專利名稱：：一種設備的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種技術。更具體地，本發(fā)明涉及一種制備未分化細胞的設備。特別地，但不是專門地，本發(fā)明涉及一種從更定型細胞制備未分化細胞的設備。另一方面，本發(fā)明也涉及一種形成未分化細胞的方法。該設備也可以與生產者/銷售者/制造者/呼叫中心/服務中心等進行遠程聯系，例如遠程定購新試劑和/或證實操作正在或已經正確地進行。因此，本發(fā)明也涉及進4亍圍繞該設備的商業(yè)的方法以及其用途，例如與生產者/銷售者/制造者/呼叫中心/服務中心等進行遠程聯系，生產者/銷售者/制造者/呼叫中心/服務中心等對該聯系進行回答(例如，接收和填寫定單，接收和/或處理和/或回答關于操作的數據/信息和/或其更正)。
背景技術：
：分化是一種過程，通過此過程細胞的結構和功能逐漸定型，以產生更特異的細胞，例如從未成熟造血前體形成T細胞或B細胞。因此，當細胞變得更定型時，它們變得更特異。在大多數細胞類型中，細胞分化是導致最終分化細胞的單一途徑的方法。然而，盡管一些細胞類型在整個生命周期中保持不分裂，并且不被替代，許多細胞類型在生物體的整個生命周期中持續(xù)分裂，并且進行更新。這可能是簡單分裂(如肝細胞)，或者如同在造血細胞和上皮細胞中那樣，是由相對未分化的干細胞進行分裂，然后由子代細胞之一進行隨后的不可逆分化。然而，所有這些過程有一個共同特征細胞或者維持其分化狀態(tài)，或者變得更分化。它們不會變成未分化或甚至更不分化。逆向分化(retrodifferentiation)是一種過程，通過該過程細胞的結構和功能逐漸改變，以產生較不特異的細胞。一些細胞反應于組織損傷而在體內天然進行有限的逆向分化。例如，已經觀察到在肝退化時，肝細胞恢復為與胎兒酶模式相似的酶表達模式(CurtinandSnell，1983，Br.J.Cancer,Vol.48;495-505)。W096/23870中表明了可以對分化細胞進行處理，以便是它們成為未分化細胞，包括干細胞。這些未分化細胞可以增殖，產生同一細胞系或任何其它細胞系的逆向分化后代。對于逆向分化的造血細胞，這些干細胞是多能的，它們可以產生多個細胞系。W096/23870中的這一開創(chuàng)性發(fā)現是完全未預料到的。該發(fā)現的臨床意義是巨大的。對于人類患者來說，干細胞極難獲得。它們一般是從臍帶組織、骨髓或血液中獲得，在這些部位它們的存在量很小。然而，本發(fā)明提供了一種從更定型細胞產生干細胞的設備，特別是通過逆向分化的過程產生干細胞的設備。US6,087,168公開了一種將上皮細胞轉分化為神經元細胞的方法，其中用適當的培養(yǎng)基將上皮細胞去分化或逆向分化。同樣LakeJAetalJournalofCellScience113,556-566(2000)和RathjenJetalJournalofCellScience112,601-612(1999)>^開了將胚胎干(ES)細胞逆向分化為早期原始外胚層樣(EPL)細胞，這是反應于兩種可分離的因子而導致的.發(fā)明概述在更寬的方面，提供了一種制備未分化細胞的設備，其中該設備包含允許更定型細胞逆向分化為未分化細胞的工具(means)。先有技術文件(如US6，087，168，Lakeetal或Rathjenetal)都沒有公開適用于制備未分化細胞的設備。盡管制備未分化細胞可以由本領域技術人員不使用本發(fā)明的設備而完成，每次進行該程序得到的終產品容易不一致，并且該結果取決于進行該程序的人的技術和經驗。此外，人工制備未分化細胞所要求的"加工，，時間很長，因此對于實驗室來說不是經濟的。在一個特定實施方案中，提供了一種在包含定型細胞的細胞群中形成未分化細胞和/或增加未分化細胞的相對數目的設備，該設備包含一個腔室(chamber)，將包含定型細胞的細胞群引入所述腔室的工具，將可以使定型細胞逆向分化為未分化細胞的逆向分化工具引入所述腔室的工具，以及在所述逆向分化工具存在的條件下孵育所述定型細胞的孵育工具，從而4吏定型細胞逆向分化為未分化細胞。在另一特定實施方案中，提供了一種在包含定型細胞的細胞群中形成未分化細胞和/或增加未分化細胞的相對數目的設備，該設備包含一個腔室，將包含定型細胞的細胞群引入所述腔室的工具，將導致定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑引入所述腔室的工具，以及賻育所述試劑和所述定型細胞的孵育工具，從而使定型細胞逆向分化為未分化細胞。優(yōu)選地，該試劑涉及(engage)介導定型細胞表面抗原的捕獲、識別或呈遞的受體。更優(yōu)選地，該受體是MHCI類抗原或MHCII類抗原，如選自人白細胞相關(HLA)-A受體、HLA-B受體、HLA-C受體、HLA-E受體、HLA-F受體、或HLA-G受體的MHCI類抗原或選自HLA-DM受體、HLA-DP受體、HLA-DQ受體或HLA-DR受體的MHCII類抗原.適當地，該受體可以含有具有同源區(qū)域的P鏈。優(yōu)選地，該受體可以至少含有HLA-DR的p鏈的同源區(qū)。一般地，定型細胞是分化細胞。優(yōu)選地，定型細胞是定型的造血細胞，優(yōu)選選自T細胞集落形成細胞(CFC-T細胞)、B細胞集落形成細胞(CFC-B細胞)、嗜酸性細胞集落形成細胞(CFC-Eosin細胞)、嗜堿性細胞集落形成細胞(CFC-Bas細胞)、粒細胞/單核細胞集落形成細胞(CFC-GM細胞)、巨核細胞集落形成細胞(CFC-MEG細胞)、紅細胞爆裂型集落形成細胞(BFC-E細胞)、紅細胞集落形成細胞(CFC-E細胞)、T細胞和B細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，更定型細胞不是癌細胞.在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，該試劑既不是致癌的，也不能促進癌生長。在一個優(yōu)選實施方案中，該試劑是受體的抗體，如受體的單克隆抗體。特殊的例子包括CR3/43和TAL.1B5單克隆抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，該試劑調節(jié)MHC基因表達，適當地，該試劑可以調節(jié)MHCI類+和/或MHC11類+表達。該試劑優(yōu)選與生物反應調節(jié)劑，如烷化劑聯合使用，例如是或包含環(huán)躊酰胺的烷化劑。優(yōu)選的未分化細胞包含干細胞抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，未分化細胞選自胚胎干細胞、多能干細胞、淋巴樣干細胞、造血干細胞、神經元干細胞、上皮干細胞、間充質干細胞、內皮干細胞、和髓細胞樣干細胞。優(yōu)選地，未分化細胞的特征在于以下一種或多種細胞表面標記符號CD34+，HLA-DR—，CD38-，CD117,AC133,CD90和/或低CD45(CD45low)。更優(yōu)選地，未分化細胞為CD34+和CD38、甚至更優(yōu)選為CD34+，CD38，HLA-DiT和低CD45。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明也提供了一種在包含定型細胞的細胞群中增加具有細胞表面標記符號CD34+和/或CD38—和/或HLA-D1T和/或低CD45和/或CD90和/或CD117和/或AC133的細胞的相對數目的設備，該設備包含(i)一個腔室，(ii)將包含定型細胞的細胞群引入所述腔室的工具(iii)將可操作性涉及所述定型細胞的試劑引入所述腔室的工具；和(iv)可操作性孵育由所述試劑涉及的所述定型細胞的孵育工具，使得由于所述涉及而增加CD34+和/或CD38—和/或HLA-DR—和/或低CD45和/或CD90和/或CD117和/或AC133細胞的相對數目。本發(fā)明的設備可以任選地進一步包含富集所述未分化細胞、去除該試劑、和/或從改變的細胞群中回收所述未分化細胞的純化和分離工具。優(yōu)選地，純化工具包含鑒定存在于未分化細胞表面的細胞表面標記或存在于定型細胞表面但基本不存在于未分化細胞表面的細胞表面標記。適當地，純化工具可以利用例如抗細胞表面標記的抗體。適當的標記的例子包括CD34,CD45和HLA-DR。僅僅是舉例說明，適當的純化工具是CliniMACs/IsolexCD34+純化系統(tǒng)，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，這種純化或分離工具可以任選地作為獨立的工具提供。本發(fā)明的設備可以任選地進一步包含上游負選擇和/或細胞富集工具。另外，可以在插入所述設備之前任選對細胞群進行負選擇和/或細胞富集。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的未分化細胞是CD3fCD"—和沒有造血細胞系標記的細胞.更分化的細胞可以與原始的定型細胞同系或不同系.因此，除了產生未分化細胞，本發(fā)明的設備可用于將一個系的細胞轉化為另一個系的細胞。因此，本發(fā)明的另一方面提供了將包含一種造血系的定型造血細胞的細胞群誘導為另一造血系的細胞的設備，該設備包含(i)一個腔室，(ii)將包含定型細胞的細胞群引入所述腔室的工具(iii)將可操作性涉及所述定型造血細胞表面的抗原的捕獲、識別或呈遞的試劑引入所述腔室的工具；和(iv)可操作性孵育由所述試劑涉及的所述定型細胞的孵育工具，使得它們由于所述涉及而成為另一種造血系的細胞。優(yōu)選地，所述定型的造血細胞屬于B細胞系，并且成為選自T細胞系和髓細胞系的另一種造血系的細胞，由本發(fā)明的設備產生的未分化細胞可以用于制造治療免疫紊亂或疾病的藥物。同樣，根據本發(fā)明的方法產生的定型細胞可以用于制造治療免疫紊亂或疾病的藥物。本發(fā)明是高度有益的，因為現在可以輕易從更定型細胞中制備未分化細胞，然后用這些未分化細胞體內或體外，或二者結合制備藥物，以便治療疾病。本發(fā)明的另一優(yōu)點是它也可以用該設備將由逆向分化而制備的未分化細胞定型為重新定型的細胞，如的新分化細胞，其目的為糾正或去除原來的更定型細胞或糾正或去除其產物。例如，可以用未分化細胞產生重新定型的細胞如覆蓋肺泡的細胞，由此可以替代或修復破壞肺組織或使其致病的機制(見LePage,NewScientist19December2000,p20)。名詞"重新定型的細胞，，表示來源于未分化細胞的細胞，即新的更定型細胞。"更定型的"表示更分化的，因此可以;限據已知細胞分化途徑和階段而確定。大多數未分化細胞和分化細胞包含主要組織相容型復合物(MHC)I類抗原和/或II類抗原。如果這些抗原與那些細胞結合，那么它們稱作I類+和II類+細胞。優(yōu)選地，更定型細胞可以再分化為MHC1類+和/或MHC11類+未分化細胞.優(yōu)選地，更定型細胞可以逆向分化為包含干細胞抗原的未分化細胞。優(yōu)選地，更定型細胞可以逆向分化為CD34+未分化細胞。優(yōu)選地，更定型細胞可以逆向分化為淋巴造血祖細胞，優(yōu)選地，更定型細胞可以逆向分化為多能干細胞。優(yōu)選地，所述增加在24小時內，優(yōu)選4-8小時內發(fā)生(這樣任何改變不能完全被細胞增殖所解釋)。一般地，未分化細胞數目改變的測定是通過監(jiān)測具有未分化細胞的特征性細胞表面標記的細胞的數目改變而進行的。適當的細胞表面標記的例子包括CD3f，HLA-DIT,CD38-，CD117,AC133,CD90和/或低CD45。作為選擇或補充，可以監(jiān)測具有分化細胞而不是未分化細胞的特征性細胞表面標記的細胞的數目的減少。適當地，本發(fā)明的設備可以任選地進一步包含監(jiān)測具有未分化細胞的特征性細胞表面標記的細胞的數目改變的跟蹤工具。用于測定的優(yōu)選定型細胞為定型的造血細胞，如選自CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，BFC-E細胞，CFC-E細胞，T細胞和B細胞，更優(yōu)選B細胞的細胞。本發(fā)明的設備優(yōu)選進一步包含一種或更多、優(yōu)選兩種或更多、更優(yōu)選三種或更多、更優(yōu)選四種或更多以下特征(i)測量細胞群體積的測量工具，(ii)進行細胞計數并由此測量細胞群的細胞濃度的計數工具(如必要時進行了微型化的庫爾特計數器或其它適當的細胞計數器)，(iii)將一定量(如預定量)的細胞群從儲存容器轉移到腔室中的轉移工具，該轉移工具可以任選包含例如泵，(iv)計算加入到腔室中的試劑的體積的計算工具，該試劑的體積取決于細胞群的體積和細胞濃度，(v)將一定體積(如計算的體積)的試劑轉移到腔室中的另一種轉移工具，該另一種轉移工具可以任選包含例如由步進電機等電機驅動的注射器，(vi)用于控制腔室中二氧化碳濃度的二氧化碳控制工具(例如作為孵育工具的一部分)，(vii)用于控制腔室中溫度的溫度控制工具(例如作為孵育工具的一部分)，(viii)用于混合腔室中的細胞群和試劑的混合工具(例如作為孵育工具的一部分)，(ix)用于對孵育階段進行計時的計時工具(例如作為孵育工具的一部分)，以及任選的用于向用戶顯示剩余時間的顯示工具和/或提醒用戶孵育階段完成的提醒工具，(X)用于從腔室中收獲細胞，特別是從腔室中收獲未分化細胞的收獲工具，(Xi)從腔室中取出包含未分化細胞的細胞群至儲存容器中的取出工具，取出工具可以包含，例如泵；和(xii)密封儲存容器的密封工具，其中含有包含未分化細胞的細適當地，在本發(fā)明的設備中，轉移工具(iii)可以將一定量(如預定量)的細胞群直接從患者轉移到所述腔室(即不需要儲存容器)和/或取出工具(xi)可以從腔室中直接取出包含未分化細胞的細胞群至患者(即不需要儲存容器)。適當地，轉移工具(iii)可以包含蠕動泵，該泵通過互聯工具如管道將細胞群從儲存容器中轉移到腔室中。互聯工具優(yōu)選經過庫爾特計數器或其它適當的細胞計數器(如(ii)中提到的)。以這種方式，可以在將細胞群從儲存容器轉移到腔室的過程中對細胞群的細胞濃度進行計算。優(yōu)選地，以上(iii)和(xi)提到的儲存容器是儲存袋，最好是一次性的。(iii)的儲存容器優(yōu)選與(xi)的儲存容器優(yōu)選不同，前者為輸入儲存容器，后者為輸出儲存容器。優(yōu)選地，另一種轉移工具(v)包含一種試劑的儲液器，以便保證任何時候都有足夠的試劑。當轉移工具為注射器時，可以用另一注射器提供儲液器，這樣當一個注射器排空時，另一注射器開始供應試劑。優(yōu)選地，用于控制腔室中二氧化碳濃度的二氧化碳控制工具包舍一個閥門，它允許從氣瓶中引入預定量的二氧化碳。預定量的二氧化碳是用腔室、管道和輸出儲存容器中的已知空氣體積和輸入儲存容器的細胞群的測量體積計算的。適當地，通過一個端口將二氧化碳引入腔室中，該端口與加入試劑所通過的端口相同，通過這種方式，二氧化碳可以用于將所有剩余的試劑輸送至端口以及周圍的裝備，除上述以外，二氧化碳控制工具可以進一步含有可充氣的氣嚢，以容納由將額外的二氧化碳引入系統(tǒng)而產生的多余氣體體積。另外，輸入儲存容器一旦排空，就可以作為氣囊。優(yōu)選地，引入的二氧化碳在腔室中產生的終濃度為5%。溫度控制工具(vii)可以適當地包含加熱工具，該加熱工具可以通過例如位于腔室之下的熱板提供。另外，加熱工具可以通過鄰近于腔室或其一部分的熱水套提供.作為參考，腔室中的溫度控制在約251C-約37"C.混合工具(viii)優(yōu)選包含至少一個葉片式臂，它緩慢旋轉以混合細胞群和腔室中的試劑.也可選擇4吏用磁攪拌器。作為另一種選擇，可以對腔室進行機械攪拌，例如通過平緩搖動，使用包含至少一個葉片式臂的混合工具的一個優(yōu)點是該臂也可被設計作為細胞收獲過程中的刮器，即當該臂緩慢旋轉時，附著于腔室表面的細胞被輕輕去除，有利地，該混合工具可以操作性實現回旋運動。取出工具(xi)優(yōu)選包含一個蠕動泵。有利地，取出工具通過在腔室底部的輸出端口拉出包含未分化細胞的細胞群，并通過互聯工具，例如管道進入輸出儲存容器。作為取出工具的選擇或補充，可以在取出細胞群之前向腔室中加入游離離子掩蔽劑和/或螯合劑，例如EDTA等抗凝劑。向腔室中加入這種離子掩蔽劑和/或螯合劑導致干細胞集落分散為單個細胞的懸浮液，并因此促進通過沖洗工具從腔室中取出細胞。密封工具(xii)優(yōu)選包含一個熱密封器，該熱密封器對輸出儲存容器的關閉是通過將容器的兩部分壓在一起，或將位于該容器之前的互聯工具的兩部分壓在一起，直到完全密封，例如，熱密封器可能產生約2cra寬的封條，熱密封器然后在其中間部分切斷封條。本發(fā)明的每一部分優(yōu)選可以獨立通過中央計算機系統(tǒng)控制。有利地，計算機系統(tǒng)可以從該設備的一部分接收輸入信號，根據這些輸入信號實現計算，并將輸出信號發(fā)送到該設備的相同或另一部分，本發(fā)明的設備具有一些優(yōu)點，特別是該設備保證了每次執(zhí)行程序時獲得了一致的結果，并且不浪費昂貴的試劑。此外，可以對該設備進行編程，以便在逆向分化結束時提醒用戶和/或在完成前顯示時間剩余。如果對其編程以進行該任務，該設備可以促使用戶購買新試劑。這就是說，該設備可以監(jiān)測試劑的使用和儲備量，因此當儲備的試劑減少至臨界值以下時促使用戶購買。本發(fā)明的設備可以進一步包含多個腔室，每一個用于產生定型為不同細胞系，如肌肉、毛發(fā)、神經元等的未分化細胞。這樣，可以同時產生定型為不同細胞系的未分化細胞。優(yōu)選地，當使用多個腔室時，每個腔室有獨立的輸出端口以及獨立的輸出儲存容器?？梢酝ㄟ^對每個腔室使用不同處理的塑料(plastics)或向每個腔室中加入不同的化學物質而在本發(fā)明的設備中控制細胞系。該設備的一種或多種成分優(yōu)選是一次性的。例如，以下一種或多種成分可以是一次性的腔室、輸入儲存容器、輸出儲存容器、連接儲存容器與腔室的互聯工具、以及轉移工具(v)。適當地，一次性成分可以作為模塊(cartridge)用于插入該設備。僅僅是作為舉例說明，模塊可以包含第一個血袋(輸入儲存容器)，一個腔室和第二個(輸出)血袋，其中腔室通過管道(互聯工具)與第一個和第二個血袋的每一個連接.適當地，該設備可以被認為是一種部分固定和部分一次性的系統(tǒng)。優(yōu)選地，與細胞群接觸的設備的腔室和/或其他成分是用USPVI類材料、聚碳酸酯斑片或其他不能產生其他形式的細胞轉化體的塑料，優(yōu)選包含的細胞群為血液。優(yōu)選的試劑為抗體.另一方面，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將更定型細胞逆向分化為未分化的細胞，其中更定型細胞的逆向分化發(fā)生于血塊黃層(buffycoat)血樣中的或來自于血塊黃層血樣的更定型細胞。另一方面，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括使血塊黃層血樣中的或來自于血塊黃層血樣的更定型細胞與導致更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑接觸，在本分明的一種優(yōu)選實施方案中，更定型細胞不是癌細胞，在本分明的另一種優(yōu)選實施方案中，該試劑不是致癌的，也不能促進癌生長。定型的細胞優(yōu)選是分化的。定型的細胞優(yōu)選是定型的造血細胞，如選自CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，BFC-E細胞，CFC-E細胞，T細胞和B細胞，更優(yōu)選B細胞.未分化細胞優(yōu)選選自多能干細胞、造血干細胞、神經元干細胞、上皮干細胞、間充質干細胞和胚胎千細胞。優(yōu)選地，未分化干細胞的特征在于以下一種或多種細胞表面標記符號CD34+，HLA-DIT，CD38-，CD117，AC133,CD90和/或低CD45。更優(yōu)選地，未分化細胞為CD34+和CD38—，甚至更優(yōu)選為CD34+，CD38-，HLA-DIT和低CD45,適當地，未分化細胞為MHCI類+和/或MHCI1類+細胞。所述試劑優(yōu)選涉及介導定型細胞表面抗原的捕獲、識別或呈遞的受體。更優(yōu)選地，該受體為MHCI類抗原或MHCII類抗原，如選自人類白細胞相關(HLA)-A受體、HLA-B受體、HU-C受體、HLA-E受體、HLA-F受體或HLA-G受體的I類抗原或選自HLA-DM受體、HLA-DP受體、HLA-DQ受體或HLA-DR受體的II類抗原。適當地，該受體可以包含具有同源區(qū)的p鏈。在一種實施方案中，該受體至少可以包含HLA-DRp鏈的同源區(qū)，在一個優(yōu)選實施方案中，該試劑為受體的抗體，如受體的單克隆抗體。具體的例子包括CR3/43和單克隆抗體TAL.1B5。適當地，該試劑可以調節(jié)MHC基因表達，例如MHCI類+和/或MHCII類+表達。在本分明的另一優(yōu)選實施方案中，提供了一種增加血塊黃層血樣中具有細胞表面標記符號CD3《和/或HU-DIT和/或CD3^和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45的細胞的相對數目的方法，該方法包括使血塊黃層血樣中的更定型細胞與可操作性涉及該定型細胞的試劑接觸，這種涉及導致CD34+和/或HLA-DR—和/或CD38—和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45細胞的相對數目增加。另一方面，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括使細胞群中的一種或多種分化細胞與有效轉換所迷細胞群中的正常分化細胞比例的逆向分化工具接觸，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞。另一方面，本分明提供了轉換細胞群中的正常分化細胞比例的逆向分化工具實現將一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞的用途。另一方面，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中包含含有一種或多種分化細胞的細胞群的環(huán)境從第一種環(huán)境改變?yōu)轶识N環(huán)境，其中所述第二種環(huán)境的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞。另一方面。本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的一種或多種分化細胞與有效轉換正常分化細胞比例的逆向分化工具接觸，在不含離子或離子被掩蔽的第一種環(huán)境中培養(yǎng)細胞群，并將第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，其中第二種環(huán)境中存在的離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞。優(yōu)選逆向分化工具是任何導致細胞群中正常分化細胞的比例破壞的工具，此處稱為細胞群內的負選擇，由此導致細胞群中正常分化細胞的比例的破壞。逆向分化工具可以是，例如，以下的任意一種或多種抗體(純的和偶聯的(即結合于固定的和游離的配體，如磁性、玻璃或聚苯乙蜂珠)；Histopaque，LymphoPrep(Sigma))或其他用于根據細胞密度分離細胞的任意密度梯度培養(yǎng)基；或右旋糖苷(例如導致紅細胞沉淀)。其他導致細胞轉換的適當工具見Vettese-Dadey(TheScientist,Sep131999,13(18):21)。第二種環(huán)境中的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比有所增加，更優(yōu)選地，第一與第二種環(huán)境的相對游離離子濃度增加，即第二種環(huán)境的游離離子濃度增加.優(yōu)選地，相對游離離子濃度的增加足夠導致一種或多種分化細胞逆向分4匕為未分化細胞。僅僅作為舉例說明，將細胞從含有5mMEDTA(—種游離離子掩蔽劑和/或螯合劑)的培養(yǎng)基轉移至含有更少或不含EDTA的另一種培養(yǎng)基中，導致游離離子濃度(如鈣離子濃度)的增加，該增加足以導致逆向分化。優(yōu)選游離離子為陽離子.優(yōu)選游離離子為I族或II族金屬。優(yōu)逸陽離子為鈣離子和/或鎂離子。適當地，環(huán)境的游離離子濃度可以通過用能夠相對改變環(huán)境中游離離子濃度的試劑處理而進行修飾。因此，在一種優(yōu)選實施方案中，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中含有該細胞群的環(huán)境通過用能夠相對改變環(huán)境中游離離子濃度的試劑處理而進行修飾，從而實現第二種環(huán)境。例如，第一種環(huán)境可以用一種或多種游離離子掩蔽劑處理，隨后將其去除或減少，由此實現具有相對增加的游離離子濃度的第二種環(huán)境，從而實現細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。這就是說，例如可以通過以下方式去除或減少掩蔽劑通過物理或化學方法從第一種環(huán)境中去除掩蔽劑或掩蔽劑的一部分，或者將細胞群轉移到沒有這種游離離于掩蔽劑或與第一種環(huán)境相比游離離子掩蔽劑濃度較低的第二種環(huán)境。在任何情況下，第二種環(huán)境的游離離子濃度與笫一種環(huán)境相比有所增加，從而實現了細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。作為選擇，可以在含有低濃度游離離子或不含游離離子的第一種環(huán)境中培養(yǎng)細胞群，然后將細胞群轉移到笫二種環(huán)境，或調節(jié)第一種環(huán)境，使其成為第二種環(huán)境，所迷第二種環(huán)境含離子，或與第一種環(huán)境相比，離子濃度更高，從而實現了細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。此處用到的術語"低"包括與第二種環(huán)境的終濃度相比，具有相對低的游離離子起始濃度的環(huán)境，因此，在一種優(yōu)選實施方案中，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中含有所述包含一種或多種分化細胞的細胞群的環(huán)境從沒有游離鈣離子或鎂離子或鈣離子或鎂離子濃度低的第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，所述第二種環(huán)境含鈣離子或鎂離子，或與笫一種環(huán)境相比，鈣離子或鎂離子濃度更高，從而實現了細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。不希望受到理論的限制，認為離子濃度的改變，特別是離子濃度的增加導致細胞群中的細胞聚集為集落(例如，進行同型聚集)，這些細胞間的物理接觸可以誘導它們逆向分化。掩蔽劑優(yōu)選為離子螯合劑。掩蔽劑優(yōu)選同時包含胺和羧基。優(yōu)選地，掩蔽劑包含多個-N(CH2C(hH)-基團，其中n-l或n-2。適當地，掩蔽劑可以選自以下一種或多種EDTA,肝素，EGTA，DTPA，檸檬酸三鈉和其他相似的螯合劑和/或抗凝劑。適當地，可以加入足夠高濃度的掩蔽劑，使得對其進行去除可以導致逆向分化。一般地，對其進行去除后足夠導致逆向分化的掩蔽劑的濃度為大于或等于約2mM。在本分明的一種優(yōu)選實施方案中，更定型細胞不是癌細胞。在另—種優(yōu)選實施方案中，該試劑既不是致癌的，也不能促進癌細胞生長。定型的細胞優(yōu)選是分化的。定型的細胞優(yōu)選是定型的造血細胞，如選自CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，BFC-E細胞，CFC-E細胞，T細胞和B細胞，更優(yōu)選B細胞，未分化細胞優(yōu)選選自多能干細胞、造血干細胞、神經元干細胞、上皮干細胞、間充質干細胞和胚胎千細胞。優(yōu)選地，未分化細胞的特征在于以下一種或多種細胞表面標記符號CD34+，HLA-DR-,CD38—，CD117，AC133,CD90和/或低CD45.更優(yōu)選地，未分化細胞為CD34+和CD38-，甚至更優(yōu)選為CD34+，CD38""，HLA-D1T和低CD45'另一方面，本分明提供了一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中包含所述含有一種或多種分化細胞的環(huán)境從第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，其中所述笫二種環(huán)境的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞.適當地，未分化細胞為MHCI類+和/或MHCI1類+細胞，在一種實施方案中，包含定型細胞的細胞群為血塊黃層血樣中或來自于血塊黃層血樣。有利地，可以用本分明的一種方法有效培養(yǎng)紅細胞祖細胞，以產生紅細胞，該紅細胞可以用于例如補充血液供應中的短缺。適當地，本分明的一種方法可以用于產生用于血小板產生中的巨核細胞.為了使本分明可以被清楚的理解并容易實施，將參考以下附圖作為舉例。圖1表示本分明設備的透視圖，其前面板打開，插圖表示脫離其環(huán)境的設備的切面圖2表示圖1的設備的透視圖，其前面板關閉；圖3表示血細胞的照片；圖4表示LSCs分化形成T細胞和B細胞的圖表；圖5表示MSCs分化形成嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、巨核細胞、單核細胞、紅細胞、粒細胞、肥大細胞、M細胞和淋巴細胞；圖6表示淋巴造血祖細胞。圖7表示用CR3143抗體處理后CD45—CD14-細胞的外觀；圖8表示分化B細胞的顯微鏡照片；圖9表示由B細胞逆向分化形成的未分化細胞的顯微鏡照片；圖IO表示與圖9同樣的未分化細胞的顯微鏡照片；但放大倍數較低；圖ll表示分化B細胞的顯微鏡照片；圖12表示由B細胞逆向分化形成的未分化細胞的顯微鏡照片；圖13表示從與圖12相同的未分化細胞形成分化粒細胞的顯微鏡照片；圖14表示從BCLL患者得到的未處理血樣的兩張不同放大倍數的顯微鏡照片；圖15表示經處理的血樣的顯微鏡照片；圖16和17表示在處理血樣過程中時間推移顯微鏡照片；圖18表示DNA印跡；圖19表示用B-CLL患者的外周血細胞獲得的另一種DNA印跡；圖20表示用三種試劑增加細胞群中CD34+細胞的相對數目；圖21表示用反相亮視野顯微鏡觀察的干細胞集落測定；圖22表示用反相亮視野顯微鏡觀察的貼壁細胞；和圖23表示用CR3/43mab處理B細胞過程中時間延遲錄4象得到的兩張靜止圖像'發(fā)明詳述I設備該設備用參考號1進行整體描述，包含一個具有前面板3的外殼2，前面板3可以打開，允許達到設備l的內部。支持鉤5上掛有一個輸入儲存容器，即血袋4。支持鉤5形成了一種電平衡(未顯示)，可以進行操作，用于對血袋4稱重。該設備進一步包含一個腔室6，該腔室6與輸入血袋4通過管道7互聯。管道7包含一個透明窗8，該窗位于庫爾特計數器流路池內?？梢詫σ粋€蠕動泵(未示出)進行操作，從輸入血袋4拉出血液，經計數器流路池9進入腔室6。注射器10和ll含有抗原，都是用步進電機(未示出)進行驅動。注射器IO、11持續(xù)維持在4'C的可鎖的絕緣帕耳貼"水箱"12中。提供了兩個注射器10和11是為了保證該設備總是具有足夠的血供.使用抗生素和一次性的0.2fim濾膜(一般成為參考號13)保持注射器10和ll的無菌性。該設備還包含一個二氧化碳入口14，它指導二氧化碳從氣瓶(未示出)中通過管道15進入腔室6。注射器10和11也與腔室6通過管道15形成流體聯通狀態(tài)。閥門16控制二氧化碳和抗原流通經過管道15。加熱工具(未示出)在腔室6下面。在腔室6中有一個可旋轉的葉片17，可以操作將抗體和血液在腔室6中混合，當抗體和血液剩余在腔室6中時，計時工具(未示出)監(jiān)測孵育時間，孵育剩余時間可以顯示在控制面板顯示器18上輸出儲存容器，即輸出血袋19也掛在設備1中，并通過管道20與腔室6互聯。管道20經過熱密封器21，它可以經操作而密封管道20，由此密封輸出血袋19。提供了另一個蠕動泵(未示出)，用于將腔室6的內容泵入輸出血袋19。腔室6和管道7、20和輸出血袋19是一次性的物品，在每個程序后可以丟棄。在操作中，用戶將輸出血袋19、腔室6和管道7、20插入設備1。管道20經過熱密封器21和蠕動泵。管道7經過另一蠕動泵和庫爾特計數器流路池9。用戶也插入含有病人血樣的血袋4并將其附著于管道7。除了上述以外，用戶將腔室6的管道15附著于無菌濾膜13。然后用戶關閉外殼2的前面板3，并用該設備的鍵盤啟動設備1。設備l自動稱量輸入血袋4。輸入血袋4的重量自動發(fā)送到位于設備1中的中央計算系統(tǒng)(未示出)。根據輸入血袋4的重量，計算系統(tǒng)可以確定設備1的血液體積。然后蠕動泵將血液經過管道7從輸入血袋4中拉出。血液流經管道7的透明窗，庫爾特計數器9確定通過管道7的細胞濃度。庫爾特計數器直接將信號發(fā)送至中央計算系統(tǒng)。中央計算系統(tǒng)從計算的血液體積和細胞濃度確定需要通過注射器10、11中的一個或多個注射至腔室6中的抗體的正確體積。蠕動泵繼續(xù)從血袋4中泵出血液，直到從中央計算系統(tǒng)接收到信號，該信號使泵停止。從中央計算系統(tǒng)發(fā)出的信號反應于從庫爾特計數器9發(fā)送到中央計算系統(tǒng)的信號，當庫爾特計數器9感覺到沒有細胞再經過窗口8時發(fā)出該信號.中央計算系統(tǒng)然后向附著于注射器10、11的步進電機(未示出)發(fā)出信號，使注射器10、11中的一個或多個通過管道15向腔室6中遞送計算體積的抗體.然后選擇性通過打開閥門16從二氧化碳入口14引入二氧化碳(閥門16的開關機制可以通過中央計算系統(tǒng)控制).加入的二氧化碳量由中央計算系統(tǒng)根據已知的腔室6、管道7、20和輸出血袋19中的體積以及從輸入血袋計算得到的血液體積進行計算。腔室6中的二氧化碳終濃度控制為約5%。通過管道15將二氧化碳引入腔室6。然后將二氧化碳吹過管道15中的任何剩余抗體，保證所有釋放的抗體被加入腔室6。一旦輸入血袋4排空，就成為氣囊，用于容納二氧化碳引入后額外的氣體體積。該設備可以進一步包含一個在中央計算系統(tǒng)控制下的加熱器(未示出)，該加熱器位于腔室6下面，將腔室6的溫度控制在25-37'C。與加熱器連接的恒溫器防止過度加熱或加熱不足。然后將血液和抗體試劑在腔室中孵育一段預定的時間。適當地，孵育時間不超過24小時，優(yōu)選4-8小時，選擇的時間應該足夠允許發(fā)生逆向分化。在孵育期間，葉片式臂17緩慢旋轉，以便混合抗體和血液。當完成孵育后，葉片式臂17繼續(xù)旋轉，并作為刮器臂，去除附著于腔室6表面的細胞并因此促進細胞的收獲。蠕動泵將腔室6的內容物(即含有未分化細胞，即干細胞的血液)從腔室6的底部拉出，使其進入輸出血袋19,該泵繼續(xù)泵出，直到測量體積的血液(通過使用校準的蠕動泵確定)進入了輸出血袋19。最后，熱密封器21夾住管道20，使管道20的一段約2cm的長度被密封，然后密封器21在密封處的大約中間位置切斷管道20。然后設備1可以提醒用戶該過程完成。然后用戶可以取出輸出血袋19.可以棄去腔室6、管道7、20和輸入血袋4。如果需要，輸出血袋19可以被轉移至一個純化系統(tǒng)中，例如用于鑒定具有未分化細胞的特征性細胞表面標記的細胞的系統(tǒng)，盡管外形改變也可以用作指示?？梢杂眉兓到y(tǒng)去除抗體試劑和/或也可以任選富集未分化(干)細胞。適當的純化系統(tǒng)是CliniMACs/Isolex系統(tǒng)。II.未分化細胞和分化細胞體內由許多未分化細胞和分化細胞，本領域有許多關于它們的普通教導。關于造血細胞系，可以參考例如，但不限于LevittandMertelsman1995(HaematopoieticStemCells,publishedbyMarcelDekkerInc-especiallypages45—59)andRoittetal.(Immunology,4thEdition,Eds.Roitt，BrostoffandMale1996，Publ.Mosby-especiallyChapter10)。未分化細胞是一種不成熟細胞，它不表現成熟的分化特征，但可以產生表現成熟的分化特征的后代。未分化細胞的一個眾所周知的例子是干細胞。干細胞是一種未分化的不成熟細胞，能夠自我更新(無限制分裂)和分化(特化)。發(fā)育中的胚胎有許多未成熟細胞；然而，在發(fā)育過程中它們的數目不斷減少。相反，成體生物含有有限數量的干細胞，局限于某些體腔中，一般認為干細胞是單能的、雙能的或多能的。單能和雙能干細胞在發(fā)育中更受限制，并分別產生一種或兩種類型的特異細胞。相反，多能干細胞(PSCs)可以分化成許多不同類型的細胞，產生組織(由其構成器官)或在全能干細胞的情況下，形成整個生物體。多能干細胞與單能或雙能干細胞不同，它可以進行多系分化，產生由不同類型或細胞系的細胞集合組成的組織。造血干細胞是存在于髓細胞中的多能干細胞的一個例子，它可以產生各種血細胞(包括白細胞和紅細胞)。血液是一種組織液，含有淋巴細胞(Ly)、單核細胞(Mo)、中性粒細胞(Ne)、嗜堿性粒細胞(Ba)、嗜酸性粒細胞(Eso)、血小板(PI)和紅細胞(Rbc)，見圖3。特化的組織由造血干細胞(Hsc)的分化產生?？偟恼f來，白細胞抵抗感染(在大循環(huán)中)，而紅細胞(在小循環(huán)中)在身體中運輸營養(yǎng)物、氧和廢物。以前，造血干細胞通過從(i)骨髓、(n)轉移生長因子的外周血或(Ui)臍帶血(胎盤)中分離而提取造血干細胞。最近，已經從胚胎干(ES)細胞制備了造血干細胞，它們用體外受精技術從胚胎提取。這些未分化細胞可以多系分化和重建所有身體組織，即，是多能的。上面提到的提取方法是麻煩的，有時是危險的，并且在某些情況下被爭論為不符合倫理，特別是在胚胎干細胞提取方法中。有許多造血細胞系的未分化干細胞。這些包括多能干細胞(PSCs)、淋巴樣干細胞(LSCs)和髓細胞樣干細胞(MSCs)，集中稱作淋巴造血祖細胞(LPCs)。LSCs和MSCs都是由PSCs的分4匕形成.因此，LSCs和MSCs比PSCs更定型。造血系的未分化細胞包括T細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、巨核細胞、單核細胞、紅細胞、粒細胞、肥大細胞和、淋巴細胞；T細胞和B細胞由LSCs的分化形成。所以，T細胞和B細胞比LSCs更定型。更具體地，分化鏈為LSC—原B細胞(pro-B-cell)或前胸腺細胞。原B細胞—前B細胞(pre-B-cell)一成熟B細胞—漿細胞。前胸腺細胞—普通胸腺細胞—成熟胸腺細胞(輔助/誘導或細胞毒/抑制細胞系)-見圖4。嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、巨核細胞、單核細胞、紅細胞、粒細胞、肥大細胞、NK細胞和淋巴細胞由MSCs的分化形成。所以，這些細胞中的每一種都比MSCs更定型。更具體地說，分化鏈為MSC—未成熟成巨核細胞(—成巨核細胞—巨核細胞—血小板)或前成紅細胞(—成紅細胞—網狀細胞—紅細胞)或髄細胞單核細胞干細胞，即分化成原粒細胞(—早幼粒細胞-中幼粒細胞—粒細胞)或成單核細胞(卄幼單核細胞—單核細胞—巨嗜細胞)的雙能干細胞-見圖5已經廣泛堅定了血細胞生成的分化途徑，根據外形和細胞系特異的細胞表面標記容易識別各種細胞階段(如下)。其他干細胞包括可以產生神經無、星形細胞和寡突細胞的神經干細胞、多能干細胞(NakafukuandNakamura,1995,J.NeurosciRes.，vol41(2):153-68;Anderson,1994，FASEBJ.，vol8(10):707-13;Morsheadetal.,1994，Neuron,Vol13(5):1071-82)。骨骼肌衛(wèi)星細胞是另一種類型的干細胞，更具體說是肌原細胞的一種獨特類型，可以在成人中保持為靜止的干細胞，并可以在需要時產生新的肌肉細胞(Bischoff，1986，DevBiol.,vol115(1):129-39)。其他類型的干細胞是上皮干細胞、基細胞的一種亞型、內皮干細胞和間充質干細胞。一種非常重要的干細胞類型是胚胎(ES)干細胞.這些細胞已經被廣泛研究并鑒定，實際上，ES細胞被常規(guī)用于產生轉基因動物。已經證明ES細胞在體外分化為一些細胞類型，包括淋巴細胞前體(Potocniketal.,1994，EMB0J.，vol13(22):5274-83)和神經細胞。US5，843，780和US6，200,806公開了靈長類ES細胞的分離。ES細胞的特征在于許多階段特異性的標記，如階段特異性胚胎標記3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81以及堿性磷酸酶(Andrewsetal.,1984，Hybridoma,vol3:347-361;Kannagieta/.1983，EMBOJ.，vol2:23n361;Foxetal.,1984,Dev.Biol.,vol103:263-266;Ozawaetal.，1985，Cell.Differ.,vol16:169-173)。許多抗原與未分化細胞和分化細胞相關."相關"在此處表示細胞表達或可以表達、或呈遞或可以被誘導為呈遞、或包含各自的抗原。大多數未分化細胞和分化細胞包含主要組織相容性(MHC)I類抗原和/或II類抗原。如果這些抗原與這些細胞相關，那么它們被稱作I類+和/或II類+細胞。每種與未分化細胞或分化細胞相關的特異性抗原可以作為一種標記。因此，不同類型的細胞可以根據其相關的特定抗原或根據相關抗原的特定組合而互相區(qū)分。這些標記抗原例子包括抗原CD34,CD19和CD3,如果存在這些抗原，那么這些特定細胞分別被稱作CD34+,CD19+和CD3'細胞.如果不存在這些抗原，那么這些細胞分別^皮稱作CD34_,CD19—和CD3—細胞。更具體地，PSCs為CD34+DITTdT—細胞(其他有用的標記是CD38—和CD36+)LSCs是DR+，CD34+和TdT細胞(也是CD38+)。MSCs是CD34一,DR+，CD13+，CD33+，CD7+和TdT+細胞。B細胞是CD19+，CD21+，CD22+和DR—細胞。T細胞是CD2+,CD3+和CD4+或CD8+細胞。未成熟淋巴細胞是CD4+和CD8+。激活的T細胞是DR+細胞。天然殺傷細胞(NKs)是CD56+和CD16+。T淋巴細胞是CD7'細胞。淋巴細胞是CD45+細胞.粒細胞是CD13+和CD33+細胞。單核細胞巨嗜細胞是CD14—和DR+細胞。其他的詳細內容見圖4和圖5。胚胎干細胞表達SSEA-3和SSEA-4，高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81和堿性磷酸酶。它們也不表達SSEA-1，SSEA-1的存在是分化的指示。已知其他類型的干細胞的標記，例如神經上皮干細胞的Nestein(J.Neurosci,1985，Vol5:3310).間充質干細胞是SH2，SH3,CD29，CD44,CD71,CD90,CD106，CD120a和CD124等陽性的，而CD34,CD45和CD14陰性。作為選擇或補充，許多細胞可以通過外形特征鑒定?？梢杂蔑@微鏡，并任選使用染色技術鑒定細胞是稱作組織學的科學的一種得到很大發(fā)展的分支，相關技術人員已經廣泛掌握了該技術。清楚的細胞染色將僅僅在細胞的等分物中進行，以證實其特征，因為一般說來染色會導致細胞死亡。因此，通過尋找以上列舉的抗原標記的存在，可以鑒定某些細胞類型(即該細胞是分化細胞還是未分化細胞)，以及特異的細胞類型(即該細胞是T細胞還是B細胞)。未分化細胞可以包含任何與抗原呈遞、捕獲或識別相關的任何成分。優(yōu)選地，未分化細胞是MHCI類+和/或MHC11類+細胞更定型細胞可以包含任何與抗原呈遞、捕獲或識別相關的任何成分。優(yōu)選地，更定型細胞是MHCI類+和/或MHCII類+細胞。更定型細胞可以是來源于未分化細胞或可來源于未分化細胞的任何細胞。例如，更定型細胞可以是淋巴樣干細胞或髓細胞樣干細胞，未分化細胞是多能干細胞。在另一種優(yōu)選實施方案中，更定型細胞是分化細胞，例如CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，BFC-E細胞，CFC-E細胞，T細胞，B細胞，嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨核細胞、紅細胞，未分化細胞是髓細胞樣干細胞、淋巴樣干細胞或多能干細胞。如果更定型的干細胞是一種分化細胞，那么分化細胞優(yōu)選是B淋巴細胞(激活的或未激活的)、T淋巴細胞(激活的或未激活的)、巨嗜細胞單核細胞系的細胞、能夠表達I類或II類抗原的有核細胞、可被誘導表達I類或II類抗原的細胞或無核細胞(即不含有細胞核的細胞，例如紅細胞)。在另一種優(yōu)選實施方案中，分化細胞選自大顆粒淋巴細胞、棵淋巴細胞和天然殺傷細胞，每一種都表達CD56和/或CD16細胞表面受體。分化細胞甚至可以由有核細胞去核產生。111.試劑試劑可操作性涉及更分化的細胞，以便使該細胞逆向分化為分化細胞。在這一點上，用于使更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑可以直接或間接涉及更定型細胞。該試劑可以在更定型細胞內起細胞內作用。然而，該試劑優(yōu)選在更定型細胞外起作用。直接涉及的一個例子是更定型細胞的表面具有至少一種細胞表面受體，如具有同源區(qū)的P鏈(通常發(fā)現具有相同或相似序列的區(qū)域)的細胞，所述同源區(qū)如B細胞上的同源區(qū)，其中該試劑直接涉及細胞表面受體。另一例子是更定型細胞的表面具有細胞表面受體，如具有同源區(qū)的cc鏈(通常發(fā)現具有相同或相似序列的區(qū)域)的細胞，所述同源區(qū)如T細胞上的同源區(qū)，其中該試劑直接涉及細胞表面受體，間接涉及的另一個例子是更定型細胞的細胞表面具有至少兩種細胞表面受體，該試劑涉及其中之一會影響另一種受體，這隨后誘導更定型細胞的逆向分化。使更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑可以是化合物或組合物。然而，該試劑優(yōu)選可以涉及更定型細胞表面的細胞表面受體。這樣，在一種優(yōu)選實施方案中，該試劑可操作性涉及一種存在于更定型細胞表面的受體一該受體可以由更定型細胞表達，如可以由定型細胞表達的受體。例如，優(yōu)選試劑包括任意一種或多種環(huán)腺苷酸(cAMP)、CD4分子、CD8分子、T細胞受體的部分或全部、配體(罔定灼或游離的)、肽、T細胞受體(TCR)、抗體、交叉反應性抗體、單克隆抗體、或多克隆抗體。也可以使用生長因子，如造血生長因子，例如紅細胞生成素和粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)。如果該試劑是抗體、交叉反應性抗體、單克隆抗體或多克隆抗體，那么該試劑優(yōu)選是MHCII類抗原的P鏈，MHCHLA-DR抗原的p鏈，MHCI類或n類抗原的ot鏈、HLA-DR抗原的ct鏈、MHCII類抗原或MHCI類抗原的a和p鏈的任意一種或多種的抗體、交叉反應性抗體、單克隆抗體、或多克隆抗體中的一種或多種。適當抗體的一個例子是CR3/43(由Dako提供)。名詞"抗體"包括保持結合活性的各種片段(由蛋白水解剪切或重組技術)和f汙生物，如Fab，F(ab')2和scFv抗體，以及其模擬物或生物異構體?？贵w也包括基因工程變體，其中一些氨基酸序列經過了修飾，例如通過取代氨基酸殘基增加了結合，其中抗體產生于需要根據本分明的方法處理的細胞以外的生物物種，以減少不良免疫反應的可能性(一個例子是"人源化，，小鼠單克隆)。用于實現將更定型細胞轉化為未分化細胞的試劑優(yōu)選在更定型細胞外起作用。具體地，更定型細胞優(yōu)選包含可以由該試劑操作性涉及的受體，該試劑可操作性涉及該受體。例如，該受體可以是細胞表面受體.細胞表面受體的特定例子包括MHCI類和II類受體。優(yōu)選地，該受體包含ot成分和/或P成分，如同MHCI類和MHCII類受體的情況。更優(yōu)選地，該受體包含具有同源區(qū)的e鏈，例如至少具有HLA-DRP鏈的同源區(qū)。更優(yōu)選地，該受體包含具有同源區(qū)的a鏈，例如至少具有HLA-DRoc鏈的同源區(qū)，該受體優(yōu)選為主要組織相容性復合物(MHC)的I類或II類抗原.在優(yōu)選實施方案中，細胞表面受體是HLA-DR受體，DM受體，DP受體，DQ受體，HLA-A受體，HLA-B受體，HLA-C受體，HLA-E受體，HLA-F受體，或HLA-G受體中的一種或多種。在更優(yōu)選的實施方案中，細胞表面受體是HLA-DR受體.該試劑優(yōu)選是受體的抗體，該試劑更優(yōu)選是單克隆抗體。該試劑的另一種優(yōu)選的例子是調節(jié)MHC基因表達，如MHCI類+和/或匪C11類+表達的試劑。在一種優(yōu)選實施方案中，該試劑與生物反應調節(jié)劑聯用。生物反應調節(jié)劑的例子包括烷化劑、免疫調節(jié)劑、生長因子、細胞因子、細胞表面受體、激素、核酸、核苷酸序列、抗原或肽。優(yōu)選的烷化劑是環(huán)砩酰胺或包含環(huán)磷酰胺。其它優(yōu)選的生物反應調節(jié)劑包括可以上調MHCI類和/或MHCII類抗原表達的化合物。在一種優(yōu)選實施方案中，這可以使與MHC受體結合的試劑更有效地工作。由于任何細胞類型都可用于表達MHCI類和/或MHCII類抗原，應該提供一種用于使許多種細胞逆向分化的方法，不論它們是否組成型表達MHCI類和/或MHCII類抗原。IV.使細胞逆向分化的方法在本發(fā)明的方法中，使一群包含定型細胞的細胞與可操作性涉及細胞群中的一種或多種定型細胞的試劑接觸。然后孵育該細胞群，以便允許由該試劑涉及的試劑發(fā)生逆向分化過程，并最終成為未分化細胞。該接觸步驟優(yōu)選包含涉及以下一種或多種的試劑I類抗原oc鏈的同源區(qū)、II類抗原oc鏈的同源區(qū)、CD4細胞表面受體、CD8細胞表面受體、淋巴細胞存在下II類抗原P鏈的同源區(qū)、淋巴細胞存在下I類抗原(x鏈的同源區(qū)、或淋巴細胞存在下II類抗原a鏈的同源區(qū)。接觸步驟優(yōu)選在生物反應調節(jié)劑(見前面的描述)的存在下進行。一般地，細胞群來自于生物樣品，如血液或相關組織，包括骨髓、中樞神經系統(tǒng)或周圍神經系統(tǒng)的神經元組織、肌肉組織、皮膚的表皮和/或真皮組織(例如口腔刮片)。生物材料優(yōu)選是出生后來源的。優(yōu)選使用全血或其加工產物，如血漿或血塊黃層，因為從受試者中取出它們可以在最少的醫(yī)學監(jiān)督下進行。一般用抗凝劑如肝素或檸檬酸鹽處理血樣，可以對血樣中的細胞進行處理，以富集某些細胞類型，去除某些細胞類型或從組織團塊中解離某些細胞。用于純化和分離細胞的有用方法包括離心(如密度梯度離心)、流式細胞術和親和層析(如采用包含細胞表面標記的單克隆抗體的磁珠或淘選)(見VetteseDadeyTheScientist(Sep.131999)13(18):21)。例如，Ficoli-Hypaque分離可用于去除紅細胞和粒細胞，以便留下具有單個核的細胞，如淋巴細胞和單核細胞，由于細胞基本是原代培養(yǎng)物，必須給細胞群提供適當的營養(yǎng)物以維持存活力，適當的培養(yǎng)條件是本領域技術人員公知的。然而，對細胞群的處理優(yōu)選在從病人中取出生物樣品后立即，一般12小時內，優(yōu)選2-4小時內開始?？梢杂霉夹g，如臺藍排除法檢查細胞存活力。一般用試劑將細胞群孵育至少2小時，一般2-24小時，優(yōu)選2-12小時，孵育溫度一般從大約室溫至約22iC，最多至約37X:,包括33"C?？梢詮臉悠分腥〕鲆粋€很小的等分物，用顯微鏡和/或流式細胞術檢查細胞，從而檢驗逆向分化程序的進展。或者，該設備可以包含跟蹤工具，以便在線監(jiān)測逆向分化程序的進展.一旦所需細胞類型的相對數目增加到適當的水平，例如低至0.1%或高達5%，可以以各種方式使用得到的改變的細胞群。對于形成的未分化細胞的數目，重要的是了解干細胞的增殖能力。盡管在一些環(huán)境中，干細胞或形成的其它未分化細胞的數目可以很低，研究表明僅50%的多能造血干細胞就可以在供體小鼠中重建完整的造血系統(tǒng)，所以治療用途不需要形成大量細胞。也可以通過給予患者與藥物栽體或稀釋劑混合的試劑而體內進行更定型細胞向未分化細胞的轉化。然而在許多情況下逆向分化在體外/離體進行。隨后可以使用在體外獲得的經處理的細胞群，而只需要很少的處理。例如，它們可以是簡單地與一種可藥用載體或稀釋劑組合，并給予需要干細胞的患者。然而，可能需要從細胞群中富集未分化細胞，或從細胞群中純化細胞。這可以通過許多方法方《更地進行(見Vattese-Dadey-TheScientist13(18):21Sep1999)。本發(fā)明的i殳備可以任選包含純化或分離工具，用于富集所述未分化細胞或從改變的細胞群中回收所述未分化細胞。例如，可以用層析和/或流式細胞術根據細胞表面標記而純化細胞。然而，通常既不必要也不需要從細胞群中廣泛純化未分化細胞，因為細胞群中存在的其它細胞(例如基質細胞)可能保持了干細胞活力和功能。流式細胞術是一種用于在混合細胞群中鑒定細胞并分選細胞的確立的、可靠的和強有力的技術。因此，純化或分離工具可以包含流式細胞儀。流式細胞術是根據液體懸浮物中的顆粒的物理特征而操作的，可以通過一束光的探測區(qū)分這些顆粒。這些顆粒當然可能是細胞。物理特征包括細胞大小和結構，或者，近年來非常普遍的是用偶聯于熒光分子的單克隆抗體結合的細胞表面標記，Kreissegetal.，1994，J.Hematother3(4):263-89中提到，"由于可以獲得抗CD34單克隆抗體，多參數的流式細胞術成為了一種判斷造血干細胞和造血祖細胞的可以選用的工具"，并且繼續(xù)描述了用于通過流式細胞術定量和鑒定表達CD34的細胞的普通技術。此夕卜，Korblingetal.,1994，BoneMarrowTransplant.13:649-54教導了根據HLA-DR表達而通過免疫吸附和其后的流式細胞術純化CD34+細胞。如前面所討論的，CD34+是與干細胞/祖細胞相關的有用標記。也已經有了根據其它物理特征分選干細胞的流式細胞術技術。例如，Visseretal.，1980,BloodCells6:391-407教導了可以根據大小和結構化程度分離干細胞。Groganetal.，1980，BloodCells,6:625-44也教導了，"可以從簡單造血組織中以高的和可證實的純度分選存活千細胞'，。除了根據細胞表面標記或其它物理特征的存在(正選擇)選擇細胞外，也可以用陰性標準富集、純化細胞群'例如，具有細胞系特異性標記如CD4，CD8,CD42和CD3的細胞可以通過流式細胞術或親和層析從細胞群中取出。用于純化細胞的一種非常有用的技術涉及使用與磁珠連接的抗體或其它親和配體。用具有細胞表面標記，如CD34的細胞群和細胞孵育磁珠，CD34捕獲親和配體，將含有細胞的樣品試管置于磁性樣品濃縮器中，磁珠被吸引至試管兩端。經過一次或多次洗滌步驟后，感興趣的細胞被部分或基本完全從其它細胞中純化出來。在負選擇中，并不是通過廢棄液相而洗滌與磁珠結合的細胞，而是將液相保留，然后有效地將與磁珠結合的細胞從細胞群中取出。定其上的適當標記的細胞類型,Urbankovaetal.,1996.(J.ChromatogrBBiomedAppl.687:449-52)教導了通過重力場流動分級分離從小鼠骨髓懸浮液中微量制備造血干細胞。Urbankovaetal.，1996進一步提到，該方法被用于從小鼠骨髓中鑒定干細胞，因為這些細胞比骨髄中的其它細胞大，所以可以從混合物中分離它們，所以細胞表面標記以外的物理參數可以用于純化/富集干細胞。通過本發(fā)明的方法產生的含未分化細胞和純化未分化細胞的細胞群可以用已知技術保持在體外。一般地，采用補加了哺乳動物血清如FBS,以及任選補加自體血漿的極限生長培養(yǎng)基如Hanks,RPMI1640，Dulbecco氏極限必需培養(yǎng)基(匿M)或Iscove氏改良Dulbecco培養(yǎng)基，以提供細胞生長的適當條件。在一種優(yōu)選實施方案中，在伺養(yǎng)層如基質細胞層上培養(yǎng)干細胞(見Deryuginaetal.，1993，CritRev,Immunology,vol13:115-150)。已經確認基質細胞分泌使祖細胞維持在未分化狀態(tài)的因子。干細胞的長期培養(yǎng)系統(tǒng)描述于Dexteretal.，1977(J.CellPhysiol,vol91:335)andDexteretal.，1979(Acta.Haematol.，vol62:299)。例如，Lebkowskietal.，1992(Transplantation53(5):1011-9)教導了可以用基于采用共價固定于聚苯乙烯表面的單克隆抗體的技術純化人CD34+造血細胞，通過該方法得到的CD34+造血細胞可以維持在大于85'/4的存活率。Lebkowskietal,，1993(J.Hematother，2(3):339-42)也教導了如何分類和培養(yǎng)人CD34+細胞。各種方法的綜述也見Haylocketal.，1994(Immunomethods，vol5(3):217-25),可以用許多體外測定，如CFC測定證實干細胞的身份(也見實施例)。通常用長期培養(yǎng)起始細胞(LTC-IC)測定來檢測非常原始的造血干細胞(Eavesetal.1991.J.Tiss，Cult.Meth.Vol13:55-62)'U"C-IC使造血維持5-12周。包含未分化細胞的細胞群和包含未分化細胞的純化制備物可以冷凍，以便以后使用。冷凍細胞和隨后使它們復活的適當技術是本領域公知的。本發(fā)明的設備可以任選進一步包含用于冷凍包含未分化細胞的細胞群和/或包含未分化細胞的純化制備物的冷凍工具。另一方面，逆向分化優(yōu)選發(fā)生于來自于血樣的血塊黃層的細胞或血塊黃層中的細胞。"血塊黃層"表示在紅細胞和血漿之間形成的白細胞層，以及當未凝固的血液被離心或允許靜置時的血漿。V.轉換細胞群中正常分化細胞的比例在正常組織中，各種類型的細胞，包括分化和未分化細胞的相對數目在某一時間通常是恒定的。例如，健康的21歲個體的白細胞計數一般是每升約8xl06ml，其中27。/4是淋巴細胞，6%是單核細胞，67%是粒細胞.這些細胞的水平(包括相對數目和絕對細胞計數)在疾病中受到干擾，例如患有慢性B細胞淋巴細胞白細胞(B-CLL)的病人中的情況?？梢詫⑷蜓獕K黃層鋪于histopaque以去除粒細胞，從而在例如單核細胞部分中干擾或轉換分化細胞的相對數目(即比例)，從而實現將分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中未分化細胞將自我更新(增殖)并重新分化為各種細胞類型以補充被轉換的細胞。也可以在例如血塊黃層(從健康的血液供體獲得)中去除(在密度梯度培養(yǎng)基中離心或用抗體包被的磁珠進行負選擇)紅細胞、血小板、粒細胞、單核細胞和T淋巴細胞后，干擾或轉換分化細胞的相對數目(即比例)，該處理可以稱作負選擇或某些分化細胞類型的富集，并且是轉換組織的一個例子。當在Iscove氏改良Dulbeccos培養(yǎng)基(ISDM)等含鉤培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞時，分化細胞將逆向分化為未分化細胞，未分化細胞將自我更新(增殖)并重新分化為各種細胞類型以補充被轉換的細胞。在此過程中首先發(fā)現細胞聚集成集落(進行同型細胞聚集)，以進行逆向分化。一旦更定型細胞轉化為未分化細胞，它們就獲得了增殖的能力，并且發(fā)展為各種重新分化的細胞類型，從而補充被轉換細胞的相對數目?？刹僮餍赞D換細胞群中正常分化細胞比例的逆向分化工具，例如，抗體(純的和偶聯的，即結合于固定和游離配體，如磁性、玻璃或聚苯乙烯珠)；Histopaque、LymphoPrep或用于才艮據細胞密度分離細胞的密度梯度培養(yǎng)基；或右旋糖苷(例如可以導致紅細胞沉淀).其它適當的逆向分化工具可以鑒定于Vettese-Dadey的一篇文章(見TheScientist(Sep.131999)13(18):21)。將被轉換細胞暴露于適當的螯合劑，包括EDTA，EGTA和肝素(所述螯合劑在可以稱作生物反應調節(jié)劑)可以導致甚至更定型細胞逆向分化為未分化細胞。例如，將被轉換細胞暴露于EDTA—段預定的時間，然后在含有可的松的含鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，可以使更定型細胞逆向分化為未分化細胞。這些細胞接著進行自我更新并參與一種新的分化途徑，產生紅細胞祖先，如爆發(fā)集落形成單位紅細胞類(BFU-紅細胞類)。紅細胞祖先可以被培養(yǎng)并在長時間內擴充，并且可用于紅細胞疾病和紅細胞缺乏的治療。VI.改變包含細胞群的培養(yǎng)基中的游離離子濃度將分化細胞暴露于EGTA等離子螯合劑一段時間，然后在含有氫化可的松的含努培養(yǎng)基，例如IMDM中培養(yǎng)這些細胞，可以導致更定型細胞逆向分化為未分化細胞。這些細胞接著進行自我更新并參與一種新的分化途徑，產生巨核細胞祖先，如集落形成單位-巨核細胞(CFU-Meg),并最終產生血小板.VII.未分化細胞重新定型的方法
技術領域：
：本發(fā)明的未分化細胞的一種重要應用是在組織重建，例如神經組織或造血細胞重建中的應用.這涉及由本發(fā)明的方法產生的未分化細胞的分化。它的進行可以通過僅僅給予患者未分化細胞，并允許患者體內的天然生理狀況影響分化，給予未分化細胞一般在特定感興趣的位點，如骨髓、脊髓或肺。這種方法的一個特定例子是造血系統(tǒng)的重建或補充，例如在CDV淋巴細胞減少的AIDS患者的情況中。另外，可以在體外實現分化(此處也稱作"重新定型")，然后擴充細胞，例如用于治療給藥。這一般是通過給予生長因子而進行的、例如，已經用視黃酸將ES細胞分化為神經元細胞，曱基纖維素處理后同骨髓基質細胞系和IL-7共培養(yǎng)已經用于將ES細胞分化為淋巴細胞前體(Nisitanietal.,1994，Int.Immuno.,vol6(6):909916)。LePage(NewScientist16December2000)教導了ES細胞可以分化為肺上皮細胞.Bischoff，1986(Dev.Biol.，vol115(1):129-39)教導了如何將肌肉衛(wèi)星細胞分^f匕為成熟肌纖維。神經前體細胞可以用堿性纖維生長因子和表皮生長因子進行擴充(NakafukuandNakamura.1995,J.Neurosci.Res.,vol41(2):153-168),造血干細胞可以用許多生長因子，包括GM-CSF、紅細胞生成素、干細胞因子和白介素(IL-l,IL3，IL-6)進行擴充——各種因子的綜述見Metcalf，1989(Nature,vol339:27-30)。Potocniketal.，1994(EMB0J.，vol13(22):5274-83)甚至證明了采用低氧(5%)條件使ES細胞分化為造血細胞。因此，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，將未分化細胞定型為重新定型的細胞，如分化細胞。重新定型的細胞可以是產生未分化細胞的更定型細胞的相同細胞系。另外，重新定型的細胞可以與產生未分化細胞的更定型細胞不同系。例如，B淋巴細胞可以逆向分化為CD34+CD3纊HLA-DR—干細胞。然后干細胞可以重新定型于B細胞系(同樣的細胞系)或淋巴細胞系(不同系)。未分化細胞定型為重新定型的細胞，例如分化細胞，可以以本領域技術人員公知的各種方式實現。已知通過采用特定方式，并且在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化細胞可以實現分化為選擇的細胞。僅僅是舉例說明，采用以下培養(yǎng)方法未分化細胞可以分化為心肌細胞第1天以正常密度將未分化細胞轉移至涂有明膠的板，以游離污染的成纖維細胞的培養(yǎng)物。為正常轉移，用胰蛋白酶消化細胞，直到集落離開.輕柔處理，以便使細胞保持松散連接成團塊.將細胞在無LIFES細胞培養(yǎng)基中以l:3直接鋪于細菌級Petri培養(yǎng)皿(如下)。第3天輕輕吸出培養(yǎng)基。避免吸出過多的聚集物。然后加入新的培養(yǎng)基，第5天如笫3天那樣吸出培養(yǎng)基，替換培養(yǎng)基。第7天將細胞鋪于24輪組織培養(yǎng)級平板。第9天改變一半的培養(yǎng)基并觀察跳動。第11天改變一半的培養(yǎng)基并觀察跳動。僅僅是作為例子，根據以下程序，未分化細胞可以分化為膠質細胞和神經元第1天以正常密度將未分化細胞轉移至涂有明膠的板，以游離污染的成纖維細胞的培養(yǎng)物.為正常轉移，用胰蛋白酶消化細胞，直到集落離開。輕柔處理，以便使細胞保持松散連接成團塊。將細胞以l:3在含lfiM全反式視黃酸的無LIFES細胞培養(yǎng)基中直接鋪于細菌級Petri培養(yǎng)皿(從Sigma得到)。第3天收集細胞聚集物并在無LIF或RA的ES細胞培養(yǎng)基中重新鋪于組織培養(yǎng)皿(每個6cm的組織培養(yǎng)皿約25個細胞聚集物)。輕輕吸出培養(yǎng)基。第8天改變一半的培養(yǎng)基.從這一天開始，至少10%的細胞表現出神經元表型。它們被曱酴紫特異性染色，并且對N-CAM抗原為強陽性。本領域技術人員應該容易了解實現將未分化細胞定型為任何所選擇的分化細胞的適當程序。本發(fā)明的未分化干細胞可以用任何常規(guī)的胚胎干(ES)細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)。僅僅是舉例說明，用于未分化細胞或ES細胞培養(yǎng)的適當培養(yǎng)基的細節(jié)如下<table><table>Lif放置于1ml的安瓿中，作為10'U/ml的LIFESGROAMRAD，它可以在100mlDMEM和10%FCS中稀釋，并在-20"C下以5ml的等分物儲存。對于BME，可以將0.1mlBME(14.4M)加入14.3mlPBS，用0.2的acrodisc過濾，并且在-2O^C下儲存最多1個月。另一種適當的培養(yǎng)基可以是例如PMEF培養(yǎng)基，IOO邊I的該培養(yǎng)基可以按以下具體制備:DMEM(GIBC0cat&國；11965-06288ml10%FCS10mlPen/Strep1mlL-谷氨酰胺1mlBME(0.1M)0.2ml用于培養(yǎng)ES細胞的其它適當培養(yǎng)基對本領域技術人員將是顯而易見的。VIII.用于鑒定逆向分化試劑的測定除了前面提到的試劑，可以用W096/23870或本發(fā)明的測定方法鑒定其它的試劑。另一方面，本發(fā)明也提供了用于鑒定可以將定型細胞/分化細胞逆向分化為未分化細胞的物質的方法，該方法包括使包含定型細胞的細胞群與候選物質接觸，并判斷所述細胞群中未分化細胞的相對數目是否增加，其中所述接觸在血塊黃層存在下發(fā)生。適當的候選物質包括與細胞表面受體結合的配體，如抗體產品(例如，單克隆和單克隆抗體，單鏈抗體，嵌合抗體和CDR移植的抗體)，例如與細胞表面受體結合的抗體.特別感興趣的細胞表面抗體在前面已經描述，包括MHC受體和具有CD名稱，如CD4和CD8的表面蛋白。其它與細胞表面受體結合的配體包括生長因子。此外，可以篩選組合文庫、肽和肽模擬物、確定的化學實體、寡核香酸、以及天然產物文庫作為逆向分化試劑的活性。候選物質可以批量用于最初的篩選，例如，每次反應篩選10種物質，將批量篩選中表現出抑制的物質進行個別檢驗。典型的測定包括將包含定型細胞的細胞等分物放置于適當的容器，如多孔板中.將候選物質加入孔中，將細胞在孔中孵育。孵育一般在大約室溫下進行，或從大約室溫開始，例如約221C至37X:，包括逆向分化可以通過取出細胞的一個小的等分物，并通過顯微鏡和/或流式細胞術判斷未分化細胞數是否改變而測量。一般地，未分化細胞數目改變的測定是通過監(jiān)測具有未分化細胞的特征性細胞表面標記的細胞數目改變而進行的，盡管外形改變也可以作為參考。適當細胞表面標記的例子包括CD34+。作為逸擇或補充，也可以監(jiān)測具有分化細胞的典型細胞表面標記，而不具有未分化細胞的典型細胞表面標記的細胞的數目減少，例如監(jiān)測具有細胞系特異性標記如CD3,CD4和CD8的細胞的相對數目減少。優(yōu)選地，具有未分化細胞的典型特征的細胞數增加發(fā)生在24小時內，優(yōu)選4-8小時內，因此這些改變不能完全由細胞增殖解釋。可能需要預篩選與例如細胞表面受體，如MHCI類或MHCII類受體結合的試劑。然后可以將任何被鑒定為與靶細胞表面受體結合的試劑用于上述測定，以判斷它們對逆向分化的作用。作為特例，可以用表達抗體結合域的噬菌體展示文庫鑒定與靶細胞表面標記如MHCII類受體P鏈的同源區(qū)結合的抗體片段(一般是scFvs)。適當的結合測定是本領域公知的，如同噬菌體展示文庫的產生和篩選。這些測定也可以用于鑒定最優(yōu)化的抗體或抗體片段，例如篩選已經表現出實現逆向分化的抗體衍生物的謙變文庫。IX.用途本發(fā)明提供了將定型細胞逆向分化為未分化細胞的方法和設備.具體地，本發(fā)明提供了從更分化細胞制備干細胞的方法和設備。它的臨床意義是巨大的，因為干細胞正在用于廣泛的治療用途，但迄今為止還是非常困難、麻煩，并且有時其獲得會受到倫理學的反對。根據本發(fā)明產生的干細胞可以用于在患者中恢復特定細胞群，如造血細胞群或其亞群，如CD4T淋巴細胞。用于產生干細胞的更定型細胞可以來自于同一病人或匹配的供體。因此根據本發(fā)明產生的干細胞可以用于治愈和重建特異細胞組織和器官。例如，未分化細胞可以用于產生定型細胞如被覆肺泡的細胞，因此產生了可以替代或修復破壞或病變肺組織的機制(見LePage,NewScientist19December2000:p20)。因此，根據本發(fā)明產生的干細胞可以引入患者，從而在體內恢復細胞.適當地，首先移植干細胞，然后恢復.因此，本發(fā)明也包括一種藥物，該藥物包含與適當稀釋劑、載體或賦形劑混合的由這些方法中的任意一種或該設備制備的未分化細胞。在一種實施方案中，包含未分化細胞的藥物可以用于產生有益的更定型細胞，如具有正確基因組結構的細胞，以便緩解具有錯誤基因組結構的更定型細胞導致或相關的癥狀或狀況。因此，本發(fā)明也提供了一種去除從更定型細胞荻得的突變的方法，該方法包括根據本發(fā)明的方法形成一種未分化細胞，將未分化細胞定型未一種重新定型的細胞，其中該細胞的基因組和/或核的排列或重排導致該突變被去除。該基因優(yōu)選被插入基因組的免疫球蛋白區(qū)或TCR區(qū)。本發(fā)明也提供了一種治療患有由缺陷細胞或不需要細胞導致的疾病或紊亂的方法，該方法包括通過使更定型鈿胞接觸導致更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑而制備未分化細胞，然后任選將未分化細胞定型為重新定型的細胞，其中未分化細胞，或重新定型的細胞影響缺陷細胞或不需要細胞，從而減輕該疾病或紊亂的癥狀，或治愈患有該疾病或狀況的病人。另外，可以用未分化細胞產生更定型細胞，該細胞產生一種實物，它可以治愈任何具有錯誤基因組結構的更定型細胞導致或相關的癥狀或狀況。例如，本發(fā)明可以用于制備由逆向分化為未分化細胞的更定型細胞表達的抗原的抗體或T細胞受體。在這一點上，抗原可以是胎兒特異性抗原或交叉反應性胎兒特異性抗原。本發(fā)明也包括控制未分化細胞和更定型細胞的水平的方法和設備。例如，本發(fā)明包括一種方法，該方法包括根據本發(fā)明的方法形成一種未分化細胞，然后激活一種凋亡基因，從而影響未分化細胞，例如使其死亡。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種將基因引入未分化細胞基因組的方法，其中該方法包括將基因引入更定型細胞，然后根據本發(fā)明的方法制備未分化細胞，由此該基因出現在未分化細胞中。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種將基因引入未分化細胞基因組的方法，其中該方法包括將基因插入更定型細胞的基因組中，然后根據本發(fā)明的方法制備未分化細胞，由此該基因出現在未分化細胞中。該基因可以是一種使未分化細胞和更分化細胞從其獲得更抗病原體感染如病毒感染的基因。具體地，例如，可以用艾滋病患者的B淋巴細胞產生干細胞，然后經工程化使其抗艾滋病感染。當進行擴充并引入患者中時，得到的輔助T淋巴細胞也可以抗HIV感染。在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及一種將基因引入未分化細胞的方法，其中該方法包括將基因插入更定型細胞的基因組中，然后根據本發(fā)明的方法制備未分化細胞，由此該基因出現在未分化細胞中。此外，本發(fā)明也包括本發(fā)明中用于制備未分化細胞的方法，其中該方法包括將未分化細胞定型為重新定型的細胞，然后將重新定型的細胞與骨髓瘤融合。這允許體外表達大量需要的產品，例如抗體或抗原或激素等。本發(fā)明包括用本發(fā)明的方法中的任意一種制備的未分化細胞。在另一種實施方案中，本發(fā)明的設備和/或方法可以用于有效培養(yǎng)紅細胞祖先，用于產生紅細胞，這些紅細胞可以用于例如補充血液供應的短缺。適當地，本發(fā)明的方法可以用于產生巨核細胞，以便用于產生血小板。在另一種實施方案中，本發(fā)明的設備和/或方法可以用于制備未分化細胞庫，即經過處理的細胞庫，本發(fā)明的其它方面包括本發(fā)明的任何一種試劑在從更定型細胞制備未分化細胞中的用途根據本發(fā)明的方法產生的未分化細胞在以下各方面的用途從B淋巴細胞或T淋巴細胞產生單克隆抗體或多克隆抗體或特異性抗體中的任意一種；產生巨噬細胞單核細胞系的細胞；產生能夠表達I類或II類抗原的有核細胞；產生可以被誘導表達I類或II類抗原的細胞；產生去核細胞；產生斷裂細胞；或產生凋亡細胞，根據本發(fā)明的方法產生的未分^ft細胞在從B淋巴細胞產生效應T淋巴細胞或反之中的用途。根據本發(fā)明的方法產生的未分化細胞在產生以下任意一種或多種物質中的用途藥物，如包含B淋巴細胞、L淋巴細胞的藥物或尤其制造的藥物、巨噬細胞單核細胞系的細胞、能夠表達I類或II類抗原的有核細胞；可以被誘導表達I類或II類抗原的細胞或去核細胞。本發(fā)明也包括利用前面提到的用途的方法，以及由這些方法制備的產品或組合物。本發(fā)明也包括一種藥物，該藥物包含本發(fā)明的未分化細胞或由其獲得的、與適當稀釋劑、載體或賦形劑混合的產品。在一種優(yōu)選實施方案中，該藥物包含一種與適當稀釋劑、載體或賦形劑混合的從本發(fā)明的未分化細胞獲得的抗體或抗原。該藥物優(yōu)選用于治療以下任意一種疾病癌癥、自身免疫病、血液病、細胞或組織退化、器官退化、器官或組織移植的治療、或先天性代謝疾病。本發(fā)明的方法和由這些方法獲得的產品，如未分化細胞，可以用于研究例如逆向分化、分化，以及鑒定并研究新開發(fā)的抗原和簇分化抗原■>X.給藥本發(fā)明的干細胞和重新定型的細胞，以及表現為可以逆向分化細胞的試劑，可以用于治療方法。本發(fā)明的細胞或試劑優(yōu)選與各種成分組合，以產生本發(fā)明的組合物。該組合物優(yōu)選與可藥用栽體或稀釋劑組合，以產生藥物組合物(可以用于人或動物)。適當的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖液。本發(fā)明的組合物可以用于直接注射給藥。該組合物可以經制劑化，用于胃腸外、肌內、靜脈內、皮下、眼內、口服或經皮給藥。包含細胞的組合物一般通過注射或抑制給藥.可以在懸浮液中或包埋于支持基質，如天然和/或合成的生物可降解基質中遞送.天然基質包括膠原基質。合成的生物可降解基質包括聚酐和聚乳酸。這些基質為體外的松散細胞提供了支持，優(yōu)選用于非造血細胞。遞送也可以是控制的遞送，即在從幾分鐘至幾小時或幾天的時間內進行控制的遞送。遞送可以是全身的(例如通過靜脈注射)或直接遞送至特定的目的位點。一般以1xio5-1x10'個細胞/kg的劑量給予細胞。例如，對于一個70kg的病人，為重建造血組織，可以給予14x106個CD34+細胞。這里描述的給藥途徑和劑量旨在僅僅作為一種直到，因為本領域技術人員可以容易判斷對于任何病人和狀況的給藥途徑和劑量，下面的所有詳細方法都適用于本發(fā)明的設備。A.材料和方法病人用含有EDTA的抗凝管從患有B細胞慢性淋巴細胞白細胞的病人、患有抗體缺陷(包括IgA缺陷和X連鎖嬰兒低y球蛋白血癥)的病人、具有HIV感染和艾滋病的病人、患有何杰金氏淋巴瘤的病人、患有急性T細胞白細胞的病人、患有blastcytosis的6日齡嬰兒、具有各種感染和臨床狀況的病人、健康血液供體的臍帶血、骨髓和富集的B淋巴細胞制劑獲得血樣。臨床和實驗室條件患者的臨床和實驗室治療條件，包括應用于它們的血樣的各種治療類型都描述于表l。用庫爾特計數器獲得示差白細胞(TOC)計數，這些都包括于相同的表l。血液的處理一旦獲得樣品，將其與HLA-DR抗原P鏈的同源區(qū)的純單克隆抗體(DAKO)—起引入腔室中，并且在室溫下混合最多24小時。一些樣品首先混合15分鐘，然后在22TC下在腔室中孵育。加入血樣的單克隆抗體的濃度為10—50nl/ml血液。此外，以同樣的濃度施加其它的處理，包括加入HLA-DR抗原a鏈的同源區(qū)的單克隆抗體、I類抗原的同源區(qū)的單克隆抗體、CD々的單克隆抗體、CD8的單克隆抗體、PE偶聯的HLA-DR抗原p鏈的同源區(qū)的單克隆抗體。其它處理包括同時向血樣中同時加入HLA-DR抗原a鏈和卩鏈的同源區(qū)的單克隆抗體。此外，將烷化劑如環(huán)磷酰胺與HLA-DR抗原卩鏈的同源區(qū)的純單克隆抗體組合加入血樣中，在這些處理之后，用一組標記的單克隆抗體，按照制造商的說明對血樣染色，然后用流式細胞術分析。與單克隆抗體的孵育期為2小時、4小時、6小時、12小時至24小時。標記的抗體通過流式細胞術，采用以下單克隆抗體檢測以下細胞上的標記CD19和CD3、CD4和CD8、DR和CD3、CD56&16和CD3、CD45和CD14、CD8和CD3、CD8和CD28、simultest對照(IgGlFITC+IgG2aPE)、CD34和CD2、CD7和CD13&33、CD10和CD25、CD5和CD10、CD5和CD21、CD7和CD5、CD13和CD20、CD23和CD57、以及CD25和CD45RA(Becton&DickensonandDAKO)。其它的標記可以包括CD71(紅細胞標記)、CD61(巨核細胞標記)、血型糖蛋白A(紅細胞標記)、AC133(干細胞標記)、CD38(原始干細胞標記)、CD90(干細胞標記)和CD117(多能干細胞標記)。每個患者的血樣，不論是處理過的還是未處理的，包括血塊黃層樣品，都采用本發(fā)明的設備中的多個上述標記抗體組進行分析，以便解釋伴隨不同處理類型的免疫表型改變，這些是在相同血樣的不同等分物中進行的。對未處理樣品和其它對照樣品進行染色并同時進行分析。流式細胞術根據制造商的說明對白細胞樣品進行染色和裂解。在FACScan錢上用simultest或PAINTAGATE軟件(BDIS)進行流式細胞術分析，該軟件包括陰性對照反向跟蹤。獲得了1000-20000個事件，并儲存在列表模式文件中。外形用顯微鏡和瑞氏染色分析外形。從富集的或純化的B-CLL(或正常的)淋巴細胞或從血樣的血塊黃層制備干細胞在以下程序中應該使用無菌技術(A)單核細胞分離(i)通過在flistopaque、Lymphoprep或任何淋巴細胞分離培養(yǎng)基(sp.grav1.077)上以400g離心30分鐘，從外周血/血塊黃層樣品中獲得單核細胞.(ii)收集單核細胞于50ml的錐形管中，用含有2%熱激活的胎牛血清(FCS)和2mMEDTA或0.6%種檬酸鹽的30ml漢克氏平衡鹽溶液(無Ca卜和Mg"，Sigma)洗滌，并且以400g離心10分鐘。(iii)洗滌后，用臺藍和血細胞計數器對細胞計數并評價其存活力。(iv)如果B細胞計數高于70%(20xioVL，WBC),直接進行A(vi),(v)如果B細胞計數低于70%(20xio7L，WBC)'用Macs微珠或FacsVantage純化技術進行負選擇，如以下C部分所描述。(vi)將細胞沉淀物以3x10Vml重懸于IMDM培養(yǎng)基(100jig/ml鏈霉素)，該培養(yǎng)基含有10%FCS(熱滅活的)和10%HS(熱滅活的)，采用20%—50%的自體血漿。在從B-CLL患者外周血樣品獲得的單核細胞部分中制備干(未分化)細胞按照上述單核細胞分離(A)方案，只是當白細胞計數超過20xlOVml，其中50%以上的白細胞為B細胞時，不應該進行負選擇。以下程序可以在本發(fā)明的設備中進行。(B)用純CH3/43(Dako)單克隆抗體處理細胞當在A(vi)中獲得了單核細胞分離后，進行以下步驟(i)將輸入血袋(從上面的A(vi)得到)掛在支持鉤上，(ii)采用具有6個孔的腔室，運行設備以從輸入血袋(從上面的A(vi)得到)加入2ml細胞懸浮液至該多孔培養(yǎng)盤或腔室的每個孔中。(iii)運行設備，處理適當數量的孔，從含有CR3/43mab的注射器向每孔加入99pl/ml(或對于血塊黃層樣品為49.5nl/ml)CR3/"(純單克隆抗體，Dako)，并且不處理其它孔(陰性對照)。(iv)在潮濕的環(huán)境下在50%C(h，37"C(或33X:)孵育腔室。(C)細胞純化已知許多分離和純化細胞的方法(見VetteseDadeyScientist13(18):21Sep131999)。一種適當的方法是用MACS微珠(MiltenyiBiotec，此處最好根據制造商的說明)對B細胞進行負選擇(i)按照A部分獲得單核細胞。(ii)沉淀細胞并以300fil/總共108個細胞的中體積重懸細胞于HBSS(含2%FCS和2邁MEDTA或0.6%檸檬酸鹽)。(iii)加入100jil/總共108個細胞的CD2的純單克隆抗體(IgGl，DAKO)。(iv)向同樣的細胞懸浮液中加入50fil/總共108個細胞的CD33的純單克隆抗體(IgGl，DAK0)。(v)使混合物在室溫下孵育IO分鐘。(vi)用HBSS(含2%FCS和2mMEDTA)洗滌細胞并用同樣的緩沖液以400nl/總共108個細胞的終濃度重懸在400g離心IO分鐘。在HBSS中重懸沉淀(同上)。(vii)加入lOOfil兔抗小鼠IgGl標記的微珠/總共108個細胞(或按照制造商的說明)。(viii)完全混合細胞并在6-12"(水箱)孵育15分鐘。(ix)用HBSS(含2%FCS和2mMEDTA)洗滌細胞，在400g離心IO分鐘，用同樣的緩沖液以500fil/總共108個細胞的終濃度重懸，(x)在MACS分離器的磁場中集中MS7RS'柱。如果單核細胞計數高，采用兩個MS7RS+柱。(xi)用3mlHBSS(含2%FCS和2mMEDTA)洗滌柱。(xii)使細胞過柱，然后用4x500jilHBSS(含2%FCS和2mMEDTA)洗滌。(xiii)洗脫并收集細胞于錐形管，然后沉淀并重懸于IMDM并置于如A部分(vi)的血袋中。D)FACSVantage純化B細胞(i)從B-CLL患者的外周血樣品中獲得單核細胞，如上述A部分所描述。(ii)用CD19-PE和CD20-FITC偶聯的單克隆抗體的組合對這些細胞染色，以鑒定B細胞。(m)根據CD19/CD20熒光，用BecktonDickensonFACSVantage和以488rnn發(fā)生的氬激光分選大約107個細胞。(iv)用含50MFCS的漢克氏平衡鹽溶液洗滌純化的細胞，并允許在潮濕的孵育器中，在5'/。C02，〃'C下回收過夜。(v)沉淀并重懸細胞，置于如A部分(vi)描述的血袋中，然后用上述B部分描述的CR3/43處理。在白細胞中制備干細胞可以在本發(fā)明的設備中用純CR3/43(Dako)單克隆抗體在白細胞中處理細胞(i)用30-200x107L的白細胞計數選擇病人(73-95y。的B淋巴細胞)。(ii)通過靜脈穿刺收集血液至無檸檬酸鹽、EDTA或防腐劑的含肝素試管中，將血液置于血袋中。優(yōu)選立即使用收集的血液，適當地，在收集后約6小時內使用。然而，在氮氣中儲存/冷凍的血液也可以在解凍后使用。(iii)將從(ii)得到的含全血的血袋放置于本發(fā)明的設備中。(iv)用庫爾特計數器進行自動的示差白細胞計數。優(yōu)選選擇白細胞計數為30-200x107ml(其中60-90°/為B細胞)的患者。(v)也可以自動評估血液的存活力，適當的方法包括碘化丙錠和流式細胞術或臺藍和血細胞計數器，然后用氯化銨溶液裂解紅細胞。(vi)在該設備的腔室中向全血樣品中加入CR3/43抗體，終濃度為1-3^11/106個細胞(例如，如果WBC計數為5t)xl07L，那么每ml血液應該加入50ji1CR3/43單克隆抗體，小鼠IgG濃度為159jig/ml)。(vii)用該設備腔室中的葉片徹底混合血液和抗體，在室溫，優(yōu)選18-371C下在孵育的腔室終維持預定時間，即不少于2小時。(viii)在加入mAbsO小時、2小時、6小時和24小時后，采用該設備的跟蹤工具，用流式細胞術、集落測定、長期培養(yǎng)和/或PCT分析血細胞。注意由于B細胞的同型聚集以及由于mAbCR3/"的誘導在試管底部形成了粘附細胞，應該在分析前用寬孔微移液管頭徹底混合和取樣。微量在分析過程中獲得統(tǒng)一的細胞群，在CR3/43處理前將血樣等分至多個腔室中。準備分析通過用CR3/43單克隆抗體處理培養(yǎng)的B細胞產生的干細胞用本發(fā)明的方法產生的干細胞可以在許多時間點進行評估，例如每2小時、7小時、24小時、每天、每7天或更長的時間段(用長期培養(yǎng)基每周補充給細胞后，每月進行)。在每個時間點分析一個或多個處理和對照孔，此后在連續(xù)的時間段分析剩下的處理和對照孔?？梢酝ㄟ^插入本發(fā)明的設備中的跟蹤工具自動進行評估，(i)用寬孔微移液管輕輕移去非粘附層，用寬孔微移液管重復吸取，破壞細胞團，從而獲得單細胞懸浮液.(ii)用細胞刮器刮去粘附層，用寬孔微移液管重復吸取，破壞細胞團，從而獲得單細胞懸浮液，(iii)或者，首先用HBSS沖洗，從而用胰蛋白酶消化粘附層，然后在每孔中加入2ml0.25%的胰蛋白酶，并且在37TC下孵育10分鐘。(iv)用寬孔微移液管重復吸取，輕輕破壞細胞團。(v)10分鐘后用20%的FCS孵育達到終濃度，從而滅活胰蛋白酶。(vi)可以將上述(ii)或(v)的每個時間點獲得的每種類型的(即處理和未處理細胞)培養(yǎng)細胞合并，并且在400g下離心10分鐘。(vii)為進行PCR分析(見C)，應該直接使用(vi)獲得的細胞沉淀(即處理和未處理細胞)。(viii)為進行集落測定分析，將上述步驟(ii)或(v)獲得的細胞沉淀(即處理和未處理細胞)重懸于含2%熱激活FCS的IMDM中.可以取出小的細胞等分物，對細胞計數，并且用臺藍和血細胞計數器評估它們的存活力。(ix)為進行FACs分析，將上逸步驟(ii)或(v)獲得的細胞沉淀(即處理和未處理細胞)重懸于含2%熱激活FCS和5mMEDTA的漢克氏平衡鹽溶液(無鉤和鎂)中。干細胞分析可以用以下方法評估干細胞.本發(fā)明的設備可以包括用于進行下面詳細討論的方法或其一部分的跟蹤工具。(A)免疫表型為進行全血樣品的免疫表型分析(使用流式細胞術)(i)免疫染色(根據制造商的說明)，溶解紅細胞并且在孵育期和用mAb處理后洗滌細胞.一般可以使用從BectonDickinson購得的溶解和洗滌溶液。(ii)應該用直接偶聯于異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅素(PE)的單克隆抗體標記紅細胞(位于全血、單核細胞部分、MACS負選擇的B細胞或分選出的B-CLL)。(iii)用于免疫表型分析的一組標記可以如下CD38PE+CD45FITC+CD34PE-Cy5CD19PE+CD10FITC+CD34PE-Cy5CD117PE+CD3FITC+CD34PE-Cy5CD33PE+CD61FITC+CD34PE-Cy5血型糖蛋白APE+CD71FITC+CD34PE-Cy5AC133PE+C訓FITC+CD34PE-Cy5CD19PE+CDSFITCIgGlPE+IgGIFITC+IgGlPE-Cy5(同種型陰性對照)(iv)可以進行采用IMK+試劑盒(BectonDickinson)的雙標記由以下單克隆抗體對組成CD45-FITC和CD14-PE;CD19-PE和CD3-FITC;CD8-PE和CD4-FITC;HU-DR-PE和CD3-FITCj以及CD56,CD16-PE和CD3-FITC。也包括IgGl-FITC和IgGa-PE.的同種型匹配陰性對照。(v)也可以使用Dalco和BectonDickinson生產的以下其它抗體PE偶聯的抗CD8，抗CD33,抗-13，抗CD34，抗CD19,抗CD2，抗CD14，抗CD33和抗CD5;FITC偶聯的抗CD3、抗CD7、抗IgM、抗CD22、抗CD20、抗CDIO、抗CD7、抗CD16、抗TCRaP。(vi)也可以使用下列抗體也可以使用CD34特異的親和純化的IgG3單克隆抗體(Dako)，它可以用FITC或PE標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白F(ab)、片段作為第二抗體(DAK0)。也使用Quantum紅(QuantumRed)(PE-Cy5)偶聯的抗CD34歸o)。(vii)用FACScan或FACSVantage(BectonDickinson)或任意其它流式細胞儀分析細胞.應該分析等量的100，000細胞并記錄時間。(viii)用ProprietaryPaint-a-Gate,LysisII，Consort30和CellQuest軟件分析數據。為進行血塊黃層樣品的免疫表型分析(用流式細胞術)，例如(i)免疫染色(根據制造商的說明)，溶解紅細胞并且在孵育期和用mAb處理后洗滌細胞。一般可以使用從BectonDickinson購得的溶解和洗滌溶液。Ui)應該用直接偶聯于異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅素(PE)的單克隆抗體單標記或雙標記紅細胞。適當地，可以使用以下被標記的標記CD34(干細胞標記)；CD19(B淋巴細胞標記)；CD45(白細胞標記)；CD3(T淋巴細胞標記)；CD33(中幼粒細胞)；CD71(紅細胞標記)；CD61(巨核細胞標記)；血型糖蛋白A(紅細胞標記)；AC133(干細胞標記)；CD38(原始干細胞標記)；CD90(干細胞標記)；CD10(淋巴樣干細胞標記)；CD117(多能干細胞標記)；IgGl(陰性對照)。(B)外形為進行外形分析光學顯微鏡(i)用寬孔移液管頭將細胞徹底重懸在含2%熱激活的FCS的IMDM中。(ii)在Leitz顯微鏡下進行，見察，采用適當的染色液，例如采用MayandGreenwald染色液分析髓細胞和淋巴細胞。本領域技術人員很容易了解其它適于鑒定其它集落的染色方法，例如瑞氏或吉姆薩染色。(iii)可以分別在血涂片或細胞離心制備物中進行B-CLL淋巴細胞的外形分析。共聚焦顯微鏡(i)按上述內容獲得B細胞(B-CLL或從健康血液供體的血塊黃層中獲得的健康B細胞)(ii)按上述內容用CR3/43單克隆抗體處理B細胞。(iii)向器官培養(yǎng)皿中加入2邁1細胞懸浮液(在該培養(yǎng)皿底部裝有蓋玻片)。(iv)加入15jilCD19FITC偶聯物的單克隆抗體，加入15filCD34PE/Cy5偶聯物(Quantum紅)的單克隆抗體。(v)用碘化丙錠估計存活力，用Hoechst對核進行染色。(D)VDJ/JHF基因重排的PCR分析用PCR(PerkinEl邁er熱循環(huán)儀)分析IgH基因的VDJ和/或JHF區(qū)，采用從抗體處理前和處理后(2小時、6小時和24小時)的B-CU外周血和血塊黃層樣品得到的模板DNA。該方案來自于Stoleetal(AmericanJournalofHematology38:l-8;1991)。JHF引物用于種系構型中免疫球蛋白重鏈基因的陽性檢測。JH6用作免疫球蛋白重鏈基因的陽性內部對照。白血病和正常淋巴細胞的B細胞中，JHF區(qū)總是被去除，因此不能被擴增，而內部對照JH6基因保持完整。P肌動蛋白基因用作對照.(i)用QiagenQiAmpMax血、液試劑盒從全血中分離基因組DNA采用最大產量方案。從每個樣品(處理的和未處理的)提取所有的DNA。(ii)在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行純DNA和1:5稀釋DNA的電泳。(iii)PCR-在961C下加熱2-3pL純基因組DNA模板5分鐘。I)JH6a/JH6gJHFa/JHFg根據下表的詳細內容制備足夠用于4名患者(處理和未處理的8個反應)的"mastermix"?？梢赃m當按比例方t大或縮小。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*在用于平衡樣品之前渦旋每個試管2-3次。向每個含有變性基因組DNA的試管中加入等量的95fiL"腦stermix，，。將熱循環(huán)儀設定在95"C下1分30秒；55X:下2分鐘；72'C下1分30秒(35個循環(huán))；72r下5分鐘(1個循環(huán))'II)p肌動蛋白制備足夠用于I)中所述8個反應)的"mastermix"?？梢赃m當按比例放大或縮小。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*在用于平衡樣品之前渦旋每個試管2-3次。向每個含有變性基因組DM的試管中加入等量的95nL"master邁ix"。將熱循環(huán)儀設定在95"C下1分30秒；551C下2分鐘；72'C下1分30秒(35個循環(huán))；72'C下5分鐘(1個循環(huán))。用于PCR的引物第一組設計用于擴增IgHJHF基因的240bp片段的引物如下JHFaAAAGGTGCTGGGGGTCCCCTGJHFbCCCAGTGCTGGAAGTATTCAGC第二組設計用于擴增IgHJHF基因連接區(qū)6的242bp片段的引物如下JH6aCATTGTGATTACTACTACTACTACJH6bGATCCTCAAGGCACCCCAGTGC第三組設計用于擴增P肌動蛋白基因的249bp片段的引物如下(3ACT-1AAGGCCAACCGCGAGAAGAT(3ACT-2TCGGTGAGGATCTTCATGAG(D)VDJ基因重排的DNA分析(i)用Ba邁HI/Hind11消化來自于處理的和未處理的外周血樣或純化B細胞(來自于B-CLL患者)---般需要用許多孔中的細胞得到足量的DNA以進行分析。(ii)將消化液溶解于0.8%的瓊脂糖凝膠中并根據制造商的說明轉移到GeneScreen⑧尼龍膜(Dupont)(Southern,1975)。(iii)用"P標記的從胎盤基因組DNA分離的人JHDM探針(Calbiochem，OncogeneScience)分析IgH基因座的J區(qū)，從而鑒定IgH基因的重排。(iv)將自顯影照片置于-70iC下幾天，然后顯影。(E)長期培養(yǎng)按上述方法制備的細胞培養(yǎng)物可以維持更長的時間段(長期培養(yǎng))，每周補充長期培養(yǎng)基(Iscove,s改良Dulbeccos培養(yǎng)基(畫M-GibcoBRLLifeTechnologiesLtd),10%熱激活的FCS，10%熱激活的馬血清(HS)，l'/a氫化可的松，1%青霉素/鏈霉素，5xi(TM原液)，(i)首先，在某個時間點，如24小時后，從CR3/43處理開始，通過在每孔中加入2ml長期培養(yǎng)基而稀釋細胞'(ii)在去除一半的生長培養(yǎng)基之后，每周向孔中加入培養(yǎng)基。(iH)用相差顯微鏡檢查各個孔。(F)集落測定(i)在處理開始的每個時間段后，可以按上述內容獲得300nl在培養(yǎng)基中的未粘附細胞。(ii)在上述培養(yǎng)基的細胞懸浮液中加入3mlmethocultGFH4434(Ste邁CellTechnologies,由含曱基纖維素的IMDM,FCS，BSA,L—谷氨酰胺，rh干細胞因子，rhGM-CSF，rhIL-3andrh紅細胞生成素組成)。(iii)取出l.lml細胞混合物并鋪板，共鋪3份。(iv)將板在潮濕的培養(yǎng)皿中，371C下5%C(h和55402中孵育M天。(v)用相差顯微鏡在CR3/43單克隆抗體處理前和處理后檢查各個孔。(vi)14天后可以用流式細胞術、共聚焦顯微鏡和/或PCR分析細胞(集落)。(vii)當進行集落測定時，應避免乙醇氣溶膠，因為這可以導致細胞聚集或破壞，阻礙兩種類型細胞的存活(處理的和未處理的)B.結果CD19和CD3組在本發(fā)明的設備中用HLA-DR抗原p鏈的同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣，總是減少CD19+細胞的相對數目。該標記為全B細胞抗原(見表)。該抗原存在于成熟的所有階段的所有人類B淋巴細胞上，但在最終分化的血漿細胞上則沒有。因此，這表明B細胞逆向分化為未分化細胞。同樣的處理導致CD3+細胞的相對數目劇烈增加，特別是在B-CLL的血液中更是如此，這總是伴隨CD3—CD19—細胞數目的相對增加，CD3存在于所有成熟T淋巴細胞和65%-85%的胸腺細胞上。發(fā)現該標記總是與a-Zp-或Y/5T細胞受體(TCR)關聯，這些復合物對于到細胞內部的信號轉導都是重要的。所以，這表明B細胞逆向分化為未分化細胞，然后重新定型為新的分化細胞，即T細胞。一種新的共表達CD19和CD3標記的細胞集落出現在處理過的B-CLL患者血液中，即CD19+和CD3+細胞(見圖表1，在開始治療2小時、6小時或24小時后的患者2、3和4)，該處理可以在本發(fā)明的設備中進行。其它具有不同狀況的患者表現出這些細胞集落的相對數目增加。這些細胞非常大，具有很多顆粒，并且在它們的細胞膜上表達極高水平的CD19,在這些細胞上表達的CD3標記水平似乎與在正常成熟淋巴細胞上表達的CD3標記水平相似。在表2中，患者數2、3和3是代表相同患者的試劑數字，他們的描繪僅僅是用于表示隨時間的對血液的處理效果(對于該患者的實驗室和臨床狀況見表l)。在經處理的樣品中的CD19+CD3+集落似乎隨時間而減少，在2小時、6小時和24小時達到未處理樣品中測定的原始水平。在經處理的樣品中檢測另一種大小和顆粒多少相同的細胞類型，這些細胞表面具有高水平的CD19表達，但沒有CD3標記，并且富含FC受體。然而，這些細胞的相對數目似乎隨時間減少。令人感興趣的是，在處理血樣后24小時(2，3和4)，在一組細胞中的CD19TD3—細胞的相對數目減少，而在處理血樣2小時和6小時后觀察到了該數目增加，然而，用HLA-DR抗原卩鏈的同源區(qū)的單克隆抗體處理后的血液中白細胞群的庫爾特計數減少。該發(fā)現提示該處理產生了不能由庫爾特計數檢測的不典型細胞(表l)，但可以被根據表面標記、大小和顆粒多少的流式細胞儀測量所計數。此外，這些不典型細胞可以在顯微鏡下用瑞氏染色進行外形分析而被計數。這些現象的流式細胞術圖表見圖表1、2、3和4，在血樣處理中獲得的免疫表型改變提示CD19+和CD3+淋巴細胞是一組交界的細胞，但基于與干細胞相比的CD19和CD3相對表達仍保持獨特。在表2中，患者號5和6代表同一個患者，但分別隨時間監(jiān)測處理和未處理血樣的分析，并且在同一時間監(jiān)測處理和未處理血樣的分析(見表1)?；颊叩难簺]有B細胞惡變，表示與B-CLL患者的血液有相似的免疫表型改變趨勢，但改變程度不同。然而，這些患者血液中B淋巴細胞和MHCII類陽性細胞的相對和絕對數目與B-CLL患者血液中的數目相比非常低。在對其血液進行處理后，兩個具有X連鎖嬰兒低y球蛋白血癥的缺乏B細胞的兄弟在CD3+細胞的相對數目方面表現出不同的免疫表型改變。弟弟為2個月大，沒有發(fā)病，處理他的血液時表現出CD3+細胞相對數目的輕微增加，并伴隨CD3—CD19—細胞相對數目的減少.另一方面，哥哥為2歲，病情十分嚴重，其表達DR抗原的激活的T細胞的數目相對高，并且在處理他的血液時表現出CD3+細胞數的減少.沒有采用其它標記測量其它可能出現的免疫表型改變，因為從這兩名患者中獲得血樣非常少(表2，ID43/BD和04/BD)。表2中的患者91在處理血液后表現出CD3+細胞相對數目的減少，它伴隨CD3—CD1^細胞相對數目的增加。然而，在分析其它表面標記如CD4和CD8(見表3)時，發(fā)現該患者的血液中具有相對高數目的CD4'CD8+細胞，這在用DR抗原p鏈的單克隆抗體處理血樣之前發(fā)現，并且這些雙陽性細胞在血液處理后顯著減少。此外，當分析其它標記時，發(fā)現CD3+細胞的相對數目增加(見表4)。當用DR抗原P鏈的單克隆抗體在本發(fā)明的設備中處理從健康的血液供體中得到的B淋巴細胞富集制劑時，表現出CD3+細胞相對數目的劇烈減少，并且總是伴隨CD19+細胞相對數目的減少和CD19—CD3—細胞相對數目的增加。用CD4和CD8等標記進行的進一步分析表明這些標記相對數目的同時減少。然而，當用同樣的單克隆抗體處理同樣的血液供體的T淋巴細胞富集制劑時，沒有表現出同樣的改變，CD4和CD8組CD4抗原是人免疫缺陷病毒的受體。CD4分子與MHCII類抗原在B2結構域結合，該區(qū)域類似于I類抗原的CD8結合位點。CD4與II類抗原的結合增強對抗原的T細胞反應性，CD8與I類抗原的結合也是如此。CD8抗原存在于人抑制/細胞毒T淋巴細胞亞型上，并且存在于天然殺傷(NK)淋巴細胞的一種亞型以及大多數正常胸腺細胞上.CD4和CD8抗原共表達于胸腺細胞上，這些細胞在成熟為T淋巴細胞時失去標記之一。在分析CD4和CD8時——見下文——從表2中列出的大多數血樣中可以看出，一種染色方式支持B淋巴細胞逆向分化為未分化細胞，并隨后分化為T淋巴細胞的存在，雙陽性細胞CD4+CD8+細胞總是在用DR抗原p鏈的單克隆抗體處理血液后出現，并且這些類型的細胞在B-CLL患者經處理的血樣中顯著增加，在未處理樣品中都不存在(見表3和圖表1、2、3和4)。在相同的樣品中，也注意到了單陽性細胞如CD8+和CD4+細胞的相對數目同時增加。此外，至少在B-CLL的情況下對應于B細胞的CD4—CD8—細胞相對數目的減少在處理樣品中與未處理樣品中相比顯著減少，當隨時間進行測量時，未處理樣品中保持相同水平。然而，處理樣品中隨時間對CD8+CD4+細胞相對數目進行的測量表明單陽性細胞的增加伴隨雙陽性細胞相對數目的減少。這種類型的免疫表型改變是胸腺中T淋巴細胞系的祖細胞的胸腺發(fā)育的特征(患者號2、3和4)。CD4抗原存在于輔助/誘導T淋巴細胞亞型上(CD4+CD3+)以及大多數正常胸腺細胞上。然而，該抗原在單核細胞的細胞表面和單核細胞以及巨噬細胞(CD3TD4+)中以低密度存在。低CD4+細胞的相對數目在本發(fā)明的設備處理后在不同血樣中受不同影響。該類型細胞的相對數目似乎在B-CLL患者的血樣中不受影響，這種低水平的CD4表達發(fā)現于單核細胞和非常早期的胸腺細胞。進行處理的HIV+25患者表現出同時表達CD4和CD8的雙陽性細胞的很大程度增加.另一方面，進行治療的患者91表現出這種亞型細胞的減少，并且這種現象的觀察是時間依賴性的。發(fā)現CD8+細胞的相對數目在B-CLL患者的未處理血樣中隨時間增加，同時發(fā)現CD4+和低CD4+細胞減少(表3,患者2、3和4)。DR和CD3組DR標記存在于單核細胞、樹突細胞、B細胞和激活的T淋巴細胞。用該組進行的處理和未處理樣品的分析表現出與用CD19和CD3標記分析樣品時相似的免疫表型改變(見表2)，這些前面提到過的抗原分別是全B細胞和T細胞標記。在本發(fā)明的設備中用單克隆抗體處理血液似乎影響DR+B淋巴細胞的相對數目，因此DIT細胞減少。相反，CD3+(T細胞)細胞的相對數目顯著增加(見表4和圖表)'此外，大多數經處理的B-CLL患者血樣中激活的T細胞的相對數目增加，這些類型的細胞在具有其它狀況的患者的經處理樣品中受到不同的影響。此外，DR高陽性細胞的相對數目在B-CLL患者以及血液中DR+CD34+未成熟細胞增加的6日齡嬰兒的經處理樣品中以顯著的數目存在。然而，應該注意，存在于該患者血液中的未成熟細胞在處理前和處理后對于T細胞和B細胞標i己是陰性的，但在處理后髓細胞系抗原的陽性更強，在大多數經處理的血樣中，CD3—DR-細胞的相對數目增加，并且與CD3+細胞(T細胞)的相對數目增加成正比，與DR+細胞(B細胞)的相對數目減少成反比。CD56&16和CD3組CD56&CD16標記存在于一組異源細胞、一種稱作大顆粒淋巴細胞和天然殺傷(NK)淋巴細胞的淋巴細胞亞型。CD16抗原表達于基本所有的靜息NK淋巴細胞，并且在一些來自于某些個體的CD3+T淋巴細胞上弱表達。已經發(fā)現該抗原在粒細胞上低量表達，并且與含大的嗜天青顆粒的淋巴細胞相關。CD16抗原是IgGFC受體III。各種數目的CD16+淋巴細胞共表達CD57抗原或低密度CD8抗原或這兩者。在大多數個體中，基本與其它T淋巴細胞抗原如CD5，CD4，或CD3抗原沒有重疊。CD56抗原存在于基本所有的靜息和激活的CD16+NK淋巴細胞，這些細胞亞型執(zhí)行非主要組織相容性復合物限制的細胞毒性。處理和未處理的B-CLL和一些其它狀況的患者的血樣免疫表型分析表現出表達CD56&CD16抗原的細胞數目增加，這些細胞具有許多顆粒，大小中等(見表5和圖表1、2、3、4)。這些觀察結果也伴隨僅僅表達CD3抗原(不表達CD56和CD16標記)的細胞以及共表達CD56&CD16和CD3標記的細胞的相對數目顯著增加。在表5中，患者號2，3，和4代表相同的血樣，但分別是在2小時、6小時和24小時進行分析(處理前和處理后)。該樣品表明用DR抗原卩鏈的單克隆抗體處理血液似乎導致自發(fā)產生CD56+和CD16+細胞，CD3f細胞和CD56+以及CD16+CD3+細胞，這些觀察結果總是伴隨B細胞標記(CD19,DR，CD56，CD16TD3，的消失。在處理前和處理后對該血樣進行的前向(onward)分析表示，CD56*和CD16+細胞水平隨時間減少，CD3+細胞的水平隨時間增加。相對于處理和未處理樣品中觀察到的免疫表型改變，B-CLL患者7的血樣沒有表現出表達CD56，CD16和CD3抗原的細胞數目改變，這是因為加入的單克隆抗體量與B'牀巴細胞的數目相比非常低，然而，在獨立的情況下用適量的單克隆抗體處理患者的血樣表現出CD、CD56+&CD16+和CD56+以及CD16+CD3+細胞的相對數目的顯著增加。具有其它狀況的患者的血樣表現出這些細胞水平的各種改變，這似乎取決于處理前、處理時存在的B淋巴細胞的數目，以及可能取決于該患者的臨床狀況。CD45和CD14組CD45抗原存在于所有人類白細胞，包括外周血、胸腺、脾和扁桃體中的淋巴細胞、單核細胞、多形核細胞、嗜酸性細胞和嗜堿性細胞，以及骨髓中的淋巴細胞祖細胞。CD14存在于70-93%的正常外周血單核細胞，77—90%的胸水和腹水巨噬細胞，該抗原在粒細胞上弱表達，并且不存在于未刺激的淋巴細胞、促有絲分裂劑激活的T細胞、淋巴細胞、紅細胞或血小板。CD45抗原代表一種蛋白酪氨酸磷酸酶，該分子與外部刺激(抗原)相互作用，并且通過Scr家族成員影響信號傳導，導致^胞生長和分化的調節(jié)。DR抗原p鏈在經處理的樣品，特別是從B-CLL患者中獲得的樣品中的參與提示，這種處理影響B(tài)淋巴細胞上CD45抗原的水平，發(fā)生在DR抗原p鏈的刺激上的總體免疫表型改變似乎產生不同類型的細胞，它們基于CD45和CD14的表達水平和外形而聚集，外形是通過正向散射和側向散射(分別確定大小和顆粒多少)確定的，這些結果表示于表6和圖表(1、2、3、4),也參見圖7，它證明了用CR3/43抗體處理后CD45—CD14—細胞的外形，這些細胞不是造血細胞。在用本發(fā)明的設備處理時，低CD45細胞的相對數目(與未處理樣品相比)顯著增加，共表達CD45和CD14抗原的細胞的相對數目也是如此。這種類型的免疫表型改變與高CD45細胞的相對數目減少(與未處理樣品相比)同時發(fā)生。然而，后一種細胞群可以根據外形和CD45的表達程度進一步區(qū)分，一種類型非常大，與圖表中表示的其它細胞(見圖表1、2、3、4)相比具有極高水平的CD45抗原.處理后隨時間分析該組(見表6，患者2、3和4，以及圖表l)，發(fā)現起初CD45—的相對數目隨時間劇烈減少，以產生低CD45細胞。然而，24小時后分析血液，發(fā)現相反的狀況。樣品5和7的免疫表型改變與從其它B-CLL患者獲得的其它樣品得到的結果相反，這是因為這些櫸品是在用單克隆抗體孵育的更早期進行的分析。實際上，對處理后血樣的序貫分析提示，B淋巴細胞進行的免疫表型改變是時間依賴性的，因為它代表發(fā)育的一個階段，在時間點X測量的免疫表型改變與時間點X以后不同(它并不是一旦誘導就固定).然而，這些類型的改變必須在身體中以更嚴格的方式發(fā)生，否則將發(fā)生免疫病。從沒有B細胞惡變的其它患者得到的血樣的處理效果在細胞的免疫表型方面表現出各種改變，這是因為B淋巴細胞以低量存在。然而，處理從健康血液供體得到的B淋巴細胞的富集部分表現出的免疫表型改變與具有B淋巴細胞高計數的B-CLL得到的免疫表型改變相似.CD8和CD3組CD8抗原決定簇與I類MHC分子相互作用，導致008+T淋巴細胞與乾細胞之間的粘附增加。這種類型的相互作用增強了靜息淋巴細胞的激活。CD8抗原與蛋白酪氨酸激酶(p56ick)偶聯，隨后CD8/p56ick復合物可以在T淋巴細胞激活中起作用。在本發(fā)明的設備中用B鏈的單克隆抗體處理從B-CLL患者獲得的血樣導致CD3CD8和CD3(很可能是CD4CD3)陽性細胞相對數目的顯著增加，因此更清楚地表明起初產生的雙陽性細胞正在發(fā)育為成熟的T淋巴細胞。這是一個可以用CD19和DR直接測量和用CD8TD3—抗原間接測量的過程。用同一患者經處理血樣所進行的隨時間的系列評估似乎與等同于胸腺細胞發(fā)育的過程一致(表7，患者2、3和4，以及圖表l)。CD8+細胞的相對數目在處理和未處理樣品中隨時間增加，但在未處理樣品中增加至更高的程度。另一方面，CD8+CD3+細胞的相對數目在未處理樣品中隨時間減少。然而，當隨時間進行測量時，處理血樣中CD3+細胞的相對數目增加，這些類型的細胞高度對應于CD4+CD3+單陽性細胞，即一種成熟形式的胸腺細胞。此外，由于這些樣品也用其它組(在表3、4、5和6中提到)進行了免疫表型分析，總體改變強烈表明B細胞參與T淋巴細胞祖先和后^的產生。對B-CLL患者得到的血樣(2、3和4號，表l、2、3、4、5、6、7)等分物不做處理，或用PE偶聯的DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體和同樣的單克隆抗體的非偶聯形式進行處理。比較PE偶聯的處理清楚表明，CD3陽性細胞和其它相關標記如CD4的相對數目沒有改變，而當同樣的血樣用抗體的非偶聯形式進行處理時觀察到了顯著水平。然而，當隨時間進行測量時發(fā)現CD45陽性細胞數目的增加，這些細胞表面沒有DR抗原表達(見表8)。當隨時間進行免疫表型分析時在未處理樣品中注意到了相似的結果(表6),而且，表達低CD45的細胞的相對數目隨時間減少，在同一患者的未處理樣品中(當隨時間測量)也注意到了該現象(見圖表1A)。來自于人血塊黃層樣品的細胞的FAC分析在本發(fā)明的設備中用CR3/43單克隆抗體處理血塊黃層樣品導致CD34(干細胞標記)的出現率更高，CD19(B淋巴細胞標記)的出現率更低一一見表21。集落形成測定發(fā)現在未處理樣品中，絕大多數集落是紅細胞類型，而在處理樣品中集落類型的改變更明顯，主要的集落類型是多能細胞集落，還有粒細胞/巨噬細胞和巨核細胞以及紅細胞集落形成單位。這些結果證明經處理的細胞更能夠沿其它淋巴造血途徑分化，產生各種特異的細胞系。C.比較對T淋巴細胞生成具有不同特異性的其它單克隆抗體的作用CD19和CD3組在本發(fā)明的設備中用DR抗原a鏈同源區(qū)以及MHCI類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣減少了CD3+細胞的數目，增加了CD19+細胞的數目。用DR抗原J3鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣減少了CD19+細胞的數目，增加了CD3+細胞的數目。用后一種單克隆抗體和環(huán)磷酰胺處理發(fā)現了同樣的作用(表14，B-CLL患者5/6,處理后2小時)。在同樣的樣品中進行的CD19+和CD3+細胞的前向分析表明，CD3*中進一步增加(表14，B-CLL患者5/6，處理后24小時)。然而，用環(huán)磷酰胺加DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的血樣的前向分析(表14，B-CLL患者5/6,24小時后)表明與同樣條件下在2小時的孵育時間下觀察到的CD19+和CD3+細胞的相對數目相反。總的說來，與未處理樣品相比，用DR抗原a鏈同源區(qū)的單克隆抗體或MHCI類抗原a鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣增加了CD19+細胞(全B標記)的相對數目。用DR抗原a鏈的單克隆抗體或I類抗原的單克隆抗體處理的血樣中CD19TD3-細胞的相對數目略微減少(見表14和圖表2、3、4)用I類抗原的單克隆抗體處理患者09的血樣增加了CD3+細胞的相對數目，略微減少了CD19+和CD19-CD3-細胞的相對數目.然而，用DR抗原a鏈或p鏈的單克隆抗體處理從健康的血液供體得到的B淋巴細胞富集制劑表現出的免疫表型改變與從B-CLL患者得到的免疫表型改變相似。用DR抗原p鏈的單克隆抗體處理HIV+和IgA缺陷患者增加了CD3'細胞的相對數目，減少了CD19'細胞的相對數目。然而，用I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理同樣的血樣沒有產生相同的作用.用DR抗原p鏈、I類抗原和CD4抗原的單克隆抗體處理從B細胞缺乏患者(34/BD和04/BD)獲得的血樣，表現出了各種免疫表型改變.CD4和CD8組也用CD4和CD8組對用CD19和CD3組(表19)進行過分析的血樣進行免疫表型分行(表15)。這兩組的結果似乎一致。用DR抗原卩鏈同源區(qū)的單克隆抗體或同樣的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺孵育B-CLL患者的血樣2小時(表15，患者5/6和10,圖表2、3和4)，增加了CD8+和CD4+細胞和共表達兩種標記的細胞的相對數目.另一方面，用DR抗原a鏈同源區(qū)或I類抗原ot鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理同樣的樣品不產生同樣的作用。比較用DR抗原卩鏈的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺醉育2小時和24小時后獲得的免疫表型趨勢，發(fā)現CD4和CD8陽性細胞相對數目的相反改變(表15，B-CLL患者5/6，2小時和24小時)，這種改變與用CD19和CD3組分析同樣血樣(表14，患者相同)所獲得的結果一致.后一發(fā)現表明，后續(xù)的分化是可逆的，因為未分化細胞可以分化為T淋巴細胞或B淋巴細胞。DR和CD3組用DR和CD3(表6)組獲得的免疫表型改變證實了由CD19和CD3組以及CD4和CD8組獲得的結果(表14和15以及圖表2、3和4),該結果是用DR抗原a或P鏈同源區(qū)的單克隆抗體或I類抗原的單克隆抗體，或DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺處理同樣的血樣后2小時分析的。從該結果中發(fā)現，DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體非常能夠導致從D1T細胞產生CD3陽性細胞。此外，例如涉及DR抗原a鏈或DR抗原P鏈與環(huán)礴酰胺的聯合參與(延長的孵育時間)的處理促進了CD19+細胞或DR+細胞相對數目的增加。CD56&16和CD3組在本發(fā)明的設備中用DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣，尤其是處理具有B淋巴細胞高計數的B-CLL患者增加了CD56&16陽性細胞的相對數目。在這些患者中，在用P鏈的單克隆抗體處理血樣后也增加了CD3+和CD56+以及CD16+CD3+細胞的相對數目，證實了早期同樣處理中用CD3和CD19以及DR和CD3組分析同樣的血樣時觀察到的結果。CD45和CD14組在本發(fā)明的設備中用DR抗原p或a鏈的單克隆抗體或p鏈的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺或I類抗原的單克隆抗體處理后的血樣也用CD45和CDH組進行了分析(表18)。對4氐CD45、高CD45和中等CD45的限定是權威的。用DR抗原(3鏈的單克隆抗體或用該單克隆抗體加環(huán)磷酰胺處理血樣5/6(在2小時)產生4氐CD45+細胞并增加中等CD45+細胞的相對數目。然而，前一種處理增加了高CD45+細胞的相對數目，后一種處理減少了中等CD45+細胞的相對數目，這些改變似乎是時間依賴性的。用I類抗原的單克隆抗體處理的患者5/6和10(B-CLL)的血樣表現出中等CD45+細胞相對數目的減少，在同樣處理之后的血樣09和HI^中與未處理樣品相比也注意到了相似的觀察結果，與未處理樣品或用DR抗原P鏈的單克隆抗體處理相比，用I類抗原的單克隆抗體處理HIV+和IgA/D患者的血樣增加了低CD45'細胞的相對數目。然而，這些患者的血樣在用DR抗原P鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理后表現出中等CD45+細胞相對數目的減少。在I類抗原的單克隆抗體處理后，IgA/D患者血樣中的中等CD45+細胞增加。在用MHCII類抗原的DR抗原卩鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的血樣中注意到了非常大的、顆粒非常多的、表達高水平CD45抗原的細胞(見圖表l、2、3、4)CD8和CD28組CD28抗原存在于大約60-80%的外周血T(CD3+)淋巴細胞、50%的CD8+T淋巴細胞和5%的未成熟CD3—胸腺細胞。在胸腺成熟過程中，CD28抗原表達從大多數CD4+CD8+未成熟胸腺細胞上的低密度增加至幾乎所有成熟CD3+、CD4+或CD8+胸腺細胞上的更高密度。CD"的表達也將CD8+淋巴細胞分為兩個功能組。CD8+CD28+淋巴細胞介導同種異體抗原特異性的細胞毒性，這是i類主要組織相容性復合物(MHC)限制的。細胞增殖的抑制由CD8+CD28-亞型介導。CD28抗原是一種細胞粘附分子，作為存在于激活的B淋巴細胞上的B7/BB-1抗原的配體'在本發(fā)明的設備中用DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理B-CLL患者(表19，患者5/6和8)增加了CD8+,CD28+和CD纊CD28'細胞的相對數目，而其它類型的處理則沒有。CD34和CD2組CD34抗原存在于不成熟的造血前體細胞和骨髓中的所有造血集落形成細胞，包括單能(CFU-GM，BFU-E)和多能祖先(CFU-GEMM，CFU-Mix和CFU-blast).CD34也在基質細胞前體上表達.在正常骨中，末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)+B和T淋巴細胞前體為CD34+，CD34抗原存在于表達CD33抗原但缺乏CD14和CD15抗原的早期骨髓細胞，以及表達CD71抗原并微弱表達CD45抗原的早期紅細胞。CD34抗原也存在于毛細血管內皮細胞以及大約l'/。的人胸腺細胞。正常外周血淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和血小板不表達CD34抗原。CD34抗原密度在早期造血祖細胞上最高，當細胞成熟時減少。在完全分化的造血細胞上不存在該抗原。未定型的CD3f祖細胞是CD38—，D1T并缺乏細胞系特異性抗原，如CD71,CD33，CD10,和CD5，而CD3f細胞是細胞系定型的，以高密度表達CD38抗原，大多數CD34+細胞相互表達CD45R0或CD45RA抗原大約60%的急性B淋巴細胞白血病和急性髓細胞^i白血病表達CD34抗原，該抗原在慢性淋巴細胞白血病(B或T細胞系)或淋巴瘤上不表達.CD2抗原存在于T淋巴細胞和天然殺傷淋巴細胞(NK)的一種亞型。結果見圖表2、3和4。分析用DR抗原p或a鏈的單克隆抗體處理B-CLL患者的血樣(表20，患者5/6，2小時)，發(fā)現CD34+相對數目的顯著增加，用前一種抗體處理后，CD34+CD2+細胞相對數目顯著增加。由于已經用前面提到的各組(見表14-19)對相同血樣進行了免疫表型分析，這里觀察到的CD34+和CD34+CD2+細胞相對數目的增加似乎與CD4+CD8+,CD8+CD3+和CD4+CD3+單陽性(SP)細胞相對數目的增加一致。此外，這些似乎專門涉及DR抗原P鏈的發(fā)現間接支持該過程通過B淋巴細胞退化導致T淋巴細胞生成。在分析同樣的處理時，24小時后CD34+細胞似乎減少到一定水平，從而導致T淋巴細胞相對數目的進一步增加。該逆向分化過程起初導致T淋巴細胞生成，該過程可被反轉，導致B淋巴細胞生成，前一種現象是在用DR抗原P鏈的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺2小時所觀察到的，而后一過程是在對同一樣品進行同一處理時的24小時孵育期所注意到的(圖表2)。用DR抗原P鏈的單克隆抗體處理HIV+患者的血樣顯著增加了CD34+和CD2+CD34+細胞的相對數目，用同時加入的HLA-DR抗原卩鏈的單克隆抗體和同樣抗原的a鏈的單克隆抗體處理的相同血樣也是如此。然而，用HLA-DR抗原a鏈的單克隆抗體處理該血樣不影響CD34+細胞的水平。用HLA-DR抗原(3鏈的單克隆抗體和同樣抗原的a鏈的單克隆抗體，和同時加入兩種單克隆抗體處理從一名6日齡嬰兒(BB/ST表20)獲得的血樣，產生以下免疫表型改變。在分析未處理血樣時，CD3f和DR+細胞的相對數目顯著增加，用p鏈的單克隆抗體處理時，CD34+細胞的相對數目進一步增加，但用HLA-DR抗原a鏈的單克隆抗體處理或用一起加入的該分子的a鏈和P鏈的單克隆抗體處理時該數目減少.然而，后一種處理增加了CD34+CD2+細胞的相對數目，當單獨用HLA-DR抗原j3鏈的單克隆抗體處理時產生相反的結果。當24小時后分析同一患者經處理或未處理的血液等分物時，上述所有處理均使CD34'的相對數目減少，除用HLA-DR抗原p鏈的單克隆抗體處理時雄持了更高的水平。后一種處理在24小時后繼續(xù)減少CD34+CD2+細胞的相對數目。這些結果表明，HLA-DR抗原通過p鏈的涉及促進了從B-CLL患者的CD2+CD34+池或B淋巴細胞等更成熟的細胞類型產生更多CD34+細胞，這些結果表明這種類型的處理促進了逆向分化，然而，24小時后血樣的免疫表型分析提示，這些細胞類型似乎都存在于另一種細胞系，在這種情況下細胞似乎存在于或將其定型于髄細胞系，這在用CD7和CD13&33進行的經處理血樣的分析中被觀察到.在用MHCII類抗原P鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理B-CLL和健康個體富集(用CD19珠)部分的B淋巴細胞時，外形改變了其免疫表型特征。這些伴隨了B淋巴細胞外形的改變。觀察到未處理血涂片中在玻片上形成集落的B淋巴細胞被粒細胞、單核細胞、大量原始形態(tài)的細胞和有核紅細胞代替。在處理或未處理血涂片上沒有觀察到有絲分裂特征或顯著的細胞死亡。表20的結果也進一步證明了一個重要的發(fā)現，即根據本發(fā)明的方法，可以通過使更成熟的未分化細胞逆向分化而制備未分化細胞。D.顯微鏡照片除了上述抗原檢驗，還使用顯微鏡從視覺上遵照本發(fā)明的方法?？梢詫Ρ景l(fā)明的設備進行編程，使其通過跟蹤工具自動跟蹤改變。在這一點上，圖8是在本發(fā)明的方法之前分化B細胞的顯微鏡照片。圖9是根據本發(fā)明的方法通過B細胞逆向分化形成未分化細胞的顯微鏡照片，其中該試劑是HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體。未分化細胞是暗染的細胞團。圖10是同樣的未分化細胞的顯微鏡照片，但放大倍數較低。因此圖8-IO從視覺上證明了通過本發(fā)明的方法，B細胞逆向分化為未分化干細胞。圖11是在本發(fā)明方法之前的分化B細胞的顯微鏡照片。圖12是根據本發(fā)明的方法通過B細胞逆向分化形成未分化細胞的顯微鏡照片，其中使用的試劑是HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體.同樣，未分化細胞是暗染的細胞團。圖13是從圖12的相同未分化細胞形成分化粒細胞的顯微鏡照片。因此圖11-13從視覺上證明通過本發(fā)明的方法將B細胞逆向分化為未分化干細胞，然后將未分化細胞定型為新的與原始分化細胞不同系的分化細胞。也對用CR3/43單克隆抗體處理的B-CLL患者的血樣進行了顯微鏡實驗，如前面所討論的，BCLL的血液可以用于幫助研究逆向分化過程，因為該血液含有的B淋巴細胞比正常數目高。該結果在圖14-17中詳細表示。圖14表示在兩種不同的放大倍數下，從BCLL患者得到的未處理血樣.未處理B淋巴細胞(藍色細胞)表現出典型外形，即濃縮的染色質結構和稀少的細胞質.剩下的細胞是紅細胞.用抗體CR3/43處理血樣一開始導致成簇的B淋巴細胞聚集(圖15)。成簇的B細胞逐漸失去它們的典型外形，其特征在于形成鵝卵石樣細胞區(qū)域，染色質結構的去濃縮，典型核仁的出現，細胞體積的擴大和未分化細胞典型的細胞質嗜堿性(圖16)。疏松的(去濃縮)染色質結構是未分化細胞與分化細胞相比的一種重要特征。這可能是由于需要更廣泛接近轉錄單位，以確定沿給定細胞系定型所需要的基因表達的改變.相反，已知更分化細胞具有更濃縮的染色質結構，因為只需要少量染色質具有轉錄活性。未分化細胞的出現總是伴隨具有分化外形的細胞的出現(17A-17J)。重要的是，這些細胞不能通過增殖而增加數量，這是因為(i)孵育時間對于發(fā)生一次或多次完整的細胞分裂來說太短，(ii)沒有看見有絲分裂特征，以及(iii)在處理之前和之后白細胞的絕對數目保持相同。此外，發(fā)現較不分化的祖先與它們的更分化后代(見圖17J的骨髓前體)相關，這表明這些特異的細胞是通過分化產生的。顯微照片圖17A-17J表示用CR3/43單克隆抗體處理B-CLL淋巴細胞后所看到的分化細胞的類型血小板(PI)-圖17A，中性粒細胞(Ne)-圖17B，嗜酸性細胞(Eso)-圖17C,巨核細胞(Meg)-圖17D,嗜堿性細胞(Ba)-圖17G,淋巴細胞(Ly)-圖17H，單核細胞(Mo)-圖171和骨髓祖細胞(Mp)-圖17J。也看到了紅細胞祖先和巨噬細胞(未給出數據)。所以，總之，這些外形結果表示BCLL患者樣品中B細胞外形的改變，這些患者中具有高水平的成熟B淋巴細胞。顯微鏡照片表現了B淋巴細胞的外形改變，它們首先聚集成簇，然后出現各種具有從祖細胞至分化細胞的分級的外形范圍的細胞(中性粒細胞、嗜堿性細胞、嗜酸性細胞、巨核細胞、血小板、^f^巴細胞、巨噬細胞、粒細胞、刺粒細胞和基質樣細胞)。此外，而且非常重要的是，看見了紅細胞和髓細胞祖先(圖17J-數據未示出)。該髓細胞祖先可以通過外形清楚地同其它細胞區(qū)分，它們更大，具有獨特的核形態(tài)，并含有胞質顆粒。因此，顯微鏡數據從外形上支持以細胞表面標記表示的流式細胞術數據，這些數據允許得出結論，即用MHCHLA-DRp鏈的抗體處理B淋巴細胞導致B淋巴細胞數目的減少以及未成熟前體細胞等其它造血系細胞數目的增加。也用顯微鏡觀察了通過本發(fā)明的方法使采用MHCII類a鏈的抗體(單克隆抗體TAL.1B5)處理的T細胞逆向分化為未分化干細胞，然后將未分化細胞定型為新的分化細胞，該細胞與原始的分化細胞不同系(數據未示出)。E.在逆向分化的淋巴細胞中分析VDJ重組重排通過本底，用于這些實驗的分化細胞(B淋巴細胞或具有某些T淋巴細胞特征的細胞)具有已經進行重排而分別編碼成熟Ig或TCR的基因。在重排過程中，不作為最終的一部分的DNA中間部分、被表達的TCR或Ig基因、即在這些受體之間的可變(V)區(qū)編碼片段和恒定(C)區(qū)編碼片段之間的原始DNA被從基因組中切除。這些被切除的片段在細胞中以染色體外DAN的形式存在。對于真正逆向分化的細胞，被切除的DM將重新插入基因組，使細胞處于與它們的原始分化之前相似的狀態(tài)。因為這一點，與作為分化狀態(tài)的特征的重排DNA相比，當DNA返回到其未重排或生殖系狀態(tài)時，互補于重排基因中的序列的探針將與更大的DNA限制片段雜交。1.Daudi細胞中TCR基因的重排在產生圖18所示DNA印跡的實驗中，采用了公知細胞系Daudi，即一種具有一個重排TCR基因(另一個被去除)的B細胞淋巴瘤.從Daudi細胞制備基因組DNA，并且用EcoRI消化，進行凝膠電泳，然后用標記的TCRP鏈DNA探針進行探測.采用Daudi細胞，而不是從病人中純化的B淋巴細胞，這是因為這些細胞是克隆上相關的，而且來自于具有相同基因重排的同源細胞群，這可以通過被消化的基因組DNA的DNA印跡清楚地觀察到.在正常血樣中，不同的細胞具有不同的重排，所以DNA印跡將作為涂片出現。編碼TCRP鏈的功能基因在淋巴細胞中聚集，這是通過在淋巴細胞成熟過程中的一系列體細胞染色體重排形成的，而這種重排使V片段、D片段和J片段聚集在一起。這些重排過程的非常清楚的解釋見一本標準的大學教科書GenesVI，Lewin，OxfordUniversityPress.1997(P1994-1023)。下面引用了其一些特定頁。首先，通過重組過程在D-J連接反應中將D片段與一些J片段連接。然后，將許多可能的V片段(〈60)之一連接于得到的DJ片段(V-D連接)，以便形成一個完整的TCRP鏈基因。恒定區(qū)基因在重排VDJ片段緊鄰的下游，但可能有間插J片段，它們在RM加工過程中被切除，使恒定區(qū)基因外顯子鄰近于重排的VDJ基因片段(Lewin,p998)。在人類細胞中，有兩種不同的TCRP鏈恒定區(qū)基因片段，稱作C卩l(xiāng)和C|32，它們存在于兩個不同的基因座，每一個前面都有一簇6或7個連接區(qū)(J卩)基因片段(jpi和JP2)和一個D片段(DPI和叩2)(見圖l，Toyonagaetal.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8624—8628和Lewin，p1017)導致V，D和J-C片段鄰近的重組事件是通過多個蛋白催化的，包括RAG-1和RAG-2，它們識別存在于V，D和J-C基因序列重組端的九聚體和七聚體序列。根據這些九聚體/七聚體序列的方向，重組導致反向或去除。兩種事件都導致基因組DNA限制酶片段模式的改變。此外，去除事件并不一定導致被切除片段的完全丟失。被切除片段的末端可以被重新連接，產生保留在細胞中DAN環(huán)(0kazakietal.,1987，Cell49:477-85;Davisetal.，1991，J.Exp.Med.173:743-6;LivakandSchatz，1996,Mol.CellBiol.16:609-18;Harriraanetal.1993，A腸RevImmunol.11:36卜84)。當然，每種基因片段都有兩個等位基因，因為細胞具有二倍體染色體互補。在正常種系狀態(tài)下，Cpi和CP2基因按照Toyonagaetal.，1985中的圖1所示排列'用EcoRI對基因組DNA進行限制性消化將產生兩個相關的條帶，它們可以被實驗中采用的探針檢測到(該探針為標記的來源于Cpl的DNA片段，由于高度序列同源性，它們也與CP2雜交)，這兩個條帶為(i)含有CP1序列的12kb條帶；(ii)含有CP2序列的4kb條帶。該種系構型可以在未分化的未成熟細胞中看到(圖l")。該種系構型也由圖18的第3道(用CR3/43抗體，2小時)進行了完整的說明，產生與A道相同的模式。在分化狀態(tài)下，C(J1和Cp2的兩個等位基因被重排，這樣在C卩l(xiāng)基因座就不是一個12kb片段，或者在CJ31基因座就不是一個4kb片段。實際上，在凝膠上不存在來源于Cpl基因座的雜交片段(這是因為作為重組的結果從兩個cpi等位基因去除了雜交序列).對于C卩2基因座，現在實際上有兩個主要的條帶對應于兩個染色體上重排得到的不同"等位基因"。最大的條帶小于4kb，對應于兩個重排等位基因之一的片段，最下面的條帶是另一個重排等位基因的片段，中間的小條帶可能來自于具有不同重排的Daudi細胞的亞克隆一一所以它以等位基因的任何一個的亞摩爾量存在。然而，重排狀態(tài)非常清楚地表示于第1道，其中兩條主要的條帶都非常清楚。用結合于MHC-DRa鏈的陰性對照抗體(TAL.1B5)處理2小時實際上導致上面的條帶消失，而最下面的條帶與第1道中的未處理細胞具有相同的強度(見第2道)。對此的可能解釋是細胞在分化，進一步導致在一個等位基因的CP2基因座的另一重組事件，這導致Cp2序列喪失。這與已知現象的完全一致。用陰性對照抗體處理24小時似乎恢復了在未處理細胞中看到的3個條帶(見笫4道)然而，這些條帶實際上比在第2道中所看到的遷移到了更低的位置。還不清楚這是為什么。一個可能的解釋是發(fā)生了已經去除的序列的重新整合，與去環(huán)-切除-重新整合模型(Malissenetal,,1986,Nature319:28-32)—致。然而，用TAL.1B5抗體在2小時或24小時沒有7見察到該結果，說明對種系模式進行了重排。第2和4道實際上代表陰性對照一a鏈的抗體不導致種系序列的恢復，相反，用MHC-DRp鏈的單克隆抗體(CR3/43)處理后2小時獲得的結果表現出對應于種系構型的模式，即12kb條帶和4kb條帶(比較第3道和A道)。換句話說，這些結果表示等位基因的CP1和CP2基因座的種系限制模式得到了恢復。從這些結果我們得出結論，在第3道中看到的條帶模式表示分化細胞基因組DNA的重排，以重新產生種系構型。該發(fā)現的重要性不應被忽視。可以對包括去除在內基因組重排進行逆轉，使基因組恢復到分化過程發(fā)生之前的狀態(tài)。最可能的解釋是分化中由Cp2等位基因重排導致的反向被逆轉，導致失去l"b條帶的cpi序列的去除也被逆轉。cpi序列消失的來源似乎是最初的去除事件中核內存在的附加形環(huán)狀DNA。該環(huán)狀DNA的存在在先有技術中已有記載(見引用的參考文獻).然而，發(fā)生這種種系基因組恢復的確切機制并不重要，重要的是它確實發(fā)生了，在本發(fā)明的設備中用MHC-DR|3鏈的單克隆抗體(CR3/43)繼續(xù)孵育，產生了更復雜的條帶模式(第5道)。然而這些條帶并不代表未處理對照中的相同條帶。具體地說，仍然存在與探針雜交約12kb的片段("CP2等位基因")。此外，重要的是理解標有"CP2等位基因"的條帶并不對應于未處理對照中觀察到的小于4kb的條帶(笫1道)。第5道中觀察到的結果的最可能的解釋是發(fā)生了第二次重排過程，因為雜交模式類似于其中的T細胞的特征在于重排的TCR基因(該解釋與流式細胞術數據一致，該數據表現出具有T細胞的特征性細胞標記的細胞增加)。然而，不管確切的分子解釋如何，在暴露于CR3/43抗體24小時后在第5道看到的結果支持2小時暴露后笫3道的結果。2.B-CLL細胞中Ig基因的重排用慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)患者外周血細胞獲得了圖19B所示的DNA印跡。從這些大量單克隆B細胞制備基因組DNA，用BamHI和HindIII消化，進行凝膠電泳，并且用標記的TCRDNA探針進行探測。用這里所描述的CR3/43(抗HLA-DR、DP和DQ的11類MHC鏈)處理這些B-CLL細胞。用放射性標記IgJ區(qū)探針探測該印跡。A道中從未處理細胞獲得的兩條帶代表兩個重排的Ig等位基因(父源和母源)。這些條帶在B道中不出現，B道表示用抗體處理細胞24小時后的模式。在它們的位置出現了種系Ig基因的特征性5.4kb條帶。在圖19A所示另一實驗中，對細胞不進行處理，或處理用抗II類MHCJi鏈抗體所指示的時間.在分化(對照)和抗體處理的B-CLL細胞中(凝膠的左半部分)通過PCR擴增IgVDJ區(qū)。這從為處理細胞產生了VDJ擴增產物.然而，在抗體處理的細胞中沒有觀察到這樣的條帶，因為作為插入經切除的基因組DNA，"種系，，DNA構型不易經受用VDJ的特定引物進行的PCR擴增。相似的實驗(凝膠右側)允許我觀察到對照，即編碼P肌動蛋白的管家基因的行為。不管處理如何，P肌動蛋白PCR擴增產物沒有差異。因此，該"對照"基因似乎不受逆向分化過程的影響，該過程在同樣條件下使同樣細胞的Ig基因產生很大改變。上面提到的結果表示用涉及適當細胞表面受體的試劑處理細胞可以誘導這些細胞的逆向分化，這通過觀察分化狀態(tài)的特征性染色體DAN重排的逆行而在分子水平上證實(和監(jiān)測)。因此，在分子遺傳學和外形證據的基礎上可以得出結論，用涉及II類MHCp鏈的試劑(mAb)處理B淋巴細胞系的細胞可以使其逆向分化.相反，用涉及11類MHCa鏈的試劑處理同樣的細胞不相似地誘導逆向分化。它們似乎沿B細胞途徑分化(正向)。F.對B淋巴細胞逆向分化的進一步研究按上述方法在本發(fā)明的設備中用CR3/43抗體處理BCLL患者的FACsVantage純化的BCLL細胞(95%純的B細胞)，用流式細胞術處理細胞.下面的表A中表示的結果進一步證實了前面得到的結杲。具有B淋巴細胞系的特征性細胞表面標記(CD19,CD20和CD22)的細胞的數目大大減少，同時出現了CD34+細胞數目的顯著增加，從表A中需要注意的重要一點是，同時為CD34陰性和細胞系陰性的細胞數目增加。這些未分化細胞不定型為造血系，在分化中先于CD34+干細胞。此外，通過光學顯微鏡檢查樣品，發(fā)現許多粘附細胞類型具有非造血細胞的外形特征。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>也證明了失去CD19標記，伴隨在同樣的細胞上出現CD34細胞表面標記，并且用共聚焦顯微鏡即時記錄在錄像帶上'加入CRV"單克隆抗體之前的B淋巴細胞用FITC偶聯的CD19的單克隆抗體染成綠色。在加入CR3/43單克隆抗體之后，細胞失去了它們的綠色熒光，開始用PE/Cy5(或quantum紅)偶聯的CD34的單克隆抗體染成紅色，而不是綠色(見圖23,它表示從時間延遲錄像中得到的兩張靜止圖象)。該結果清楚地證明，在B細胞逆向分化中，細胞系特異性標記如CD19消失，而干細胞標記如CD34重新表達。G.誘導B'淋巴細胞逆向分化為造血干細胞的其它試劑起初的研究實際上鑒定了三種試劑——粒細胞/單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素和mAbCR3/43。在本發(fā)明的設備中用這三種試劑之一，以上述對CR3/43和TAL.1B5所描述的方法處理富集的、純化的正常B淋巴細胞制劑，并且按上述內容用流式細胞術檢查處理過的樣品。與陰性對照相比，用GM-CSF、紅細胞生成素或mAbCR3/43處理的所有三種樣品都表現出與逆向分化一致的改變。具體地說，所有三種試劑都增加了細胞群中CD34+細胞的相對數目(見圖20)。然而，用CR3/43觀察到了最大的故果，因此，選擇該試劑用于這里提到的更詳細的研究。H.由逆向分化過程產生的造血干細胞的特性集落形成測定為了證實通過流式細胞術觀察到的CD34+細胞和通過顯微鏡鑒定的未分化細胞具有未分化造血細胞的特性，對用II類MHCP鏈的抗體(CR3/43-見上文)處理過的血樣進行集落形成測定——即本領域中公知的用于評估原始造血細胞能力的標準方法。該集落形成測定可以在本發(fā)明的設備中自動進行，作為跟蹤機制的一部分。造血干細胞的體外集落測定允許對具有增殖、分化和發(fā)育為表型和功能成熟的髓細胞和/或紅細胞的能力的原始祖細胞進行定量.例如，在生長因子存在下，當干細胞種植/固定于軟凝膠基質中時，可以進行體外集落生長(增殖)和分化。圖21是本發(fā)明的方法產生的干細胞的集落測定,采用反相亮視野顯微鏡。在此測定中，用CR3/43mab處理從健康血液供體的血塊黃層得到的B細胞，然后按材料和方法部分所述進行集落測定。圖21的(a)-(e)說明a)以亮視野顯微鏡3倍放大所觀察的培養(yǎng)皿中表現出紅細胞、骨髓細胞和混合(由成熟骨髓細胞和紅細胞組成)集落，它們容易用肉眼觀察到。每種集落通過增殖和隨后的分化由單個造血干細胞產生。b)MIX-CFC，該集落產生于單個多能造血干細胞(能夠產生骨髓細胞和紅細胞系細胞的干細胞)。c)M-CFC，該集落由巨噬細胞組成。d)GM-CFC，該集落由髓系組成，包括巨噬細胞、粒細胞和巨核細胞。e)BFU-E，該集落由屬于紅細胞系的細胞組成，如晚幼紅細胞和去核紅細胞。這些細胞的紅色表示它們含有許多血紅蛋白。該集落很大，說明它來自于極原始的干細胞。用B-CLL細胞荻得了相同的結果(數據未示出)。未處理的B細胞沒有產生造血集落(數據未示出)。因此這些結果證明，在用II類MHCp鏈的單克隆抗體CR3/43處理的血樣中存在存活的造血干細胞，但未處理血樣中則不存在。長期培養(yǎng)長期測定檢查造血干細胞的自我更新潛能。在該培養(yǎng)中，骨髓造血的大多數成分在體外增殖。該培養(yǎng)的重要特征是持續(xù)的造血，這是在未加入生長因子的情況下發(fā)生的。在此測定中，造血過程絕對取決于骨髄來源的基質細胞粘附層的建立?；|細胞(由許多非造血細胞，如成纖維細胞、脂肪細胞等組成，并且包括所有屬于間充質系統(tǒng)的細胞類型)通過提供適當的環(huán)境(分泌生長因子并合成細胞外基質)而促進干細胞的存活、自我更新、增殖和分化，從而支持造血。在此測定中，用CR3/43mab處理從健康血液供體的血塊黃層獲得的B細胞，導致在加入抗體幾小時內形成粘附層(用B-CLL細胞也獲得同樣的結果)，并且隨時間增加。粘附層由基質細胞組成，基質細胞(覆蓋細胞，主要由成纖維細胞/間充質類型的細胞組成/用反相亮視野顯微鏡觀察時為光折射大的細胞)在12周內和更長的時間內支持造血細胞的生長和發(fā)育(這些細胞表現出與造血細胞的緊密接觸)。在粘附層中也可以看到成組的原始造血細胞(也稱作鵝卵石區(qū)/暗細胞簇)，它們是長期產生造血細胞的來源.在基質層頂部的非粘附層(亮細胞簇)由形成造血灶簇的小圓細胞組成，該層含有干細胞和造血系統(tǒng)的更定型祖先。非粘附層可以產生MIX-CFC，GM-CFC,M-CFC,BFU-E(用集落測定判斷)和CFU-F(集落形成單位-成纖維細胞)(當用長期培養(yǎng)基進行亞克隆時)。I.用HLA-DRj3鏈的抗體處理的細胞的RT-PCR在用CD34、c-kit(干細胞因子的配體)、e-血紅蛋白(血紅蛋白的胚胎形式)和p肌動蛋白的CR3/43mab處理的Ramos(B淋巴瘤)和K562(紅細胞白血病)細胞中測定到了基因轉錄.方法在CR3/43mab處理前和處理后用RNAZ0L(CINABIOTECH)提取mRNA-在室溫下用4jil標準緩沖'液、2ji1dNTPs、RNASIN、反向引物(隨機六聚體引物)和MMLV反轉錄酶孵育5分鐘，使mRNA接受六聚體引發(fā)的反轉錄。將該混合物在38'C下進一步孵育1小時。然后采用設計用于擴增CD34，c-kit，e-血紅蛋白和卩肌動蛋白的序列的引物在標準條件下對混合物進行PCR。根據公開的數據，在RandellInstituteKings學院合成引物。結果所獲得的結杲顯示，用CR3/43邁Ab處理后，P肌動蛋白mRNA的水平沒有改變，而和e-血紅蛋白mRNA的水平都顯著增加。CD34和c-kit的結果進一步支持了前面的詳細數據，這些數據證明B淋巴細胞逆向分化產生造血干細胞。從e-血紅蛋白獲得的結果甚至更有趣，因為e-血紅蛋白正常情況下只在胚胎細胞表達。因此用CR3/43mAb處理不僅產生造血干細胞，甚至還可以產生更原始的未分化細胞，如胚胎干細胞.J.總結簡言之，本發(fā)明的設備可用于將分化細胞逆向分化為干細胞。體外實驗描述的例子揭示了非常有趣和開創(chuàng)性的發(fā)現，該發(fā)現是關于T和B淋巴細胞的個體發(fā)生和發(fā)育，它們可用于產生干細胞，從而在大約幾小時內影響外周血樣中的淋巴造血細胞生成.用II類抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理從B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)患者得到的外周血樣，導致單陽性(SP)T細胞和它們的祖細胞的相對數目顯著增加，它們的祖細胞對于胸腺細胞標記CD4和CD8抗原是雙陽性的，這些是同時共表達的。然而，這些現象總是伴隨B淋巴細胞相對數目的顯著減少。當用II類抗原a鏈同源區(qū)或I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理同樣的血樣時沒有發(fā)現這些結果.在本發(fā)明的設備中用HLA-DRP鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理從B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)患者得到的全血，似乎導致T淋巴細胞生產。該事件是以共表達CD4和CD8標記的雙陽性細胞的出現、表達CD34的細胞的出現以及伴隨出現的CD4+CD3+和CD8+CD3+細胞數目的增加為標志的，此外，在這些細胞產生過程中發(fā)生的免疫表型改變與胸腺細胞發(fā)育中的改變相同，特別是隨時間測量時更是如此。發(fā)現B淋巴細胞總是失去CD19,CD21,CD23,IgM和DR等標記，這與CD34+和CD34+CD2+細胞的出現、CD7+細胞的增加、CD8+CD28+和CD28+細胞的增加、CD25+細胞的增加、CD10+和CD34+細胞以及CD34+和CD1^細胞的出現、CD5+細胞、以及表達4氐水平CD45抗原的細胞的增加一起發(fā)生。這些改變是由于用HLA-DR抗原P鏈同源區(qū)的單克隆抗體進行了處理。與這種處理相關的免疫表型改變與B細胞逆向分化和隨后的定型(即重新定型)一致，因為B-CLL患者血液中的大多數白細胞為B淋巴細胞。而且，B-CLL患者的B淋巴細胞在用環(huán)磷酰胺和HLA-DR抗原P鏈的單克隆抗體處理后被誘導成為T淋巴細胞，它們可以在用該處理長時間孵育后逆轉為B淋巴細胞。用CD16&56和CD8及CD3組對HLA-DR抗原p鏈的單克隆抗體處理的樣品進行分析，表達這些標記的細胞的相對數目穩(wěn)定增加，這與用CD19和CD3以及DR和CD3等組所測定的結果一致。用比濁法和免疫電泳進行的HIV患者的經處理和未處理樣品上清液的研究發(fā)現IgG水平的增加，說明B細胞已經經過了血漿細胞期。前面提到的細胞的相對數目的增加也伴隨表達CD56&16抗原的中等大小、顆粒非常多的細胞以極高的量出現。其它極大并且顆粒非常多的細胞也瞬時觀察到，它們對于CD34是陽性的，對CD4CD8標記為雙陽性.也觀察到了其它瞬時細胞，它們較大，含有顆凈立，對于CDS和CD"為陽性。在大多數B淋巴細胞上存在的CD25消失，代之以由新形成的T淋巴細胞表達，觀察到T淋巴細胞的數目總是增加。用DR抗原P鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理B-CLL患者的全血后出現了CD28+CD8'和CD28+細胞。這些發(fā)現是由于用HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理了血液。以此方式產生的T淋巴細胞生成也在健康血液供體的外周血、臍帶血、骨髓、HIV+個體和AIDS患者等各種感染的患者、從健康血液供體血樣得到的B淋巴細胞的富集部分中觀察到'此外，在用HLA-DR抗原P鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的兩名B-CLL患者的樣品中進行的髓細胞標記分析顯示了表達髓細胞標記如CD13和CD33的細胞的相對數目增加，這些標記與CD56&16或CD7抗原共表達。然而，在單獨的細胞群中觀察到了具有T淋巴細胞標記并且沒有髓細胞抗原的CD7+細胞的相對數目。在未處理樣品或用I類抗原或HLA-DR抗原a鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的樣品中沒有發(fā)現這些特定的觀察結果(見圖表2和3)。這些最終的結果表示，一旦通過HLA-DR抗原P鏈激發(fā)了B淋巴細胞，它們就不能返回為T淋巴細胞祖細胞，但可以存在于髓細胞和紅細胞系中。因此，本發(fā)明中的數據證明，在本發(fā)明的設備中，(i)可以將健康細胞從一個細胞系轉化為具有一些其它細胞系細胞的細胞表面標記和外形特征的細胞，以及(ii)可以從分化的B淋巴細胞和T淋巴細胞獲得具有原始祖細胞的細胞表面4示記和外形特征的細胞(例如干細胞)，應該注意，已經用BCLL細胞進行了一些實驗。BCLL細胞是可以分化至血漿細胞的最終分化狀態(tài)的成熟B淋巴細胞。此外，由于染色體缺陷，它們表現出高水平的增殖，因此BCLL患者血液中存在大量B淋巴細胞。通過與先有技術描述的許多腫瘤細胞進行比較，在用于本發(fā)明的方法之前，BCLL細胞沒有進行任何形式的有限的逆向分化.而且它們也沒有以基因組結構、細胞標記或細胞外形的形式表現未分化細胞的任何特征。它們都是成熟的B淋巴細胞.因此，盡管某些惡性細胞可能具有一定程度的未分化細胞的特征，對于BCLL細胞來說則并非如jt匕，它們是研究B淋巴細胞的理想實驗系統(tǒng)，實際上，在與這些實驗相關的任何方面，BCLL和Daudi細胞并不能從正常細胞中完全區(qū)分出來。事實上，Martenssonetal.，l989，Eur.J.Immunol.19:1625-1629(見P1625rhs.l5tpara)已經證實了BCLL細胞作為模型系統(tǒng)的適當性。此外，用CR3/43單克隆抗體處理從健康供體血樣得到的血塊黃層使CD34(干細胞標記)的出現率更高，CD19(B淋巴細胞標記)的出現率更低。應該注意，用本發(fā)明的方法產生的干細胞可以是任何組織的干細胞，不限于、淋巴造血祖細胞。對本發(fā)明的其它修飾對本領域技術人員來說應該是明顯的。本領域技術人員應該很容易理解，本發(fā)明的設備不必限于使用這里所公開的包含定型細胞的細胞群和/或試劑，并且適用于任何要求用含有試劑的流體混合和孵育的程序。在此引入前面提到的所有公開文獻作為參考，對本發(fā)明的各種修飾和改變對本領域技術人員來說應該是明顯的，這并不偏離本發(fā)明的范圍和精神.盡管本發(fā)明是聯系特定實施方案進行描述的，應該理解，要求保護的本發(fā)明不應過分限制于這些特定實施方案.實際上，對分子生物或相關領域的技術人員明顯的、對實施本發(fā)明的方式進行的修飾也應該包含在以下權利要求的范圍內。表1患者的臨床診斷和血樣的實驗室條件，包括用各種單克隆抗體和其它試劑處理血樣品之后和之前的庫爾特計數(WBC)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>EXPTC0ND:實驗室條件B:之前A:之后ANTI-B:HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體ANTI-A:HLA-DR抗原a鏈同源區(qū)的單克隆抗體ANTI-I:I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體ANTI—AB:—起加入的ANTI-B和ANTI-AANTI-4:CD4抗原的單克隆抗體ANTI-I+II+4:—起加入的ANTI-I和ANTI-B和ANTI-4細胞毒試劑環(huán)磷酰胺ML/ml:微升每毫升升表2用HLA-DR|3鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣之前和之后用CD19和CD3的單克隆抗體進行的B-CLL和其它狀況的患者的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>B:處理前A:處理后表3用HLA-DR(J鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣之前和之后用CD4和CD8的單克隆抗體進行的B-CLL和其它狀況的患者的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表5用HLA-DRP鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理血樣之前和之后用CD16+56和CD3的單克隆抗體進行的B-CLL和其它狀況的患者的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表6用HLA-DRP鏈的單克隆抗體處理血樣之前和之后用CD45和CD14的單克隆抗體進行的B-CLL和其它狀況的患者的免疫表型分析1患者CM5+HCD45+CD14+BBABA190.570.17,521.90.83.3285.852.28.838.35.39.5384.352.29.933,85.113.2491.579.22.175.710.8563.184,634.99.40.53.66ND752.885.245.613.90.50.68.71.15571.134.55,38.79SEE1079.747.316.3482.11.99261.764.727.426.65.93.69149.449.240.444.36.53.28752.461.536.128.776.52145.843.344.347.66.23.33424.424.654.859.613.39.739鄰J站.330.542.114.58.893SEEHIV+22.6.26.966.863.56.86.7IgA/D47.459,841.933.35.94.1表7用HLA-DRp鏈的單克隆抗體處理血樣之前和之后用CD8和CD3的單克隆抗體進行的B-CLL和其它狀況的患者的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表10用PE偶聯的HLA-DRp鏈的單克隆抗體處理血樣之后用CD4和CD8的單克隆抗體所測量的B-CLL患者隨時間的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>表14隨時間測量的用HLA-DRa鏈同源區(qū)的單克隆抗體、HLA-DR|3鏈同源區(qū)的單克隆抗體、兩種單克隆抗體一起、P鏈同源區(qū)的單克隆抗體加環(huán)磷酰胺以及I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理之前和之后B-CLL患者的免疫表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>B-之前；A-之后；AB=加入卩鏈的抗體之后；AA=加入a鏈的抗體之后；ABC-加入a鏈或p鏈的抗體和環(huán)磷酰胺之后；Al-加入I類的抗體之后。表15CD8和CD4<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>表19<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表21用來源于人血塊黃層的細胞進^f亍的FACs分析<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>值表示為表達標記的細胞百分比圖表l隨時間測量的未處理的和用HLA-DR抗原|3鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的患者(2、3和4)血樣的免疫表型改變<image>imageseeoriginaldocumentpage94</image>圖表1A<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>圖表2隨時間測量的未處理的和用HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體、該抗體和環(huán)磷酰胺、HLA-DR抗原a鏈同源區(qū)的單克隆抗體和I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理的患者(1)血樣的免疫表型改變<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>有無FL1FL2時間H2B001:ABCD7CD33&132HR12A001:MCD21CD52HR12B001:ABCD21CD52HRJ2A001:MCD34CD22HRJ2B001:ABCD34CD22HRB2A24H001:MCD34CD224HRB2B24國:ABCD34CD224HRB2BX24H001:ABCCD34CD224HRK2B001:ABCD10CD252HRK2A001:AACD10CD252HR圖表3未處理的和用HLA-DR抗原p鏈同源區(qū)的單克隆抗體處理的患者(8)血液的免疫表型改變有無FUFL2時間A麵CD45CD142HRA2001CD45CD142HRCN001CD3CD192HRC2001CD3CD192HRD,CD4CD82HRD2001CD4CD8.2HREN001CD3DR'2HRE2001CD3DR2HRFN001CD3CD56&162HRF2001CD3CD56&162HRGN001CD28CD82HRG2001(JD28CD82HRH,CD7CD52HRH2001CD7CD52HR畫1CD13CD202HR12001CD13CD202HRJN001CD45RACD252HRJ2001CD45RACD252HRKN001CD57CD232HRK2001CD57CD232HR圖表4未處理的和用HLA-DR抗原卩鏈同源區(qū)的單克隆抗體和I類抗原同源區(qū)的單克隆抗體處理的患者(10)血樣的免疫表型改變<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>權利要求1.一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將更定型細胞逆向分化為未分化的細胞，其中更定型細胞的逆向分化發(fā)生于血塊黃層血樣中的或來自于血塊黃層血樣的更定型細胞。2.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括使血塊黃層血樣中的更定型細胞與導致更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑接觸。3.根據權利要求1或2的方法，其中定型細胞不是癌細胞。4.根據權利要求1-3的任一項的方法，其中定型細胞是分化細胞。5.根據權利要求1-4的任一項的方法，其中定型細胞是定型的造血千細力包。6.根據權利要求1-5的任一項的方法，其中定型細胞選自CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，CFC-E細胞，T細胞和B細胞，7.根據權利要求1-6的任一項的方法，其中未分化細胞是多能干細胞。8.根據權利要求1-7的任一項的方法，其中未分化細胞是選自造血干細胞、神經元干細胞、上皮干細胞、間充質干細胞和胚胎干細胞的干細胞。9.根據前述任意一項權利要求的方法，其中未分化細胞的特征在于以下一種或多種細胞表面標記符號CD34+，HLA-D1T，CD38—，CD117,AC133,CD90和/或低CD45。10.根據權利要求1-9的任一項的方法，其中未分化細胞是MHCI類+和/或MHCII類+細胞。11.根據權利要求1-10的任一項的方法，其中所述試劑涉及介導定型細胞表面的抗原的捕獲、識別或呈遞的受體。12.根據權利要求11的方法，其中該受體為MHCI類抗原或MHCII類抗原。13.根據權利要求12的方法，其中I類抗原為HLA-A受體、HLA-B受體、HLA-C受體、HLA-E受體、HLA-F受體、或HLA-G受體，所述II類抗原為HLA-DM受體、HLA-DP受體、HLA-DQ受體或HLA-DR受體。14.根據權利要求13的方法，其中該受體為HLA-DR受體。15.根據權利要求ll的方法，其中該受體包含具有同源區(qū)的p鏈。16.根據權利要求15的方法，其中該受體至少包含HLA-DRp鏈的同源區(qū)。17.根據權利要求ll的方法，其中該試劑為受體的抗體。18.根據權利要求17的方法，其中該試劑為受體的單克隆抗體。19.根據權利要求17或18的方法，其中抗體選自單克隆抗體CR3/43和單克隆抗體TAL1B5。20.根據權利要求2-19的任一項的方法，其中該試劑調節(jié)MHC基因表達。21.根據權利要求20的方法，其中該試劑調節(jié)MHCI類+和/或MHCII類+表達。22.—種在血塊黃層血樣中增加具有細胞表面標記符號CD34+和/或HLA-DR—和/或CD38—和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45的細胞的相對數目的方法，該方法包括使血塊黃層血樣中的更定型細胞于可操作性涉及所述定型細胞的試劑接觸，從而使CD34+和/或HLA-DIT和/或CD38—和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45細胞的相對數目由于這種涉及而增加。23.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括使細胞群中的一種分化工具接觸，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞。24.逆向分化工具在轉換細胞群中正常分化細胞比例，從而實現將一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞中的用途。25.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中包含所述含有一種或多種分化細胞的細胞群的環(huán)境從第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，其中所述第二種環(huán)境的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種所述分化細胞逆向分化為未分化細胞。26.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的一種在不含離子或離子被掩蔽的第一種環(huán)境中培養(yǎng)細胞群，并將第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，其中第二種環(huán)境中存在的離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種分化細胞逆向分化為未分化細胞。27.根據權利要求23-24或26的任一項的方法或用途，其中所述逆向分化工具是任意一種導致細胞群內負選擇，由此導致細胞群中正常分化細胞比例破壞的任何工具。28.根據權利要求23-24或26-27的任一項的方法或用途，其中所述逆向分化工具是以下任意一種或多種抗體；用于根據細胞密度分離細胞的密度梯度培養(yǎng)基；或導致紅細胞沉淀的物質。29.根據權利要求25或26的方法，其中第二種環(huán)境的所述游離離子濃度與第一種環(huán)境的所述游離離子濃度相比有所增加。30.根據權利要求25-26或29的任一項的方法，其中與第一種環(huán)境相比，第二種環(huán)境的所述相對游離離子濃度增加。31.根據權利要求25-26或29-30的任一項的方法，其中所述游離離子為陽離子。32.根據權利要求25-26或29-31的任一項的方法，其中所述游離離子為I族或II族金屬。33.根據權利要求25-26或29-32的任一項的方法，其中所述游離離子為鈣離子和/或鎂離子，34.根據權利要求25-26或29-33的任一項的方法，其中通過用能夠相對改變環(huán)境中游離離子濃度的試劑處理所述第一種環(huán)境而修飾環(huán)境中的所述游離離子濃度，從而實現所述第二種環(huán)境。35.根據權利要求34的方法，其中用一種或多種離子掩蔽劑處理所述第一種環(huán)境，該離子掩蔽劑隨后被去除或濃度被減小，由此實現具有相對增加的游離離子濃度的第二種環(huán)境，從而實現細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。36.根據權利要求25-26或29-35的任一項的方法，其中用一種或多種游離離子掩蔽劑處理所述笫一種環(huán)境，然后將細胞群轉移至第二種環(huán)境，該第二種環(huán)境的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比有所增加，從而實現細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。37.根據權利要求25-26或29-35的任一項的方法，其中可以在含有低濃度游離離子或不含游離離子的第一種環(huán)境中培養(yǎng)所述細胞群，然后將細胞群轉移到第二種環(huán)境，或調節(jié)第一種環(huán)境，使其成為第二種環(huán)境，所述第二種環(huán)境含游離離子，或與第一種環(huán)境相比，游離離子濃度更高，從而實現了細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。38.根據權利要求35或36方法，其中所述掩蔽劑為游離離子螯合劑。39.根據權利要求35-36或38的任一項方法，其中所述掩蔽劑包含胺和羧基。40.根據權利要求35-36或38-39的任一項的方法，其中所述掩蔽劑包含多個-N(CH2C02H)n基團，其中n-l或n-2。41.根據權利要求35-36或38-40的任一項的方法，其中所述掩蔽劑可以選自以下的任意一種或多種EDTA，肝素，EGTA，DTPA，檸檬酸三鈉和其他相似的螯合劑和/或抗凝劑。42.根據權利要求35-36或38-41的任一項的方法，其中加入足夠高濃度的所述掩蔽劑，使得對所述掩蔽劑進行去除可以導致逆向分化。43.根據權利要求42的方法，其中對其進行去除后足夠導致逆向分化的掩蔽劑的所述濃度為大于或等于約2mM。44.根據權利要求23-43的任一項的方法，其中更分化細胞不是癌細胞。45.根據權利要求23-44的任一項的方法，其中更分化細胞是定型的造血細胞。46.根據權利要求23-45的任一項的方法，其中更分化細胞選自CFC-T細胞，CFC-B細胞，CFC-Eosin細胞，CFC-Bas細胞，CFC-GM細胞，CFC-MEG細胞，BFC-E細胞，CFC-E細胞，T細胞和B細胞。47.根據權利要求23-46的任一項的方法，其中未分化細胞是多能干細胞。48.根據權利要求23-47的任一項的方法，其中未分化細胞是選自造血干細胞、神經元干細胞、上皮干細胞、間充質干細胞、內皮干細月包和胚胎干細力包的干細胞。49.根據權利要求23-48的任一項的方法，其中未分化細胞的特征在于以下一種或多種細胞表面標記符號CD34+，HLA-DR—，CD38_，CD117，AC133,CD90和/或寸氐CD45。50.根據權利要求23-49的任一項的方法，其中未分化為MHCI類+和/或MHCI1類+細胞。51.根據權利要求23-50的任一項的方法，其中包含定型細胞的細胞群是血塊黃層血樣或來自于血塊黃層血樣。52.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中含有所述包含一種或多種分化細胞的細胞群的環(huán)境從沒有游離鈣離予或鎂離子或游離鈣離子或鎂離子濃度低的第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，所述第二種環(huán)境含游離鉤離子或鎂離子，或與第一種環(huán)境相比，游離鈣離子或鎂離子濃度更高，從而實現了細胞群中的一種或多種分化細胞的逆向分化。53.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化的造血細胞逆向分化為未分化細JJ包，其中含有所述包含一種或多種分化的造血細胞的細胞群的環(huán)境從第一種環(huán)境改變?yōu)榈诙N環(huán)境，其中所述第二種環(huán)境的游離離子濃度與第一種環(huán)境相比進行了有效修飾，由此導致一種或多種所述分化的造血細胞逆向分化為未分化細胞。54.—種制備未分化細胞的方法，該方法包括將細胞群中的分化細胞逆向分化為未分化細胞，其中通過用能夠相對改變環(huán)境中游離離子濃度的試劑處理第一種環(huán)境而^"飾含所述細胞群的環(huán)境，從而實現第二種環(huán)境。全文摘要本發(fā)明涉及一種設備，該設備為制備未分化細胞的設備，該設備包含一種用于使更定型細胞與導致更定型細胞逆向分化為未分化細胞的試劑接觸的工具。本發(fā)明還涉及一種制備未分化細胞的方法，該方法包括將更定型細胞逆向分化為未分化的細胞，其中更定型細胞的逆向分化發(fā)生于血塊黃層血樣中的或來自于血塊黃層血樣的更定型細胞。文檔編號C12NGK101386839SQ20081009016公開日2009年3月18日申請日期2001年5月10日優(yōu)先權日2000年5月10日發(fā)明者I·M·S·S·阿布亞達耶申請人:特里施泰姆貿易(塞浦路斯)有限公司