專利名稱：厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基及篩選厭氧反硝化細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基及篩選反硝化細(xì)菌的方法。
技術(shù)背景現(xiàn)有厭氧反硝化細(xì)菌的分離周期較長(zhǎng)，同時(shí)不易獲得純菌株，即使獲得了 菌株，也沒有很好的硝酸鹽和亞硝酸鹽的降解效果。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的厭氧反硝化細(xì)菌分離困難、分離周期長(zhǎng)， 最后分離到的菌株反硝化效能低的問題，提供了一種厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培 養(yǎng)基及篩選厭氧反硝化細(xì)菌的方法。本發(fā)明厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基分液體篩選用培養(yǎng)基和固體篩選用培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選用培養(yǎng)基是由3.0~5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01 0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、8 15g酒石酸鉀鈉、0.5 2g KH2P04、 0.1 2gFeCl2'6H2O、 0.1~2g CaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水 組成，液體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5;每升固體篩選用培養(yǎng)基是由3.0 5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0 3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2PO4、 0.1 2gFeCl2.6H2O、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g 瓊脂粉、0.05~0.4mL濃度為0.2 0.4g/L的刃天青溶液、0.3~0.8g L-半胱氨酸和 余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。本發(fā)明的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均處于厭氧狀態(tài)。本發(fā)明厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的 一、配制上述的 厭氧反硝化細(xì)菌液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；二、取厭氧去除氮工藝的 污水或活性污泥，在厭氧條件下進(jìn)行倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離將步驟 一配制固體篩選用培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟 二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養(yǎng)基中，采用Hungate厭氧及"滾 管"方法在冷水中混合，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38。C條件下培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落；四、液體培養(yǎng)基富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一 配制的液體篩選用培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7天 14天；五、分離純化；六、 重復(fù)步驟三至五操作進(jìn)行多分離純化，直至獲得純菌株；七、對(duì)步驟六得到的 純菌株性能檢測(cè)，選取厭氧反硝化性能優(yōu)異的菌株，即完成對(duì)厭氧反硝化細(xì)菌 菌株的篩選。本發(fā)明整個(gè)篩選過程在厭氧條件下進(jìn)行。步驟三中冷水的水溫為l(TC。 步驟五中分離純化是對(duì)液體培養(yǎng)富集的菌液進(jìn)行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重 復(fù)菌株。本發(fā)明采用滾管培養(yǎng)固體篩選用培養(yǎng)基、進(jìn)行多次的分離純化，在厭氧條 件下，縮短了培養(yǎng)周期，獲得厭氧反硝化細(xì)菌菌株的同時(shí)減少工作量。本發(fā)明 篩選的厭氧反硝化細(xì)菌對(duì)N(V的最高去除率達(dá)到了 47.1%。


圖1是F1菌單株原子力掃描電鏡照片。圖2是F1菌對(duì)硝酸鹽的去除率曲 線圖，-"代表NCV的濃度變化，4-代表N03'的濃度變化，-x-代表N(V的去 除率。圖3是F1菌對(duì)硫酸鹽的利用率的曲線圖。圖4是具體實(shí)施方式
九中Fl 菌株和相近的菌株16S rDNA序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基分液體篩選 用培養(yǎng)基和固體篩選用培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選用培養(yǎng)基是由3.0~5.0gKN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2PO4、 0.1~2gFeCl2'6H2O、 (U 2gCaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5;每升固 體篩選用培養(yǎng)基是由3.0~5.0g KN03 、 3.0~5.0g NaN03 、 0.01~0.06g MgS04.7H20、 1.0~3.0gK2HPO4、 8 15g酒石酸鉀鈉、0.5~2gKH2P04、 0.1 2g FeCl2.6H20、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g瓊脂粉、0.05~0.4mL濃度為0.2 0.4g/L 的刃天青溶液、0.3 0.8gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養(yǎng)基 的pH值為7.5。本實(shí)施方式的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均處于厭氧狀態(tài)。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是每升液體篩選用 培養(yǎng)基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03gMgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 10g 酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2.6H2O、 0.2gCaCl2.2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。 本實(shí)施方式的液體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是每升固體篩選用 培養(yǎng)基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5gK2HPO4、 10g 酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g瓊脂粉、 0.1mL濃度為0.2g/L的刃天青溶液、0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固 體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。本實(shí)施方式的固體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式中厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法整個(gè)篩選過程 在厭氧條件下進(jìn)行，方法是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的 一、配制如權(quán)利要求l所述的 厭氧反硝化細(xì)菌液體篩選培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；二、取厭氧去除氮工藝的 污水或活性污泥，在厭氧條件下進(jìn)行倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離將步驟 一配制固體篩選用培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至45 55"C，迅速將步驟 二稀釋的污水或活性污泥用注射器注入固體培養(yǎng)基中，采用Hungate厭氧及"滾 管"方法在冷水中混合，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38"C條件下培養(yǎng)， 直至長(zhǎng)出菌落；四、液體培養(yǎng)基富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一 配制的液體篩選用培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7天 14天；五、分離純化；六、 重復(fù)步驟三至五操作進(jìn)行多分離純化，直至獲得純菌株；七、對(duì)步驟六得到的純菌株性能檢測(cè)，選取厭氧反硝化性能優(yōu)異的菌株，即完成對(duì)厭氧反硝化細(xì)菌 菌株的篩選。本實(shí)施方式步驟一中采用蒸煮方法配制液體培養(yǎng)基，在蒸煮過程中通入高純氮?dú)?高純氮?dú)庵醒鯕鉂舛萟2ppm)以驅(qū)除氧氣，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入還原 劑(L-半胱氨酸)，利用其還原作用去除氧，降低氧化還原電位，使氧化還原 電位(ORP)低于-100mV，由此液體培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)。本實(shí)施方式在步 驟一中采用蒸煮方法配制固體培養(yǎng)基，在煮沸之前，需不斷攪拌，防止瓊脂凝 固在鍋底。在煮沸之前加入0.2%的刃天青溶液(指示劑)待培養(yǎng)基煮沸后，加入L-半胱氨酸0.5g，通入高純氮?dú)怛?qū)氧30min，然后在12rC條件下滅菌 20min。本實(shí)施方式中將厭氧工藝的污水或活性污泥的水樣注入到經(jīng)滅菌的含有 高純氮?dú)獾膮捬豕苤?；水樣需?'C下保存。根據(jù)樣品的具體情況可以進(jìn)行厭 氧的倍比稀釋。經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施方式對(duì)NO,最高去除率達(dá)到了47.in/c)。而且本實(shí)施方式 篩選的菌株不進(jìn)行硫酸鹽還原。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟三中菌落的 培養(yǎng)溫度為36'C。其他與具體實(shí)施方式
四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟三中菌落的培養(yǎng)溫度為37°C具體實(shí)施方式
七:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟三中冷水的水溫為10°C。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟五中分離純化是對(duì)液體培養(yǎng)富集的菌液進(jìn)行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重復(fù)菌株。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式污水選取大慶油田四廠杏九聯(lián)合污水處理站。微生物分子生態(tài)學(xué)手段證實(shí)污水中有厭氧反硝化功能細(xì)菌，進(jìn)行厭氧管的采樣。采用具體實(shí)施方式
四中方法進(jìn)行篩選。將本實(shí)施方式的篩選菌株標(biāo)號(hào)為F1，對(duì)其進(jìn)行下述試驗(yàn) 1、對(duì)F1菌株形態(tài)和生理生化鑒定本實(shí)施方式篩選的厭氧反硝化細(xì)菌菌體大小為寬0.20 0.4|imx長(zhǎng) 3.0 4.0^m;菌體形態(tài)短桿，極生鞭毛；生長(zhǎng)溫度為20 40°C,生長(zhǎng)pH值為 7.5，葡萄糖氧化發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)酸:平板菌落呈白色、圓形且表面隆起；水處理除污菌株生理生化指標(biāo)接觸酶 + 淀粉水解 -油脂水解 +乙酰甲基醇 -甲基紅+明膠液化產(chǎn)u引哚+尿素水解檸檬酸鹽利用+葡萄糖發(fā)酵硝酸鹽還原+果糖發(fā)酵產(chǎn)硫化氫+乳糖發(fā)酵產(chǎn)氨試驗(yàn)+蔗糖發(fā)酵革蘭氏染色G-乙醇發(fā)酵，石蕊牛奶檢測(cè)石蕊還原、牛奶凝固。2、 Fl菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，基于F1菌株和相近的菌株16S rDNA序列 構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，經(jīng)測(cè)序后獲得1398bp的16S rDNA序列， GenBank登錄號(hào)為DQ450463，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)發(fā)育樹 15個(gè)菌株的平均遺傳距離為0.085。系統(tǒng)進(jìn)化表明，F(xiàn)l菌株的16SrDNA序列 與C7o^n^wm 6wOWcww(AY442812)的相似性為99°/。，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生 理學(xué)特性，初步鑒定C7o欲Wwm ^0/n'cwm Fl。3、對(duì)本實(shí)施方式篩選的厭氧反硝化細(xì)菌對(duì)N02—、 N(V、 SC^濃度變化 的影響以及對(duì)N(V去除率的驗(yàn)證，驗(yàn)證方法如下室內(nèi)配置改良的篩選用培養(yǎng)基，在接種量為5%的條件下每2411取樣，離 子色譜測(cè)量N(VN02-和SO^的濃度，由圖2(Fl菌對(duì)硝酸鹽的去除率曲線圖) 可知本實(shí)施方式篩選的菌株的N03'濃度變化范圍是從初始的6220.87mg/L，降 低到3290.82mg/L，在第3天的時(shí)候，去除率有了大幅增加，為39.17%。最高 去除率達(dá)到了47.1%。而N(V濃度變化不大，整個(gè)過程中最高為580.32mg/L。 可知本實(shí)施方式篩選的菌株具有反硝化功能。由圖3 (Fl菌對(duì)硫酸鹽的利用率 的曲線圖)可知菌株在反硝化過程中，篩選用培養(yǎng)基中SO^的濃度變化范圍 從25.73mg/L到31.38m^L，可認(rèn)為本實(shí)施方式篩選的菌株不進(jìn)行硫酸鹽還原。 可以確定該菌株應(yīng)該是厭氧反硝化細(xì)菌。
權(quán)利要求
1、厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基分液體篩選用培養(yǎng)基和固體篩選用培養(yǎng)基兩種；每升液體篩選用培養(yǎng)基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5；每升固體篩選用培養(yǎng)基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06gMgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸鉀鈉、0.5～2g KH2PO4、0.1～2gFeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g瓊脂粉、0.05～0.4mL濃度為0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，固體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基，其特征在于每 升液體篩選用培養(yǎng)基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5g FeCl2'6H20、 0.2g CaCl2'2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸餾水組成，液體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基，其特征在于每 升固體篩選用培養(yǎng)基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸鉀鈉、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g瓊脂粉、0.1mL濃度為0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸 餾水組成，固體篩選用培養(yǎng)基的pH值為7.5。
4、 利用權(quán)利要求1所述篩選用培養(yǎng)基的厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，整 個(gè)篩選過程在厭氧條件下進(jìn)行，其特征在于厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法是按下 述步驟實(shí)現(xiàn)的 一、配制如權(quán)利要求1所述的厭氧反硝化細(xì)菌液體篩選培養(yǎng)基 和固體篩選培養(yǎng)基；二、取厭氧去除氮工藝的污水或活性污泥，在厭氧條件下 進(jìn)行倍比稀釋；三、固體培養(yǎng)基分離將步驟一配制固體篩選用培養(yǎng)基在沸水 浴中融化，然后冷卻至45 55。C，迅速將步驟二稀釋的污水或活性污泥用注射 器注入固體培養(yǎng)基中，采用Hungate厭氧及"滾管，，方法在冷水中混合，然后放 入恒溫培養(yǎng)箱中在厭氧、35 38。C條件下培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落；四、液體培養(yǎng) 基富集挑取步驟三培養(yǎng)的單菌落接種到步驟一配制的液體篩選用培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7天 14天；五、分離純化；六、重復(fù)步驟三至五操作進(jìn)行多分 離純化，直至獲得純菌株；七、對(duì)步驟六得到的純菌株性能檢測(cè)，選取厭氧反 硝化性能優(yōu)異的菌株，即完成對(duì)厭氧反硝化細(xì)菌菌株的篩選。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中菌落的培養(yǎng)溫度為36°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中菌落的培養(yǎng)溫度為37。C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，其特征在于步驟 三中冷水的水溫為l(TC。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的厭氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，其特征在于步驟 五中分離純化是對(duì)液體培養(yǎng)富集的菌液進(jìn)行鏡鑒以及革蘭氏染色，去除重復(fù)菌 株。
全文摘要
厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基及篩選厭氧反硝化細(xì)菌的方法，它涉及一種反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基及篩選反硝化細(xì)菌的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的厭氧反硝化細(xì)菌分離困難、分離周期長(zhǎng)，最后分離到的菌株反硝化效能低的問題。厭氧反硝化細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基分液體篩選用培養(yǎng)基和固體篩選用培養(yǎng)基兩種。菌株的篩選一、取污水或活性污泥；二、配制篩選用培養(yǎng)基；三、固體培養(yǎng)基分離；四、液體富集；五、重復(fù)三至四的操作；六、功能驗(yàn)證；選取性能優(yōu)異的菌株即可。本發(fā)明篩選的菌株能去除硝酸鹽，且去除率高。篩選用培養(yǎng)基的針對(duì)性強(qiáng)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單有效、分離快速、培養(yǎng)周期短、工作效率高，并篩選出目前篩選不到的污水處理性能優(yōu)異的菌株。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101402990SQ200810064948
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者呂曉磊, 偉 孫, 博 王, 放 馬, 利 魏 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)