體系終濃 度組成如下F3， 0.2|amol/L; B3, 0.2nmol/L; BIP, 1.6ymol/L; FIP， 1.6"mol/L; LB， 0.8jumol/L; dNTP, 1.4 mM; MgS04, 6 mM; AMV逆轉錄酶，0.4U/|aL; Bst-DNApolymerase, 0.32U/]uL; Bst-DNA polymerase Buffer,終濃度為1 x ;樣品RNA;溶劑為去 離子水。
4. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述LAMP反應條件 為60 65。C反應30 60min,然后80°C2 min終止反應。
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于LAMP反應結束后，取 LAMP反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下，若EB染色 的凝膠中出現(xiàn)梯形條帶，則LAMP擴增結果為陽性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甲3型流感病毒的環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測方法。所述方法為根據(jù)甲3型流感病毒血凝素基因設計特異性引物序列，提取待測樣品RNA為模板，進行LAMP反應；對LAMP反應結果進行分析，若LAMP擴增結果為陽性，則待測樣品含有甲3型流感病毒。本發(fā)明提供的LAMP甲3型流感病毒檢測方法，具有簡便、經(jīng)濟、快速、靈敏和特異的特點，結果判斷方法靈活簡便，適合于在臨床或實驗室診斷中的應用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101376912SQ200810063690
公開日2009年3月4日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權日2008年6月25日
發(fā)明者嚴菊英, 盧亦愚, 姜曉慧, 張嚴峻, 徐昌平, 榛 李, 寅 陳 申請人:浙江省疾病預防控制中心