專利名稱：厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用培養(yǎng)基及篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種菌株的篩選用培養(yǎng)基及篩選方法。
背景技術：
厭氧同時還原硫酸鹽與反硝化細菌主要用于同時含有硫酸鹽和硝酸鹽污 水的處理，現(xiàn)有篩選同時還原硫酸鹽與反硝化細菌方法的分離周期較長，同時 不易獲得純菌株，及時獲得了菌株，其對硫酸鹽和硝酸鹽的降解效能低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術篩選厭氧同時還原硫酸鹽與反硝化功 能細菌存在分離困難、分離周期長，及分離到的菌株的硫酸鹽還原和反硝化降 解效能低的問題，提供了一種厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用 培養(yǎng)基及篩選方法。
本發(fā)明厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用培養(yǎng)基分液體篩
選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選培養(yǎng)基由3.0~5.0gNa2SO4、 1.0 3.0g KN03、 1.0 3.0g NaN03、 0.5 2gMgSO4'7H2O、 0.3~0,6g K2HP04、 3.0 6.0g酒石酸鉀鈉、0.5 2g KH2P04、 0.1~0.5gCaCl2'2H2O、 0.3~0.8g L-半胱 氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選培養(yǎng)基的pH值為7.5;每升固體篩選培 養(yǎng)基是由3.0 5.0g Na2S04、 1.0 3.0g KN03 、 1.0~3.0g NaN03 、 0.5~2g MgS04'7H20、0.3 0.6g K2HP04、3.0~6.0g酒石酸鉀鈉、0.5~2g KH2P04、0.1 0.5g CaCl2'2H20 、 10 15g瓊脂粉、0.05 0.4mL濃度為0.2~0.4g/L的刃天青溶液、 Q.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選培養(yǎng)基的pH值為7.5。
本發(fā)明的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均處于厭氧狀態(tài)。
本發(fā)明厭氧同時具有還原硫酸鹽和反硝化功能的菌株的篩選方法是按下 述步驟實現(xiàn)的 一、分別配制如權利要求1所述的液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選 培養(yǎng)基；二、取厭氧同步去除硫氮工藝的污水或活性污泥，在厭氧條件下進行
倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離將步驟一配制固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化，
然后冷卻至45~55°C，迅速將步驟二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養(yǎng)基中，采用Himgate厭氧及"滾管"方法在冷水(10°C)中混合，然后放入 恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38"C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落；四、液體培養(yǎng)基 富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一配制的液體培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境下
培養(yǎng)7天 14天；五、分離純化；六、重復步驟三至五的操作進行多次分離純
化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得到的純菌株性能檢測，選取還原硫酸鹽 和反硝化功能性能優(yōu)異的菌株，即完成對厭氧同時具有還原硫酸鹽和反硝化功 能的菌株的篩選。整個篩選過程在厭氧條件下進行。
本發(fā)明的水處理除污菌株能同時去除硫酸鹽和硝酸鹽，并且去除效率高， 硝酸鹽的去除率高達97.98%， SO:—的去除率高達96.48%。篩選用培養(yǎng)基的針 對性強。本發(fā)明的方法簡單有效、分離快速、培養(yǎng)周期短、工作效率高，并可 篩選出目前篩選不到的污水處理性能優(yōu)異的菌株的優(yōu)點。


圖1是SN22-2菌單株原子力掃描電鏡照片。圖2是SN22-2菌多株原子 力掃描電鏡照片。圖3是SN22-2菌對硝酸鹽去除率曲線圖，圖中-x-表示 SN22-2菌對NO;的去除率曲線，i表示培養(yǎng)基中NO〗的濃度曲線，i-表示 培養(yǎng)基中NO〗的濃度曲線。圖4是SN22-2菌對SO:'的去除率曲線圖，圖中-x-表示SN22-2菌對SO:—的去除率曲線，-女-表示培養(yǎng)基中SO:—的濃度曲線。圖 5是基于SN22-2菌株和相近的菌株16S rDNA序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式中厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的 篩選用培養(yǎng)基分液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選培養(yǎng)基 由3.0~5.0gNa2SO4、 1.0 3.0g KN03、 1.0 3.0g NaN03、 0.5 2gMgSO4.7H2O、 0.3 0.6gK2HPO4、 3.0 6.0g酒石酸鉀鈉、0.5~2g KH2P04、 0.1 0.5gCaCl2.2H2O、 0.3 0.8gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選培養(yǎng)基的pH值為7.5;每 升固體篩選培養(yǎng)基是由3.0 5.0g Na2S04、 1.0 3.0g KN03、 1.0~3.0g NaN03、 0.5 2gMgSO4'7H2O、 0.3~0.6g K2HP04、 3.0~6.0g酒石酸鉀鈉、0.5~2g KH2P04、 0.1~0.5gCaCl2'2H2O 、 10 15g瓊脂粉、0.05~0.4mL濃度為0.2 0.4g/L的刃天 青溶液、0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選培養(yǎng)基的pH值 為7.5。
本實施方式的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均處于厭氧狀態(tài)。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是每升液體篩選
培養(yǎng)基由4gNa2S04、 2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 1.0gMgSO4.7H2O、 0.5gK2HPO4、 5.0g酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.2g CaCl2'2H20、 0.5g L-半胱氨酸和余量的 蒸餾水組成。其它與具體實施方式
一相同。 本實施方式的液體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是每升固體篩選 培養(yǎng)基由4gNa2S04、 2.0g KN03、 2.0gNaNO3、 l.Og MgS04.7H20、 0.5g K2HP04、 5.0g酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4 、 0.2gCaCl2'2H20 12g瓊脂粉、O.lmL濃度為 0.2g/L的刃天青溶液、0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成。其它與具體實施 方式一相同。
本實施方式的固體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。
具體實施方式
四本實施方式中利用具體實施方式
一所述的篩選用培養(yǎng)基
篩選厭氧同時具有還原硫酸鹽和反硝化功能的菌株，整個篩選過程在厭氧條件
下進行，篩選方法是按下述步驟實現(xiàn)的 一、分別配制如權利要求1所述的液 體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；二、取厭氧同步去除硫氮工藝的污水或活性 污泥，在厭氧條件下進行倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離將步驟一配制固體 培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟二稀釋的污水或活 性污泥用注射器注入固體培養(yǎng)基中，采用Hungate厭氧及"滾管"方法在冷水中 混合，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38。C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落； 四、液體培養(yǎng)基富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一配制的液體培養(yǎng)
基，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7天~14天；五、分離純化；六、重復步驟三至五的操作 進行多次分離純化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得到的純菌株性能檢測， 選取還原硫酸鹽和反硝化功能性能優(yōu)異的菌株，即完成對厭氧同時具有還原硫 酸鹽和反硝化功能的菌株的篩選。
本實施方式步驟一中采用蒸煮方法配制液體培養(yǎng)基，在蒸煮過程中通入高
純氮氣(高純氮氣中氧氣濃度《2ppm)以驅除氧氣，同時向培養(yǎng)基中加入還 原劑(L-半胱氨酸)，利用其還原作用去除氧，降低氧化還原電位，使氧化還 原電位(ORP)低于-100mV，由此液體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。本實施方式在
步驟一中采用蒸煮方法配制固體培養(yǎng)基，在煮沸之前，需不斷攪拌，防止瓊脂
凝固在鍋底。在煮沸之前加入0.2%的刃天青溶液(指示劑)待培養(yǎng)基煮沸后， 加入L-半胱氨酸0.5g,通入高純氮氣驅氧30min，然后在121。C條件下滅菌 20min。
步驟二中根據(jù)厭氧同步去除硫氮工藝的污水或厭氧活性污泥具體情況選 擇可以進行厭氧的倍比稀釋。將污水或厭氧活性污泥的水樣注入到經滅菌的含 有高純氮氣的厭氧管中；水樣需在4'C下保存。
經檢測，本實施方式篩選的菌株對硝酸鹽的去除率在82.75%以上，高達 97.98%;對硫酸鹽的去除率在90.84%以上，高達96.48%。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟三中菌落 的培養(yǎng)溫度為36-C。其它與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟三中菌落 的培養(yǎng)溫度為37'C。其它與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟五中分離 純化是對液體培養(yǎng)富集的菌液進行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重復菌株。其它 與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
九本實施方式污水選取大慶油田四廠杏九聯(lián)合污水處理 站。微生物分子生態(tài)學手段證實污水中有同時反硝化和硫酸鹽還原菌，進行厭 氧管的采樣。采用具體實施方式
四的方法進行篩選。
將本實施方式的篩選菌株標號為SN22-2，對其進行下述試驗
1、對SN22-2菌株形態(tài)和生理生化鑒定
菌株為桿菌(見圖1和2)，菌體的寬為0.20~0.7pm，長為3.0~5.5pm，厭 氧，短桿，極生鞭毛，生長溫度為20 40'C，生長pH值為7.5，葡萄糖氧化發(fā) 酵發(fā)酵產酸；平板菌落呈白色、圓形且表面隆起；脂肪酸主要分布在 C12:0~C19-CYC-9;主要脂肪酸為C16:1_CIS_9.FAME、 C16:0-FAME 、 C咖-f扁e和C18:0 DMA, C16:1-CIS-9_FAME占到脂肪酸總數(shù)6.35°/。， C16:q_fame占到脂肪酸總數(shù)21.42%、 C18:o-fame占到脂肪酸總數(shù)28.95%、 C18:0 DMA占到脂肪酸總數(shù)為6.04%，水 處理除污菌株生理生化指標
接觸酶 + 淀粉水解
油脂水解 + 乙酰甲基醇
甲基紅 + 明膠液化
產吲哚 + 尿素水解
檸檬酸鹽利用 + 葡萄糖發(fā)酵
硝酸鹽還原 + 果糖發(fā)酵
產硫化氫 + 乳糖發(fā)酵
產氨試驗 + 蔗糖發(fā)酵
革蘭氏染色 G- 乙醇發(fā)酵
，石蕊牛奶檢測石蕊還原、牛奶凝固。
2、基于SN22-2菌株和相近的菌株16S rDNA序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹， 如圖5。
經測序后獲得1468bp的16S rDNA序列，GenBank登錄號為DQ450463, 采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)發(fā)育樹16個菌株的平均遺傳距離為 0.043 。系統(tǒng)進化表明，SN22-2菌株的16S rDNA序列與5aa7/w coagw/a"s(AB240205)的相似性為99%，結合菌株的形態(tài)學和生理學特性，初 步鑒定5a"7/ws coagw/a"j SN22-2。
2、 SN22-2菌株的功能采用下述試驗進行驗證
SN22-2菌株的接種量為5%，每24h取樣，離子色譜測量N(V N02， S042— 的濃度，對菌株的降解率進行測試。
由圖3可知，NOj濃度變化范圍是從初始的4368.45mg/L，降低到 88.12mg/L， SN22-2菌株對于NO;的去除率在第4天的時候即達到了 82.75%， 最高去除率達到了 97.98%。而NOj濃度最高值出現(xiàn)在第4天，為1493.60mg/L， 這與第4天的NO;的濃度大幅度降低有關，產生了大量的NO〗中間產物。 SN22-2菌株具有很強的反硝化功能。
由圖4可知，SN22-2菌株在反硝化過程中，培養(yǎng)基中SC^的濃度變化范 圍從586.71mg/L降低到20.63mg/L，對于SO〗'的去除率在第4天的時候達到 了 90.84%，最高達到％.48%,可知SN22-2菌株具有較強的硫酸鹽還原能力。
因此，SN22-2菌株同時具有硫酸鹽還原和反硝化能力。
權利要求
1.厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用培養(yǎng)基分液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選培養(yǎng)基由3.0～5.0gNa2SO4、1.0～3.0g KNO3、1.0～3.0g NaNO3、0.5～2gMgSO4·7H2O、0.3～0.6g K2HPO4、3.0～6.0g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～0.5gCaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選培養(yǎng)基的pH值為7.5；每升固體篩選培養(yǎng)基是由3.0～5.0gNa2SO4、1.0～3.0g KNO3、1.0～3.0g NaNO3、0.5～2g MgSO4·7H2O、0.3～0.6g K2HPO4、3.0～6.0g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～0.5g CaCl2·2H2O、10～15g瓊脂粉、0.05～0.4mL濃度為0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選培養(yǎng)基的pH值為7.5。
2、 根據(jù)權利要求1所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 用培養(yǎng)基，其特征在于每升液體篩選培養(yǎng)基由4gNa2S04、 2.0gKNO3、 2.0g NaN03、 l.OgMgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 5.0g酒石酸鉀鈉、l.Og KH2P04、 0.2g CaCl2，2H20、 0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成。
3、 根據(jù)權利要求1所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 用培養(yǎng)基，其特征在于每升固體篩選培養(yǎng)基由4gNa2S04、 2.0g KN03、 2.0g NaN03、 1.0gMgSO4'7H2O、 0.5gK2HPO4、 5.0g酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4 、 0.2g CaCl2'2H20 12g瓊脂粉、O.lmL濃度為0.2 g/L的刃天青溶液、0.5g L-半 胱氮酸和余量的蒸餾水組成。
4、 利用權利要求1所述的篩選用培養(yǎng)基篩選厭氧同時還原硫酸鹽和反硝 化功能菌株的方法，整個篩選過程在厭氧條件下進行，其特征在于厭氧同時還 原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選方法是按下述步驟實現(xiàn)的 一、分別配制如 權利要求1所述的液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；二、取厭氧同步去除硫 氮工藝的污水或活性污泥，在厭氧條件下進行倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離 將步驟一配制固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養(yǎng)基中，采用Himgate厭氧及 "滾管"方法在冷水中混合，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38。C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落；四、液體培養(yǎng)基富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一配制的液體培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7天~14天；五、分離純化；六、 重復步驟三至五的操作進行多次分離純化，直至獲得純菌株；七、對步驟六得 到的純菌株性能檢測，選取還原硫酸鹽和反硝化功能性能優(yōu)異的菌株，即完成 對厭氧同時具有還原硫酸鹽和反硝化功能的菌株的篩選。
5、 根據(jù)權利要求4所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 方法，其特征在于步驟三中菌落的培養(yǎng)溫度為36。C。
6、 根據(jù)權利要求4所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 方法，其特征在于步驟三中菌落的培養(yǎng)溫度為37t:。
7、 根據(jù)權利要求4所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 方法，其特征在于步驟三中冷水的水溫為10°C。
8、 根據(jù)權利要求4所述的厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選 方法，其特征在于步驟五中分離純化是對液體培養(yǎng)富集的菌液進行鏡鑒以及革 蘭氏染色，去除重復菌株。
全文摘要
厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能菌株的篩選用培養(yǎng)基及篩選方法，它涉及一種菌株的篩選用培養(yǎng)基及篩選方法。它解決了現(xiàn)有技術篩選厭氧同時還原硫酸鹽和反硝化功能細菌存在分離困難、分離周期長，及分離到的菌株的硫酸鹽還原和反硝化降解效能低的問題。篩選用培養(yǎng)基分液體和固體兩種篩選用培養(yǎng)基。菌株的篩選一、取污水或活性污泥；二、配制篩選用培養(yǎng)基；三、固體培養(yǎng)基分離；四、液體富集；五、重復三至四的操作；六、功能驗證；選取性能優(yōu)異的菌株即可。本發(fā)明篩選的菌株能同時去除硫酸鹽和硝酸鹽，且去除率高。篩選用培養(yǎng)基的針對性強。本發(fā)明方法簡單有效、分離快速、培養(yǎng)周期短、工作效率高，并篩選出目前篩選不到的污水處理性能優(yōu)異的菌株。
文檔編號C12Q1/04GK101368200SQ20081006495
公開日2009年2月18日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權日2008年7月18日
發(fā)明者強 王, 王繼華, 秦松巖, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱師范大學;哈爾濱工業(yè)大學