專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，特別涉及一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球 藻生產(chǎn)生物柴油的新工藝。具體說(shuō)來(lái)就是首先讓小球藻細(xì)胞在光照條件下利用二 氧化碳自養(yǎng)生長(zhǎng)；經(jīng)濃縮后，向體系中添加有機(jī)碳源(葡萄糖)供微藻異養(yǎng)生長(zhǎng)， 同時(shí)使油脂在微藻體內(nèi)大量積累，從而為大規(guī)模制備生物柴油提供充足、廉價(jià)的原料。
技術(shù)背景生物柴油指的是動(dòng)、植物或微生物油脂經(jīng)酯化反應(yīng)后得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸烷基 單酯。由于具有清潔、可再生、對(duì)環(huán)境友好的特性，生物柴油已日益受到歐美及 亞洲一些能耗大國(guó)的重視并獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展。目前，歐美一些國(guó)家所生產(chǎn)的"第 一代"生物柴油主要以大豆、油菜、棕櫚等經(jīng)濟(jì)作物為主要原料。這種以傳統(tǒng)農(nóng) 業(yè)為基礎(chǔ)的生物能源生產(chǎn)方式不僅產(chǎn)量低而且與糧食作物爭(zhēng)奪耕地、淡水、肥料 等資源，不能滿(mǎn)足生物柴油產(chǎn)業(yè)對(duì)原料油持續(xù)增長(zhǎng)的需求。因此，為了緩解生物 能源產(chǎn)業(yè)對(duì)農(nóng)業(yè)造成的壓力，在文獻(xiàn)"Peer MS， Skye RT， Evan S， et a丄2008. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. Bioenergy Research 1(1) :20-43."中報(bào)導(dǎo)，當(dāng)前國(guó)際上一些大型 能源公司及生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)始把精力轉(zhuǎn)向利用非食用原料——微藻，開(kāi)發(fā)"第二代" 生物燃料。微藻是一種能進(jìn)行光合作用的微生物。它可以吸收空氣中大量的C02，并合成 脂肪，通過(guò)收集加工可提煉成生物柴油供汽車(chē)、火車(chē)作為動(dòng)力燃料，進(jìn)一步加工 還可作為航空燃料，供飛機(jī)使用。由于微藻生物燃料優(yōu)勢(shì)明顯(一是它能在咸水、 污水中生長(zhǎng)，不與農(nóng)田及淡水相爭(zhēng)；二是生產(chǎn)潛力驚人，繁殖速度比高等植物快 40倍)，它在應(yīng)對(duì)全球氣候變暖和滿(mǎn)足對(duì)非污染燃料的渴求方面都有著很大的潛力。但是，迄今為止，利用微藻生產(chǎn)生物柴油仍然存在許多迄待解決的問(wèn)題，還 無(wú)法滿(mǎn)足商業(yè)化的要求。目前，微藻的大規(guī)模培養(yǎng)主要有兩條途徑——自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)發(fā)酵，二者 應(yīng)用于生物柴油的制備各有優(yōu)劣。自養(yǎng)培養(yǎng)可以固定溫室氣體二氧化碳并釋放出 氧氣，對(duì)環(huán)境友好，但是由于微藻細(xì)胞間的互相遮蔽效應(yīng)，光能的利用往往受到 極大的限制。細(xì)胞濃度越高，這種遮蔽效應(yīng)體現(xiàn)得越明顯，嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng) 和脂肪合成，這使在光生物反應(yīng)裝置中實(shí)現(xiàn)含油微藻的高密度培養(yǎng)變得十分困難。 對(duì)于異養(yǎng)培養(yǎng)而言，細(xì)胞的生長(zhǎng)主要依賴(lài)細(xì)胞對(duì)有機(jī)碳源的吸收，由于它不受光 的限制，因此我們可以通過(guò)流加有機(jī)碳來(lái)實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵和脂肪的高效合成。吳慶余課題組以一株既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)生長(zhǎng)的淡水綠藻GWoreJh /^""力"w'cfe 為材料，率先開(kāi)展了利用異養(yǎng)微藻來(lái)生產(chǎn)生物柴油的研究(參看文獻(xiàn)"MiaoXL， Wu QY. 2006. Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil. Bioresour Technol 97:841-846, " 、"Xu H， Miao XL. ， Wu QY. 2006. High quality biodiesel production from microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. J Biotechnol 126: 499-507. ，， 、" Li XF， Xu H， Wu QY， 2007. Large-scale biodiesel production from microalga C力2ore22s/7rotc^力ecoio(s through heterotrophic cultivation in bioreactors. Biotechnology and Bioengi廳ring. 98(4): 764-771. ,， 、"Xiong W， U XF， Xiang JY， s丄 2008 High Density Fermentation of Microalga C/ 7ore27s 尸roz^力ecazVe5" in Bioreactor for Microbio-Diesel Production. 78:29-36，，)。 目前，通過(guò)建立合理的補(bǔ)料流加策略，異養(yǎng)小'球藻的培養(yǎng)密度可達(dá)100g丄—'，油脂 含量超過(guò)50%。盡管異養(yǎng)培養(yǎng)具有生長(zhǎng)速率快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)過(guò)程易控制等優(yōu) 點(diǎn)，但利用異養(yǎng)微藻生產(chǎn)生物柴油的主要問(wèn)題在于該方法依賴(lài)有機(jī)碳源(如葡萄 糖、淀粉等)為原料，增加了生產(chǎn)成本。考慮到自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)發(fā)酵的各自?xún)?yōu)勢(shì)與不足，我們?cè)O(shè)計(jì)了一套先自養(yǎng)后異養(yǎng)培養(yǎng)工藝生產(chǎn)生物柴油。流程如下首先讓小球藻利用無(wú)機(jī)碳源(C02)，在光照 自養(yǎng)條件下積累生物量；然后濃縮細(xì)胞；再補(bǔ)充有機(jī)碳源(葡萄糖)，使小球藻細(xì) 胞轉(zhuǎn)而大量積累油脂。整個(gè)過(guò)程通過(guò)直接利用光能，提高了能量的利用效率，節(jié) 省了有機(jī)碳源的使用，而且大量吸收了溫室氣體，對(duì)環(huán)境友好。另一方面，該工 藝所采用的細(xì)胞濃縮技術(shù)有效的規(guī)避了高密度自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中光照受限的問(wèn)題。 再通過(guò)整合發(fā)酵技術(shù)，可以充分發(fā)揮微藻在異養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)脂肪積累快速的優(yōu)勢(shì)，這 對(duì)于生物柴油的產(chǎn)量提高和成本控制都具有重要價(jià)值。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于開(kāi)辟一條先自養(yǎng)后異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的途徑。 在現(xiàn)有異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵制備生物柴油的研究成果和專(zhuān)利技術(shù)的基礎(chǔ)上，我 們引入了光合自養(yǎng)培養(yǎng)、細(xì)胞濃縮、發(fā)酵污染控制等工藝，以滿(mǎn)足微藻生物柴油 大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的要求。本發(fā)明的關(guān)鍵在于創(chuàng)新設(shè)計(jì)并建立了一套先自養(yǎng)后異 養(yǎng)培養(yǎng)小球藻技術(shù)和工藝，使小球藻細(xì)胞在低密度光照自養(yǎng)狀態(tài)下快速生長(zhǎng)積累 生物量，經(jīng)濃縮后轉(zhuǎn)而在高密度異養(yǎng)狀態(tài)下合成油脂。本發(fā)明內(nèi)容涉及的技術(shù)流程及方法步驟詳細(xì)描述如下-(1) 光合自養(yǎng)培養(yǎng)小球藻將淡水綠藻^7ore7h pr""力eco2Ves平板培養(yǎng)物接種至光生物反應(yīng)裝置， 在自養(yǎng)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)；光生物反應(yīng)裝置包括通氣瓶、光生物反應(yīng)器和開(kāi)放培 養(yǎng)池；具體培養(yǎng)條件設(shè)置如下溫度控制在20-45。C的范圍內(nèi)'C，以3(TC為最佳； 甘氨酸初始濃度介于1-15 g.L—'，優(yōu)選5 g.L—'; pH值控制在5-9之間，以6. 5為佳； 通入空氣或空氣、C02的混合氣體，通氣量50-300 L/h，優(yōu)選80-120L/h; C(V濃度 0.9-3%。培養(yǎng)過(guò)程中采用25-200umol.m—2s—i的日光照射?？偱囵B(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng) 情況而定， 一般介于50-400小時(shí)，優(yōu)選120-200小時(shí)；(2) 細(xì)胞濃縮細(xì)胞濃縮采用高速離心、絮凝沉降或過(guò)濾技術(shù)，以高速離心為例，在無(wú)菌條件下，離心力為2000 8000 g， 4 。C下離心2-5 min，離心后棄上清，保留自養(yǎng)細(xì) 胞沉淀； (3) 異養(yǎng)發(fā)酵在小球藻從自養(yǎng)向異養(yǎng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)特性和生化組分均發(fā)生了明顯 的改變，葉綠素含量降低，光合片層結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞密度降低。通過(guò)添加有機(jī)碳 源可以使大部分代謝流流向脂肪的合成途徑，為此，異養(yǎng)條件下細(xì)胞高密度培養(yǎng)和脂肪的合成工藝設(shè)置如下將收集得到的自養(yǎng)細(xì)胞重新懸浮于含有機(jī)碳源的無(wú)菌培養(yǎng)基中，使細(xì)胞初始密度介于10-100g.L—'之間，其中有機(jī)碳源為葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木 薯淀粉水解物、小麥淀粉水解物和高粱汁等，初始還原糖濃度選定在O. 01-100 g. L—1 之間，優(yōu)選23g.L—、異養(yǎng)發(fā)酵可在不同容積的發(fā)酵設(shè)備中進(jìn)行。發(fā)酵之前，組裝好溫度、pH、溶 氧電極(已校正)和消泡電極，加入異養(yǎng)培養(yǎng)基并高壓滅菌。發(fā)酵條件設(shè)定如下 發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，調(diào)整罐壓、空氣流量及轉(zhuǎn)速使初始氧飽和度達(dá)到100%;溫度25-30 。C，優(yōu)選29。C;通氣速率100-300 L/h;補(bǔ)加酸堿溶液(KOH，貼04等)將發(fā)酵體 系的pH值控制在6.0-8.0的范圍之內(nèi)；在發(fā)酵過(guò)程中，控制攪拌速率使氧飽和度始 終維持在10%以上；當(dāng)碳源耗盡溶氧(DO)水平陡然上升，這時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加有機(jī)碳源， 維持發(fā)酵液中還原糖濃度在l-30g. L"的范圍內(nèi)波動(dòng)。通過(guò)取樣測(cè)定細(xì)胞密度和培 養(yǎng)基中殘留的還原糖濃度考察碳源消耗情況和細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況，通過(guò)尼羅紅染色 及熒光測(cè)定技術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中中性脂肪的變化情況。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)100g.L—、油脂 含量達(dá)到細(xì)胞干重的50%以上時(shí)，終止發(fā)酵?？偘l(fā)酵時(shí)間介于50-300小時(shí)之間。為了防止自養(yǎng)培養(yǎng)和細(xì)胞濃縮過(guò)程可能引起的雜菌污染，在發(fā)酵液中添加抑 菌劑，抑制雜菌生長(zhǎng)，抑菌劑為氯霉素或單氟乙酸鈉(MFA)，氯霉素終濃度介于 0, 002-0.02 g.L—1，優(yōu)選0.01 g.L—、單氟乙酸鈉終濃度介于O. 5-50mM，優(yōu)選2mM。(4) 藻細(xì)胞收集和干燥采用固-液分離技術(shù)，從發(fā)酵液中收集藻細(xì)胞。該過(guò)程包括沉降、過(guò)濾、離心 和干燥工藝；分離得到的藻細(xì)胞以固體形態(tài)(干粉)存放，干燥方式為冷凍干燥 或噴霧干燥等。(5)從干燥的藻細(xì)胞中提取油脂從干燥的藻細(xì)胞中提取油脂的方法為高壓溶劑萃取法或索式抽提法。采用索 式抽提法時(shí)，以正己垸為標(biāo)準(zhǔn)萃取溶劑，從干藻粉中提取油脂，正己烷反復(fù)淋洗， 直至細(xì)胞中不再殘留脂肪，然后減壓去除溶劑。 (6)酯化反應(yīng)制備生物柴油以藻細(xì)胞中提取的油脂制備生物柴油采用酯化反應(yīng)完成。脂肪酸.到脂肪酸酯 的轉(zhuǎn)化包括但不限于強(qiáng)酸催化(如濃硫酸)、脂肪酶催化等。催化生成的脂肪酸 甲酯為生物柴油的主要成分。上述自養(yǎng)培養(yǎng)基配方為KH2P04: 0. 2 0. 7 g.L—、 K2HP04: 0. 1 0. 3 g. 1/、MgS04 7H20: 0. 1 0. 3 g. L_1， FeS04 7H20 : 0. l 3 mg. L—'，甘氨酸0. l 15g. L '， 維生素Bl: 0. 001 0. lmg. L—1， A5微量元素液0. 1 5ml.L—1，其中A5微量元素液組成貼03: 2. 86g. L', Na2Mo04 2H20 : 0 . 039 g. L'， ZnS04'7H20 : 0. 222 g. L 1MnCl2'4H20: 1.81 g. L \ CuS04 5H20: 0.074 g.L、異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，但不添加甘氨酸，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度 為0.01-100g.L—、異養(yǎng)培養(yǎng)中，通過(guò)連續(xù)添加有機(jī)碳源控制還原糖濃度波動(dòng)的范 圍在1-30 g. L-1本發(fā)明的有意效果在于本發(fā)明采用了先自養(yǎng)培養(yǎng)，再異養(yǎng)發(fā)酵的方式，將藻 細(xì)胞的生長(zhǎng)與脂肪的合成過(guò)程分別進(jìn)行優(yōu)化處理，并有機(jī)整合，所采用的細(xì)胞濃 縮技術(shù)可以有效的規(guī)避高密度自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中光照受限的問(wèn)題。本發(fā)明不僅保證 了較高的光能轉(zhuǎn)化效率，而且可獲得較高的脂肪含量，最終得到的微藻細(xì)胞密度 (單位產(chǎn)量)達(dá)到108g (干重)/L，細(xì)胞油脂含量大于50%。生產(chǎn)能力較單一的光合自養(yǎng)培養(yǎng)模式大幅度提高，而葡萄糖的消耗和二氧化碳的釋放較異養(yǎng)發(fā)酵則顯 著降低。該工藝有效地控制了生物柴油的原料成本，滿(mǎn)足了微藻生物柴油工業(yè)化 應(yīng)用的要求，是一條經(jīng)濟(jì)、高效地制備生物柴油原料油脂的新途徑。


圖1從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步法培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的操作流程及步驟。圖2在光生物反應(yīng)裝置中自養(yǎng)小球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。圖3 5L生物反應(yīng)器中異養(yǎng)轉(zhuǎn)化后微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和葡萄糖消耗曲線(xiàn)。圖4熒光分光光度計(jì)測(cè)得的尼羅紅染色細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。(上圖a為自養(yǎng)小球藻染色結(jié)果，下圖b為異養(yǎng)轉(zhuǎn)化后小球藻染色結(jié)果，680nm處為葉綠素發(fā)射峰，570nm處為尼羅紅發(fā)射峰)具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法。它是在 已有微藻異養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的研究成果和專(zhuān)利技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入光照 自養(yǎng)培養(yǎng)、細(xì)胞濃縮、發(fā)酵污染控制等工藝來(lái)進(jìn)一步滿(mǎn)足微藻生物柴油大規(guī)模工 業(yè)化應(yīng)用的要求。技術(shù)及方法與下面根據(jù)圖l所示的本發(fā)明的流程步驟，列舉實(shí)施 例對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例含油藻株一淡水綠藻(原始小球藻)(C力o乃reL a; r""力eca^e》購(gòu)自美國(guó) Texas大學(xué)藻種中心，自1990年起，清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系微藻生物能源實(shí)驗(yàn) 室長(zhǎng)期培養(yǎng)該藻種用于生物能源的研究，其自養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下KH2P04:0.6 g. L—1 ， K2HP04:0. 4 g. L— 1 ， MgS04 7H20:0.4 g. I/1 ， FeS(WH20 : 1 nig.!/1,甘氨酸3g.L—'，維生素Bl: 0.03 mg,L-1， A5微量元素液1.5ml.L—'，其中A5微量元素液組成H3B03: 2. 86g. L—'， Na2Mo04 2H20 : 0 . 039g. L', ZnS04 7H20: 0, 222 g. L—' MnCl2 4H20: 1. 81 g. L', CuS04 5H20 : 0. 074 g, L';通過(guò)步驟l中所描述的方法，將生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的小球藻單菌落接種至1L通氣瓶中，使細(xì)胞初始密度達(dá)到0. lg.L—、置通氣培養(yǎng)瓶于25'C光照培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，通入空氣，通氣量設(shè)為100L/h。在自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，考察了不同培養(yǎng)條件如 氮源、光照強(qiáng)度等對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。生長(zhǎng)條件優(yōu)化過(guò)程如下分別采用 備l、3、5、7、9g. L—'甘氨酸的自養(yǎng)培養(yǎng)基，在光照強(qiáng)度為20、50、100、200iimol.m—2s—1 的條件下進(jìn)行考察培養(yǎng)，優(yōu)化結(jié)果顯示，在上述培養(yǎng)溫度、通氣量條件下，甘氨 酸濃度為5g.L—'，光照強(qiáng)度100umol.m—2s—'時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)最佳(如圖2所示)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期后，停止通氣，靜置12小時(shí)，使細(xì)胞自然沉降，棄 上清，殘留培養(yǎng)基通過(guò)離心(3000g， 2min)去除，該過(guò)程采用無(wú)菌操作。準(zhǔn)備5L發(fā)酵罐(MINIFORS，瑞士)，組裝好溫度、pH、溶氧電極(已校正) 和消泡電極，加入異養(yǎng)培養(yǎng)基，121。C滅菌30分鐘。異養(yǎng)培養(yǎng)基成分如下KH2P04: 0. 6 g. L—、 K2HP04: 0. 4 g. L—、 MgS04 7H20: 0. 4 g. CFeSC^ 7H20: 0. 5 mg. L一1， 維生素Bl:. 0.08mg.L—'， As微量元素液1.5 ml.L—、葡萄糖23g.L—、為防止雜 菌污染，向培養(yǎng)基中添加單氟乙酸鈉(MFA)至終濃度為lmM。將收集得到的自養(yǎng) 小球藻細(xì)胞重新懸浮，并轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，使細(xì)胞初始密度達(dá)到20g.L—、異養(yǎng)培養(yǎng)條件設(shè)定如下溫度29'C，通氣速率150L/h，通過(guò)補(bǔ)加酸或堿溶液 (K0H， HsS04等)調(diào)節(jié)pH值為6.2士0.2，在線(xiàn)監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐中的溶氧變化， 一旦溶氧 低于飽和度的10%以下時(shí)，通過(guò)逐步提高攪拌速率，使發(fā)酵液中的溶氧飽和度維持 在10%以上；當(dāng)碳'源耗盡時(shí)溶氧(DO)水平陡然上升，這時(shí)開(kāi)始添加葡萄糖，將作 為還原糖的葡萄糖濃度控制在1-30 g.L—'的范圍內(nèi)，通過(guò)在5L發(fā)酵罐中采用補(bǔ)料 流加和過(guò)程控制的方式建立高密度培養(yǎng)策略監(jiān)控發(fā)酵罐中溶氧、葡萄糖、細(xì)胞 濃度的變化，并同時(shí)采用尼羅紅熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)藻細(xì)胞中的中性脂肪含量(具 體檢測(cè)步驟參見(jiàn)參考文獻(xiàn)"Danielle E， David J， Barry R， " a丄 2007. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. Journal of Microbiological Methods, 68 (3) : 639-642.")。發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞密度通過(guò)定時(shí)測(cè)定光密度值(0D54。m)來(lái)估算。ODs一與細(xì)胞干重的線(xiàn)性關(guān)系可以用以下公式表 示y = 0. 4155x， (R2 二 0.9933， P<0. 05)，其中y表示細(xì)胞密度(g. L—。 ， x表 示540 nm處光吸收密度值。發(fā)酵完成后，從發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，并真空干燥。 發(fā)酵液以8000g的速度離心2min，收集沉淀，真空干燥，稱(chēng)重，共得到108 g. L—1 的干藻粉(如圖3所示)。利用半自動(dòng)的溶劑萃取裝置一索式抽提器，以正己垸為標(biāo)準(zhǔn)萃取溶劑，從干 藻粉中提取油脂。在索式抽提器中，用正己垸反復(fù)淋洗細(xì)胞，直至細(xì)胞中不再殘留脂肪。異養(yǎng)藻油脂的分子量計(jì)算公式如下分子量(M) = 56. 1X 1000X3/(SV-AV)，式中SV (Saponification Value)代 表微藻油脂的皂化值，AV (Acid Value)代表微藻油脂的酸值，計(jì)算得到的微藻 油脂的分子量是無(wú)量綱數(shù)值。經(jīng)過(guò)溶劑減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾后對(duì)索式抽提法獲得的油脂干燥后進(jìn)行稱(chēng)重，以油脂凈 重除以細(xì)胞干重，得細(xì)胞干重的油脂含量為52% (w/w)。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中總共消 耗的葡萄糖為280 g. L—、得到油脂56. 16g. L—'(即108 g. L/'X52%)，轉(zhuǎn)化率達(dá)20. 06 %。根據(jù)我們以前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用異養(yǎng)高密度發(fā)酵時(shí)，糖油轉(zhuǎn)化率大約在10 — 17%之間。這充分說(shuō)明在同等條件下，采用兩步法培養(yǎng)可有效降低有機(jī)碳源的消耗。 酯化反應(yīng)由濃硫酸催化完成。取一定摩爾質(zhì)量的藻油于燒瓶中，加入等量的 濃硫酸作為催化劑，再加入甲醇溶劑，使醇油摩爾比達(dá)到30: 1，反應(yīng)在55。C的恒 溫?fù)u床中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，混合反應(yīng)體系分成上下兩 層，分離位于上層的生物柴油，并置于3(TC的溫水中淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑， 得到純凈的生物柴油。通過(guò)利用氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)可分析體系中甘油三酯、二酯、 一酯、甲醇 和甘油等的含量，據(jù)此可計(jì)算從油脂到脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率。采用DSQGC (Thermo， USA , VARIAN VF-5ms毛細(xì)管柱30MW. 25醒)氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀進(jìn)行分析。 流速設(shè)定為10mlmin—\升溫程序先升溫到70"C，保持2min;然后以10。C min—1的速度將溫度上升到300。C,保持20 min。注射口溫度250。C，分流比為30:1。在 48小時(shí)的酯化反應(yīng)過(guò)程中，90%以上的微藻油脂可轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(生物柴油)， 柴油的主要成分與異養(yǎng)發(fā)酵得到的藻油成分一致(如圖4所示)。
權(quán)利要求
1. 一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于該方法是以在先自養(yǎng)后異養(yǎng)培養(yǎng)方式獲得高含油量的微藻細(xì)胞為原料制備生物柴油，具體步驟包括(1)小球藻的自養(yǎng)培養(yǎng)；(2)細(xì)胞濃縮；(3)異養(yǎng)發(fā)酵；(4)藻細(xì)胞收集和干燥；(5)從干燥的藻細(xì)胞中提取油脂；(6)酯化反應(yīng)制備生物柴油。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于，所述步驟(l)的自養(yǎng)培養(yǎng)步驟為將淡水綠藻C7z/ow〃a / rato^co^^平 板培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)池或光生物反應(yīng)裝置中進(jìn)行光照培養(yǎng)，溫度控制在 20-45。C的范圍內(nèi)；甘氨酸初始濃度l-15g丄"；pH值控制在5-9之間；通氣量50-300 L/h， 002濃度0.9-3%，培養(yǎng)過(guò)程中采用25-20(Vmol.m—、"的日光照射，使細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá) 到最佳。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述自養(yǎng)-異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法，其 特征在于，所述步驟(2)的細(xì)胞濃縮方法為高速離心、絮凝沉降或過(guò)濾技術(shù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于，所述步驟(3)異養(yǎng)發(fā)酵的細(xì)胞初始密度控制在5-100 g丄"之間，溫度 15-45°C，通氣速率控制在120-250L/h。通過(guò)補(bǔ)加酸或堿溶液，將pH值控制在5.0-9.0 的范圍之內(nèi)；通過(guò)補(bǔ)加有機(jī)碳源維持發(fā)酵液中還原糖濃度在1-40 g丄"的范圍內(nèi)波 動(dòng)；控制攪拌速率使發(fā)酵液中的氧飽和度始終維持在10%以上；在發(fā)酵液中添加 氯霉素或單氟乙酸鈉，以防止自養(yǎng)培養(yǎng)和細(xì)胞濃縮過(guò)程可能引起的雜菌污染，氯 霉素終濃度控制在0.002-0.2 g丄"，單氟乙酸鈉終濃度控制在0.1-100mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于，所述制備生物柴油的工藝為首先提取藻粉油脂，然后以酯交換反應(yīng) 完成在藻粉油脂中加入醇油摩爾比30:1的甲醇，在濃硫酸的催化下，加熱至20 。C 9(TC， 20 160rpm恒溫?fù)u床中溫育，反應(yīng)生成的產(chǎn)物，經(jīng)石油醚及水洗滌，離心取有機(jī)相，將有機(jī)溶劑蒸發(fā)、干燥后獲得生物柴油，并分離出副產(chǎn)品甘油。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于，所述的自養(yǎng)培養(yǎng)基成分為KH2P04: 0.2 0.7g丄'1, K2HP04: 0.1 0.3g丄"，MgS04'7H20: 0.1 0.3g丄-1， FeS04'7H20 : 0.1 3mg丄"，甘氨酸0.1 15g丄—i，維生素Bh O.OOl-O.lmgl/1, A5微量元素液O-l-SmLU1,其中A5微量元素液組成H3B03: 2.86g丄"，Na2MoCV2H20: 0.039 g丄"，ZnS04.7H20: 0.222g丄1 MnCl24H20: 1.81 g丄"，CuS04-5H20: 0.074 g丄"；異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，但不添加甘氨酸，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為0.01-100g丄"；異養(yǎng)培養(yǎng)中，通過(guò)連續(xù)添加有機(jī)碳源控制還原糖濃度波動(dòng)的范圍在1-30 g丄"
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于，所述異養(yǎng)培養(yǎng)基加入屬于還原糖的有機(jī)碳源包括葡萄糖或其他單糖、 二糖或多糖；有機(jī)碳源來(lái)源包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解 物、小麥淀粉水解物和高粱汁。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于可再生生物能源領(lǐng)域的一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法。該方法從小球藻的自養(yǎng)培養(yǎng)、細(xì)胞濃縮、發(fā)酵污染控制等工藝將濃縮的自養(yǎng)藻轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，使之合成中性脂肪。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化與過(guò)程控制，建立了有效的補(bǔ)料流加策略使脂肪合成達(dá)到最佳。生物量可達(dá)108g.L^-1、油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的52％。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)抽提藻油，轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油。本發(fā)明所采用的細(xì)胞濃縮技術(shù)可以有效的規(guī)避高密度自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中光照受限的問(wèn)題。既可減少二氧化碳的排放，又可降低了有機(jī)碳源的消耗，節(jié)省生物柴油原料制備的成本。整條技術(shù)路線(xiàn)環(huán)保、高效，可以滿(mǎn)足微藻生物柴油工業(yè)化應(yīng)用的要求。
文檔編號(hào)C12R1/89GK101280328SQ200810112998
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者吳慶余, 偉 熊 申請(qǐng)人:清華大學(xué)