專(zhuān)利名稱(chēng)：異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的補(bǔ)料方法，具體地說(shuō)，是一種異養(yǎng)培養(yǎng) 小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
小球藻是一種單細(xì)胞微藻，含有豐富的蛋白質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素、多糖、維生素 和小球藻生長(zhǎng)因子等多種營(yíng)養(yǎng)及活性成份，具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力和 預(yù)防心血管疾病等生理功能。小球藻規(guī)?；囵B(yǎng)中的挑戰(zhàn)之一是如何高效地生產(chǎn) 小球藻細(xì)胞，而這在傳統(tǒng)的自養(yǎng)培養(yǎng)中難以實(shí)現(xiàn)。異養(yǎng)培養(yǎng)由于可獲得較高的小 球藻細(xì)胞密度和生產(chǎn)效率而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，并被認(rèn)為是最具前途和希望 的生產(chǎn)方式之一。由于較高的葡萄糖濃度對(duì)于小球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用， 因此，采用分批一補(bǔ)料培養(yǎng)，保持培養(yǎng)過(guò)程中較低的葡萄糖濃度和較高的葡萄糖 總量，是提高小球藻生產(chǎn)效率的必要方式。關(guān)于小球藻的分批一補(bǔ)料培養(yǎng)目前已 有一些研究報(bào)道，普通小球藻的分批一補(bǔ)料培養(yǎng)試驗(yàn)，小球藻的細(xì)胞干重和生產(chǎn) 效率分別達(dá)到43.31 g/1和0.62 g/l/h;有研究在對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖和氮源濃 度優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行普通小球藻的分批一補(bǔ)料培養(yǎng)試驗(yàn)，細(xì)胞干重和生產(chǎn)效率 分別達(dá)到34. 1 g/1和0. 58 g/l/h。在上述研究中，基本上均采用脈沖式的補(bǔ)料， 這通常會(huì)造成底物濃度較大幅度的改變，從而影響小球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)；此外，在 補(bǔ)料策略的確定上也主要依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Shi XM (史賢明)等在《Biotechnology Progress》(生物技術(shù)進(jìn)展)2002, 18: 723-727上發(fā)表的"High-yield production of lutein by the green microalga Chlorella protothecoides in heterotrophic fed-batch culture"(通過(guò)原殼小球藻的異養(yǎng)分批-補(bǔ)料培養(yǎng)高 效生產(chǎn)葉黃素)，該文中提出一種原殼小球藻的分批-補(bǔ)料培養(yǎng)工藝，具體方法 為首先進(jìn)行葡萄糖起始濃度為40 g/l左右的分批培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度降至10
%以下時(shí)開(kāi)始間歇補(bǔ)料，并維持培養(yǎng)過(guò)程中的葡萄糖濃度在10 — 30g/l之間，細(xì) 胞干重和生產(chǎn)效率分別達(dá)到48 g/l和0.2 g/l/h。該工藝的主要不足在于(1) 采用間歇式的補(bǔ)料，造成底物濃度的較大波動(dòng)，影響小球藻的生長(zhǎng)；(2)補(bǔ)料策 略的確定依賴(lài)于頻繁的取樣測(cè)定及經(jīng)驗(yàn)，缺乏簡(jiǎn)便有效的控制方式；(3)小球藻 的細(xì)胞密度與酵母和大腸桿菌等的分批一補(bǔ)料培養(yǎng)水平(細(xì)胞密度通常大于ioo g/1)相比，還存在相當(dāng)差距。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有小球藻異養(yǎng)高密度培養(yǎng)技術(shù)中的不足，提供一 種基于動(dòng)力學(xué)分析的簡(jiǎn)便有效的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，實(shí)現(xiàn)小球藻的 高密度培養(yǎng)。本發(fā)明可使小球藻的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到100 g/l(干 重)和1.0 g/l/h以上。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括如下步驟
(1)在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)分批培養(yǎng)，建立小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的非結(jié) 構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型。
所述在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)分批培養(yǎng)，是指采用改良的Basal培 養(yǎng)基，其組分mg/1為1升水中含有KN03 7000， KH2P04 1250， MgS04'7H20 1000, EDTA500， H3B03 114.2， CaCl2'2H20 111 ， FeS04-7H20 49.8， ZnS04'7H20 88.2， MnCl2.4H20 14.2， Mo03 7.1， CuS04'5H20 15.7， Co(N03)2.6H20 4.9，添
加40 g/1左右的葡萄糖。在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻分批異養(yǎng)培養(yǎng)，并動(dòng)態(tài)測(cè)定培 養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞濃度和葡萄糖濃度。
所述建立小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型，具體為采用非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué) 模型(l)-(3)描述異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗
<formula>formula see original document page 5</formula> (1)
<formula>formula see original document page 5</formula>(2)
<formula>formula see original document page 5</formula> (3)
式中X為細(xì)胞濃度(g/1); Wm為最大比生長(zhǎng)速率(h—"， Ks為葡萄糖的飽和常
數(shù)(g/l)， Id為葡萄糖的抑制常數(shù)(g/l)， L為生物量的抑制常數(shù)(g/l)， S為 葡萄糖濃度(g/1); F為流加速率(l/h，對(duì)分批培養(yǎng)而言F-O); V為培養(yǎng)基體 積(1); Yxs為生物量對(duì)葡萄糖的得率(g/g); S為葡萄糖濃度(g/1); S^為流 加培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度(g/l)。
通過(guò)對(duì)分批培養(yǎng)中小球藻細(xì)胞濃度和葡萄糖濃度的動(dòng)態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)的擬合，得 到模型參數(shù)。
(2) 在動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的初步優(yōu)化。 在分批一補(bǔ)料培養(yǎng)中，如補(bǔ)料速率過(guò)快，會(huì)造成培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度升
高，從而使小球藻生長(zhǎng)受到抑制。
在分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，采用遺傳算法進(jìn)行補(bǔ)料方式的初步優(yōu)化。 將整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程分為若干階段，每一階段時(shí)間為24 h，以各階段的補(bǔ)料速率為 變量，以培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的小球藻細(xì)胞濃度為適應(yīng)度函數(shù)，優(yōu)化目標(biāo)為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的 細(xì)胞濃度最大。參照優(yōu)化的補(bǔ)料策略，在發(fā)酵罐中進(jìn)行分批一補(bǔ)料培養(yǎng)。
(3) 在多批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。
在進(jìn)行多批小球藻分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。模 型方程式如下<formula>formula see original document page 6</formula>, (5)<formula>formula see original document page 6</formula> (6)
其中比生長(zhǎng)速率U(t)用含有一個(gè)隱含層的三層反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)代表。 以培養(yǎng)過(guò)程中t時(shí)刻的葡萄糖濃度為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入，t時(shí)刻的小球藻比生長(zhǎng)速率 為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出。對(duì)各批培養(yǎng)中的小球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行平滑處理，然后按照下式
計(jì)算比生長(zhǎng)速率(對(duì)分批培養(yǎng)而言F=0):
<formula>formula see original document page 6</formula> =---+ — (7)
將計(jì)算所得到的比生長(zhǎng)速率和相應(yīng)時(shí)刻的葡萄糖濃度分別作為輸出和輸入 的樣本訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
(4)在混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)化 設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間，基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用遺傳算法進(jìn)行流加培養(yǎng)方式 的優(yōu)化，將整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程分為若干階段，以各階段的補(bǔ)料速率為變量，以培養(yǎng)結(jié) 束時(shí)的小球藻細(xì)胞濃度為適應(yīng)度函數(shù)，優(yōu)化目標(biāo)為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度最大。 然后參照基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化結(jié)果確定分批一補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中的流加 策略。
本發(fā)明通過(guò)基于動(dòng)力學(xué)模型的流加方式的優(yōu)化，小球藻的最高細(xì)胞濃度和 生產(chǎn)效率均可得到顯著提高，最終的小球藻細(xì)胞濃度〉100 g/1 (干重)，生產(chǎn)效 率〉1. 0 g/l/h，分別達(dá)到背景技術(shù)中文獻(xiàn)報(bào)道分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的2倍和5倍以上。
所述小球藻藻株的公開(kāi)方式為直接從外國(guó)購(gòu)買(mǎi)，如Carolina Biological Supply, Burlington, NC， USA (美國(guó)北卡羅來(lái)納州伯靈頓市的卡羅來(lái)納生物供 應(yīng)公司)。


圖l為19升發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)Batch-l細(xì)胞生長(zhǎng)(A)和葡萄糖消耗(口)。 圖2為19升發(fā)酵罐中分批一補(bǔ)料培養(yǎng)FB-l至FB-4的補(bǔ)料方案、細(xì)胞生長(zhǎng)(△: 和葡萄糖消耗(□) (a、 c、 e、 g， FB-1至FB-4中的補(bǔ)料方案；b、 d、 f、 h， FB-1至FB-4中的細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗)，曲線(xiàn)為混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的計(jì)算結(jié)果。
圖3為19升發(fā)酵罐中分批一補(bǔ)料培養(yǎng)FB-5的補(bǔ)料策略(a)，細(xì)胞生長(zhǎng)(A) 和葡萄糖消耗(□) (b)，曲線(xiàn)為混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的計(jì)算結(jié)果。
圖4為19升發(fā)酵罐六批培養(yǎng)中的小球藻最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效率的比較(柱 狀圖，最高細(xì)胞濃度；折線(xiàn)圖，生產(chǎn)效率)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為甜提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
一、小球藻的分批培養(yǎng)及非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型的建立
所采用的小球藻藻株為Chlorella pyrenoidosa 15-2070 (購(gòu)自Carolina Biological Supply, Burlington, NC， USA)，培養(yǎng)基為改良的Basal培養(yǎng)基， 組分mg/1為認(rèn)037000， KH2P04 1250， MgS04'7H20 1000， EDTA500， H3B03 114.2， CaCl2.2H20 111， FeS047H20 49.8， ZnS047H20 88.2， MnCl2.4H20 14.2， Mo03 7.1， CuS04.5H20 15.7， Co(N03)2'6H20 4.9，添加34.68 g/1的葡萄糖，培 養(yǎng)基中葡萄糖和KN03濃度之比為6:1。在19升發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng) (Batch-1)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基裝量12 1; 接種量10% (v/v); pH 6. 5; 溫
度28。C;溶解氧50%飽和濃度；攪拌轉(zhuǎn)速與溶解氧濃度相關(guān)聯(lián)，最低攪拌轉(zhuǎn)速
設(shè)定為200 i"pm。在培養(yǎng)過(guò)程中取樣測(cè)定葡萄糖和小球藻細(xì)胞濃度。葡萄糖濃度 的測(cè)定采用二硝基水楊酸(DNS)法；小球藻生物量采用細(xì)胞干重法測(cè)定。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)圖l。經(jīng)過(guò)78h的培養(yǎng)達(dá)到最高細(xì)胞濃度20. 03 g/l，生物量的最大生產(chǎn) 效率為0. 255 g/l/h。
采用非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型(l) - (3)描述異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)和 葡萄糖消耗
<formula>formula see original document page 8</formula>(1)
(2)
(3)
式中X為細(xì)胞濃度(g/1); Um為最大比生長(zhǎng)速率(h—》，Ks為葡萄糖的飽和常
數(shù)(g/l)， K,為葡萄糖的抑制常數(shù)(g/l)， L為生物量的抑制常數(shù)(g/l)， S為 葡萄糖濃度(g/1); F為流加速率(l/h，對(duì)分批培養(yǎng)而言F=0); V為培養(yǎng)基體 積(1); Yxs為生物量對(duì)葡萄糖的得率(g/g); S為葡萄糖濃度(g/1); Sm為流 加培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度(g/l)。
通過(guò)對(duì)分批培養(yǎng)Batch-l中小球藻細(xì)胞濃度和葡萄糖濃度的動(dòng)態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)的 擬合，得到模型參數(shù)如下"m =0.213 (h—1); Ks=2.748 (g/1); Id =18.468(g/l); KIX=17.773 (g/l); Yxs =0.462 (g/g)。由圖1看，模型較好地?cái)M合了
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
二、基于動(dòng)力學(xué)模型的補(bǔ)料一分批培養(yǎng)的初步優(yōu)化
在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在19升發(fā)酵罐中進(jìn)行了四批分批一補(bǔ)料培養(yǎng)(FB-1 至FB-4)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為10 g/1左右，補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖 濃度分別為310 g/1， 375 g/1， 417 g/l，和380 g/1。培養(yǎng)基中的其它組分與 葡萄糖按比例提供。培養(yǎng)條件為起始培養(yǎng)基裝量10 1;接種量10% (v/v); pH
6. 5;溫度28。C;溶解氧50%飽和濃度；攪拌轉(zhuǎn)速與溶解氧關(guān)聯(lián)，最低攪拌
轉(zhuǎn)速設(shè)定為200 rpm。
由于高濃度的葡萄糖對(duì)小球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)存在抑制作用，因此補(bǔ)料過(guò)快會(huì) 造成培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度升高，從而導(dǎo)致小球藻生長(zhǎng)的減慢。在圖2a至圖2d 中可以看到，在分批一補(bǔ)料培養(yǎng)FB-1和FB-2中，由于補(bǔ)料速率過(guò)快，培養(yǎng)過(guò) 程中葡萄糖濃度升高，小球藻生長(zhǎng)受到抑制，在培養(yǎng)結(jié)束后僅得到20 g/1左右 的細(xì)胞濃度。
為改進(jìn)補(bǔ)料方式，在動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，采用遺傳算法進(jìn)行了補(bǔ)料方式 的優(yōu)化。將整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程分為若干階段，每一階段時(shí)間為24 h，以各階段的補(bǔ) 料速率為變量，以培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的小球藻細(xì)胞濃度為適應(yīng)度函數(shù)，優(yōu)化目標(biāo)為培養(yǎng) 結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度最大。參照優(yōu)化的補(bǔ)料策略，在19升發(fā)酵罐中進(jìn)行了兩批分 批一補(bǔ)料培養(yǎng)(FB-3和FB-4)，最高細(xì)胞濃度分別達(dá)到70.8g/l和104. 9 g/1， 生產(chǎn)效率分別為0. 602 g/l/h和0. 613 g/l/h (圖2e至圖2h)。在FB-4中，由 于延長(zhǎng)了補(bǔ)料時(shí)間，獲得了更高的細(xì)胞濃度。
三、混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立
通過(guò)以上對(duì)補(bǔ)料方式的初步優(yōu)化，小球藻的細(xì)胞密度和生產(chǎn)效率都得到了 顯著提高。但從圖2h看，在FB-4后期，小球藻生長(zhǎng)受到補(bǔ)料速度的限制，推 測(cè)有可能通過(guò)對(duì)補(bǔ)料方式的進(jìn)一步優(yōu)化提高小球藻的生產(chǎn)效率。
在已進(jìn)行多批小球藻培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以期能夠更 好地描述小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程，并進(jìn)行補(bǔ)料方式的優(yōu)化?；旌仙窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的 方程式如下
<formula>formula see original document page 10</formula>(6)
其中比生長(zhǎng)速率U(t)用含有一個(gè)隱含層的三層反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)代表。 以培養(yǎng)過(guò)程中t時(shí)刻的葡萄糖濃度為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入，t時(shí)刻的小球藻比生長(zhǎng)速率 為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出。對(duì)各批培養(yǎng)(Batch-1， FB-l至FB-4)中的小球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn) 行平滑處理，然后按照下式計(jì)算比生長(zhǎng)速率(對(duì)分批培養(yǎng)而言F=0):
<formula>formula see original document page 10</formula>(7)
將計(jì)算所得到的比生長(zhǎng)速率和相應(yīng)時(shí)刻的葡萄糖濃度分別作為輸出和輸入 的樣本訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)?？偣灿?3組數(shù)據(jù)用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練。為避免網(wǎng)絡(luò)的過(guò) 度訓(xùn)練，提高所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的推廣能力，采用貝葉斯正則化方法(Bayesian regularization)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練。由于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入和輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)以及 網(wǎng)絡(luò)層數(shù)均已確定，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模實(shí)際上決定于網(wǎng)絡(luò)中隱含層的節(jié)點(diǎn)數(shù)目。為 選擇適當(dāng)?shù)碾[含層節(jié)點(diǎn)數(shù)，分別采用了具有不同隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn) 練，并比較它們的訓(xùn)練誤差和有效參數(shù)的數(shù)目(后者在貝葉斯正則化方法訓(xùn)練中 代表網(wǎng)絡(luò)實(shí)際規(guī)模的大小)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為1-2時(shí)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn) 練誤差較大；當(dāng)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)大于7時(shí)，網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練誤差較小，但有效參數(shù)的 數(shù)目增大。當(dāng)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)在3-6的范圍內(nèi)，網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練誤差和有效參數(shù)都比較 適中，且變化不大。通常認(rèn)為采用規(guī)模較小的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以避免過(guò)度訓(xùn)練，從而 使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有更好的推廣性能，因此在最終選擇了隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為三的網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)。由圖2可見(jiàn)，混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能夠較好地?cái)M合各批培養(yǎng)的數(shù)據(jù)。 四、基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的進(jìn)一步優(yōu)化 設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間為120h，基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用遺傳算法進(jìn)行了流加 培養(yǎng)方式的優(yōu)化。結(jié)果顯示，小球藻的最高細(xì)胞濃度可達(dá)到121.6 g/1。盡管這 一細(xì)胞濃度與分批一補(bǔ)料培養(yǎng)FB-4中所得到的結(jié)果相近，但基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 模型的計(jì)算結(jié)果提示，該細(xì)胞濃度值有可能在更短的培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到，即生產(chǎn)效率
可以進(jìn)一步提高。參照基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了分批一補(bǔ)料培養(yǎng) FB-5，小球藻的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到116. 2 g/1和1. 020 g/l/h(圖 3)。
圖4總結(jié)了在19升發(fā)酵罐中進(jìn)行的六批培養(yǎng)中的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效 率。由圖4中可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)補(bǔ)料方式的先后兩次優(yōu)化，小球藻的最高細(xì)胞濃度和 生產(chǎn)效率均有了大幅度的提高。分批一補(bǔ)料培養(yǎng)FB-5的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效 率分別為分批培養(yǎng)Batch-l的5. 8倍和4倍；為前期文獻(xiàn)報(bào)道中分批—補(bǔ)料培養(yǎng) (細(xì)胞干重48 g/1，生產(chǎn)效率0.2 g/l/h。詳見(jiàn)Shi XM， Jiang Y， Chen F. High-yield production of lutein by the green microalga Chlorella protothecoides in heterotrophic fed-batch culture. Biotechnol Prog， 2002: 18: 723-727 (史賢明，姜悅，陳峰.通過(guò)原殼小球藻的異養(yǎng)分批-補(bǔ)料培養(yǎng)高效 生產(chǎn)葉黃素.生物技術(shù)進(jìn)展，2002， 18: 723-727))的2.4和5. l倍。
權(quán)利要求
1、一種異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)分批培養(yǎng)，建立小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型；(2)在動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批-補(bǔ)料培養(yǎng)的初步優(yōu)化；(3)在多批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；(4)在混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批-補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)化。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所 述在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)分批培養(yǎng)，建立小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型，具體為采用Basal培養(yǎng)基，其組分mg/l為KN03 7000， KH2P04 1250， MgS04'7H20 1000， EDTA500， H3B03 114.2， CaCl2'2H20 111， FeS04.7H20 49.8， ZnS04-7H20 88.2， MnCl24H20 14.2， Mo03 7.1， CuS04'5H20 15.7， Co(N03)2.6H20 4.9，添加40g/l的葡萄糖，在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻分批異養(yǎng)培養(yǎng)，并動(dòng)態(tài)測(cè)定 培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞濃度和葡萄糖濃度；采用以下非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型描述異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖 消耗，通過(guò)對(duì)分批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合得到模型參數(shù)<formula>formula see original document page 2</formula>式中X為細(xì)胞濃度g/1， um為最大比生長(zhǎng)速率h—、 Ks為葡萄糖的飽和常數(shù)g/1， K,為葡萄糖的抑制常數(shù)g/l， L為生物量的抑制常數(shù)g/l， S為葡萄糖 濃度g/l， F為流加速率l/h，對(duì)分批培養(yǎng)而言F=0， V為培養(yǎng)基體積1， Yxs為 生物量對(duì)葡萄糖的得率g/g， S為葡萄糖濃度g/1， Sin為流加培養(yǎng)基中的葡萄糖 濃度g/l。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所述在動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批一補(bǔ)料培養(yǎng)的初步優(yōu)化，具體為在分批培養(yǎng) 動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，采用遺傳算法進(jìn)行補(bǔ)料方式的初步優(yōu)化，將整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程 分為若干階段，以各階段的補(bǔ)料速率為變量，以培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的小球藻細(xì)胞濃度為 適應(yīng)度函數(shù)，優(yōu)化目標(biāo)為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度最大，參照優(yōu)化的補(bǔ)料策略，在 發(fā)酵罐中進(jìn)行分批 一 補(bǔ)料培養(yǎng)試驗(yàn)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所 述在多批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，模型方程式如下<formula>formula see original document page 3</formula>其中比生長(zhǎng)速率U (t)用含有一個(gè)隱含層的三層反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)代表， 以培養(yǎng)過(guò)程中t時(shí)刻的葡萄糖濃度為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入，t時(shí)刻的小球藻比生長(zhǎng)速率 為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出，對(duì)各批培養(yǎng)中的小球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行平滑處理，然后按照下式 計(jì)算比生長(zhǎng)速率，對(duì)分批培養(yǎng)而言F^:<formula>formula see original document page 3</formula>將計(jì)算所得到的比生長(zhǎng)速率和相應(yīng)時(shí)刻的葡萄糖濃度分別作為輸出和輸入 的樣本，采用貝葉斯正則化方法訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所述在混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批—補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)化，具體為設(shè)定培養(yǎng) 時(shí)間，基于混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用遺傳算法進(jìn)行流加培養(yǎng)方式的優(yōu)化，將整個(gè) 培養(yǎng)過(guò)程分為若干階段，以各階段的補(bǔ)料速率為變量，以培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的小球藻細(xì) 胞濃度為適應(yīng)度函數(shù)，優(yōu)化目標(biāo)為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度最大，然后參照基于混 合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化結(jié)果確定分批一補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中的流加策略。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法，包括如下步驟(1)在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)分批培養(yǎng)，建立小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型；(2)在動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批-補(bǔ)料培養(yǎng)的初步優(yōu)化；(3)在多批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；(4)在混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行分批-補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)化。本發(fā)明可使小球藻的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到100g/l(干重)和1.0g/l/h以上。
文檔編號(hào)C12N1/12GK101186880SQ20071017122
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者史賢明, 吳正云, 施春雷, 曲春波 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)