捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于寄生蟲分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫 擴增檢測試劑盒及檢測方法。 技術(shù)背景
[0002] 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲呈世界性分布，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲寄生于 真胃，以蟲體的前端刺入胃黏膜引起損傷，造成真胃炎癥和出血；分泌毒素影響造血功能、 消化液的分泌紊亂和對飼料的消化吸收障礙，使病羊呈現(xiàn)營養(yǎng)不良等一系列的癥狀；有時 引起致死性的進行性貧血；可導(dǎo)致肝壞死和肝細(xì)胞脂肪變性，并有時伴發(fā)缺鐵；常造成羊 的大量死亡，尤其是羔羊的死亡最為嚴(yán)重，對畜牧業(yè)造成極大經(jīng)濟損失（李國清，趙俊龍， 楊曉野等.獸醫(yī)寄生蟲學(xué).中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.2006:200-203.)。
[0003] 核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（ITS-1)和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（ITS-2)是大家比較 公認(rèn)的用于蟲種鑒定的遺傳標(biāo)記，已應(yīng)用于線蟲蟲種鑒定（Gasser,R.B.，Hu,M.，C hilton,N. ,Campbell,B. ,Jex,A. ,Otranto,D. ,Cafarchia,C. ,Beveridge,I. ,Zhu ,X. , 2006.Single-strandconformationpolymorphism(SSCP)fortheanalysisof geneticvariation.Nat.Protoc. 1, 3121 - 3128.Gasser,R.B. ,Bott,N.J. ,Chilton,N. B.,Hunt,P. ,Beveridge,I., 2008.Towardpractical,DNA-baseddiagnosticmethodsfor parasiticnematodesoflivestock-bionomicandbiotechnologicalimplications. Biotechnol.Adv. 26, 325 - 334.)D 2006 年，NathanJ.Bott等人設(shè)計針對拾轉(zhuǎn)血矛 線蟲ITS-2基因的特異性PCR引物來通過PCR的方法鑒別捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Nathan J.Bott. ,BronwynE.Campbell. ,IanBeveridge. ,NeilB.Chilton. ,DianneRees. ,Peter W.Hunt. ,RobinB.Gasser. , 2009.Acombinedmicroscopic-molecularmethodforthe diagnosisofstrongylidinfectionsinsheep.InternationalJournalforParasit ology. 39 (2009) : 1277 - 1287.)。
[0004] 基于分子水平對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2基因進行PCR擴增可以及時準(zhǔn)確的進行病 原鑒別，但是普通PCR、多重PCR以及熒光定量PCR，都必須依賴昂貴的精密儀器，檢測費用 高，對檢測人員要求較高的技術(shù)等，無法在條件較差的基層實驗室進行。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 法（loopmediatedisothermalamplification，LAMP)可以在等溫條件下高效、快速、高特 異、高靈敏地擴增靶序列。這種方法不需要特別的設(shè)備，只需要一臺可以提供60°C恒溫環(huán) 境的儀器（如水浴鍋或便攜式恒溫電熱器）。不僅大大降低了檢測的費用，而且給臨床應(yīng) 用帶來極大方便（Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amin 〇,N.，Hase,T. , 2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcids Res. 28,E63.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，該 試劑盒包括三對特異性引物，外引物F3 :5' -TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3' ；外引物B3 : 5' -AAGAACATCGTCGCCATACA-3' ；內(nèi)引物FIP:5'-ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTG TCTITTAG-3' ；內(nèi)引物BIP:5' -TCCCTGAATGATATGAACATGITTGTCACTATCTAAGTCAATC-3' ；促環(huán) 引物L(fēng)F:5' -GITCTTGAACTGAAATGGGAA-3' ；促環(huán)引物L(fēng)B:5' -ITGAGTGTACTCAGCGAATAIT-3'。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法。該方法快 速、靈敏、特異而又簡單實用。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0008] 一種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，根據(jù)已報道的登錄號為 X78803. 1的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2基因序列（見序列表SEQIDNO:1所示），設(shè)計三對特異 性引物：
【主權(quán)項】
1. 一種搶轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物，包括外引物F3 : 5' -TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3' ；外引物 B3 ;5' -AAGAACATCGTCGCCATACA-3' ；內(nèi)引物 FIP ; 5' -ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3' ；內(nèi)引物 BIP ;5' -TCCCTGAATGAT ATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3' ；促環(huán)引物 LF ;5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3' ；促 環(huán)引物 LB ;5' -TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。
2. -種搶轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，包括W下步驟： (1) 樣品總DNA提??； (2) 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增： 1) 建立環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（LAM巧反應(yīng)體系；2. 5yL 10倍體積的Bst DNA聚合酶緩沖 液，2mM MgCla，0. 8M甜菜堿，0. 4mM dNTPs，外引物F3和B3各0. 2 y M，內(nèi)引物FIP和BIP各 0. 6yM，促環(huán)引物L(fēng)F和LB各0. 28yM，8U BstDNA聚合酶，2yL DNA模板，用滅菌雙蒸水補 齊至25 y L ;其中陽性對照為用單條成蟲提取的搶轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組DNA，陰性對照為滅菌 雙蒸水； 2) 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增反應(yīng)；DNA經(jīng)95°C預(yù)變性5min，向預(yù)變性的DNA中加入上述除DNA W外的反應(yīng)體系中，再將其放置于63°C反應(yīng)60min，然后于80°C作用lOmin后終止反應(yīng)； 3) 擴增產(chǎn)物分析；采用顯色反應(yīng)或瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物； 顯色反應(yīng)：將1000倍體積的巧光顯色劑SYBR Green I進行10倍稀釋，之后取2 y L 加入至25 uL的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的最終產(chǎn)物中，在自然光下用肉眼觀察擴增產(chǎn)物的顯色情 況；若擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色則為搶轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性，若擴增產(chǎn)物為紅棟色則為搶轉(zhuǎn)血矛線 蟲陰性； 瓊脂糖凝膠電泳：取25 y L的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的最終反應(yīng)產(chǎn)物10 y以加入至含有 0. 5 y g/mL漠化己錠巧B)染料的2%的瓊脂糖凝膠中，于100V電壓下電泳30min，在凝膠成 相系統(tǒng)上成像觀察擴增產(chǎn)物的圖譜；擴增產(chǎn)物為由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜為搶 轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性。
3. 權(quán)利要求1所述引物在制備搶轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，該檢測試劑盒包括三對引物：F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；內(nèi)引物FIP：5'- ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；內(nèi)引物BIP：5'-TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3'；促環(huán)引物L(fēng)F：5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3'；促環(huán)引物L(fēng)B：5'- TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。本發(fā)明試劑盒具備特異性強，靈敏度高的特點，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的DNA檢測限達到45.1 pg/ul。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-90, C12Q1-68
【公開號】CN104531892
【申請?zhí)枴緾N201510025191
【發(fā)明人】楊新, 胡敏, 馮漢利, 方瑞, 朱凱祥, 漆明偉, 張宗澤, 譚理, 雷衛(wèi)強, 周艷琴, 趙俊龍
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月19日