專利名稱：一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，人們在關(guān)注食品營養(yǎng)品質(zhì)的同時也對其外觀品質(zhì)提出了更高的要求。我國的傳統(tǒng)食品如面條、饅頭等對色澤的要求較高，具有白亮色澤的食品更受消費者歡迎(He等，2003；楊金等，2004)。為迎合消費者對面制品求白的心理，一些生產(chǎn)商向面粉中添加增白劑以提高面粉白度。近幾年國家質(zhì)檢部門對面粉行業(yè)的質(zhì)量抽檢報告表明，我國多數(shù)面粉增白劑含量嚴重超標(焦淑婷等，2001)。大量使用增白劑會使面粉失去麥香味，長期食用增白劑超標的面粉會加重肝臟負擔(dān)，引起慢性中毒，嚴重影響人體健康。
研究表明，面粉黃色素含量是影響面包、面條黃度的主要因素(楊金等，2004；He等，2004)。黃色素含量雖然在一定程度上受環(huán)境因素影響(Miskelly，1984)，但其主要受遺傳因素調(diào)控，遺傳力為0.67(Parker等，1998)或者更高0.88～0.97(Elouafi等，1995；Clarke等，2006)。我國312份普通冬小麥品種(系)間籽粒黃色素含量存在很大差異，變化范圍為0.35～3.42mg/kg，相差約10倍，選擇潛力很大(何中虎，2008，未發(fā)表)，通過育種途徑改良小麥黃色素含量是完全可行的。
對于黃色素含量的常規(guī)選擇方法是直接對面粉的黃色素含量進行測量，因此只能在高代(高代是指雜交育種中經(jīng)過一次雜交，然后經(jīng)多代自交和選擇而獲得的群體，該群體具有大體整齊一致的表現(xiàn)型和基因型，但還未審定成為品種，稱為高代品系)進行選擇，同時又由于環(huán)境等因素的影響，同一品種在不同年份、不同生長地點所表現(xiàn)出的表型值可能會有較大的差異。分子標記輔助選擇(Marker assisted selection，MAS)是基于基因型的選擇，不受外界環(huán)境因素的影響，被越來越廣泛地應(yīng)用于育種實踐中。常用的分子標記類型有RFLP、AFLP、SSR等，但這些標記類型不能與目標基因共分離，同時在分子育種中應(yīng)用成本較高，因此亟待開發(fā)準確而又經(jīng)濟的分子標記類型。功能標記(Functionalmarker)是一類基于基因特征序列開發(fā)的標記，與目標基因共分離，大大提高了選擇的準確性(Bagge等，2007)，在MAS中有著廣泛應(yīng)用前景。
雖然影響黃色素的基因較多，但大量QTL定位表明，影響小麥黃色素含量的關(guān)鍵基因位于7A與7B染色體上(Parker等，1998；Elouafi等，2001；Mares等，2001；張立平等，2006；Kuchel等，2006)，可解釋表型變異的30-60％。但與這些QTL緊密連鎖的分子標記大多為AFLP和SSR等非基因特異性標記，不能與目標基因共分離，同時在分子育種中應(yīng)用成本較高，因此不能廣泛用于分子輔助育種。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明提供的小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白，是如下1)或2)或3)或4)或5)的蛋白質(zhì) (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (5)將序列1、3、5或7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的由序列1、3、5或7衍生的蛋白質(zhì)。
為了使所述蛋白便于純化，可在由序列表中序列1、序列3、序列5或序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
表1標簽的序列 上述蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2、序列4、序列6或序列8所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述蛋白編碼基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子 1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 3)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子； 4)其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子； 5)在嚴格條件下與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 6)與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
上述嚴格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
基于所述蛋白的編碼基因及其等位變異，本發(fā)明還提供了兩對標記引物。
本發(fā)明提供的標記引物A，是由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對引物。
本發(fā)明提供的標記引物B，是由序列表中序列11的核苷酸序列和序列12的核苷酸序列組成的一對引物。
基于所述編碼基因及其等位變異以及所述標記引物，本發(fā)明提供了一種檢測小麥黃色素含量性狀的方法。
本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，用所述標記引物A進行PCR擴增，檢測PCR擴增產(chǎn)物中是否有156bp的條帶或151bp的條帶；如PCR擴增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，再以所述待測小麥基因組DNA為模板，用所述標記引物B進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物中是否有428bp的條帶。
所述方法中，如所述標記引物A的PCR擴增產(chǎn)物中有156bp的條帶或151bp的條帶，所述待測小麥為候選低黃色素含量小麥；如所述標記引物A的PCR擴增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，而所述標記引物B的PCR擴增產(chǎn)物中有428bp的條帶，所述待測小麥為候選高黃色素含量小麥。
用所述標記引物A進行PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物可通過6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測；用所述標記引物B進行PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物可通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
所述小麥具體可為普通小麥。
所述方法在培育低黃色素含量小麥中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明所提供的蛋白及其編碼基因，與小麥的黃色素含量性狀有著緊密的相關(guān)性。本發(fā)明還提供了基于該小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白基因等位變異的特異性功能標記，利用該標記可以對小麥黃色素含量相關(guān)基因的變異進行分子標記輔助選擇，從而培育低黃色素含量的優(yōu)良小麥品種。應(yīng)用本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因以及功能標記輔助選擇，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本。本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、周期短的優(yōu)點，適于推廣應(yīng)用，對快速改良小麥面制品顏色具有重要的理論意義和經(jīng)濟價值。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。



圖1為普通小麥的4個黃色素含量性狀相關(guān)蛋白編碼基因等位基因的序列比對。
圖2為15個樣本的第一次分型鑒定結(jié)果。
圖3為15個樣本的第二次分型鑒定結(jié)果。

具體實施例方式 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、與黃色素含量性狀相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得 本實施例中所用到的引物序列見表2。
表2用于克隆Psy-B1位點等位基因的引物序列

1、Psy-Bla蛋白及其編碼基因的獲得 采取電子克隆結(jié)合常規(guī)PCR擴增的方法獲取到了Psy-Bla蛋白編碼基因，具體如下 1)以玉米PSY基因(GenBank登錄號U32636)的cDNA序列作為電子探針篩選GenBank小麥EST數(shù)據(jù)庫，并將得到的序列進行電子拼接組建跨疊群(contig)。
2)根據(jù)EST序列CD862515、CD875290和CA598664組建的跨疊群設(shè)計引物P7B1，通過在中國春缺體-四體系中進行染色體定位發(fā)現(xiàn)其位于7B染色體上。根據(jù)該段測得的序列以及Psy-Ala的序列(GenBank登錄號EF600063)設(shè)計引物P7B2和P7B3，以中麥16號的基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得基因全長序列。
3)將獲得的Psy-Bla全長序列與Psy-Ala基因序列進行比對，確定其內(nèi)含子區(qū)及起始密碼子和終止密碼子，并將外顯子進行拼接，翻譯獲得Psy-Bla蛋白序列。
Psy-Bla蛋白的序列如序列表的序列1所示，Psy-Bla蛋白的編碼基因序列如序列表的序列2所示。
2、Psy-Blb蛋白及其編碼基因的獲得 方法同步驟1中Psy-Bla蛋白的獲得。以高優(yōu)503的基因組DNA為模板進行PCR擴增。
Psy-Blb蛋白的序列如序列表的序列3所示，Psy-Blb蛋白的編碼基因序列如序列表的序列4所示。
3、Psy-Blc蛋白及其編碼基因的獲得 應(yīng)用引物P7B1擴增晉麥61的基因組DNA，分析PCR產(chǎn)物的序列，并根據(jù)該序列，同時參考Psy-Bla的序列，設(shè)計引物P7B4，PCR擴增晉麥61的基因組DNA，獲得了Psy-Blc基因的中游序列。但該基因的上游序列以此方法未能獲得。將Psy-Blc的基因序列與Psy-Bla的基因序列進行比對，確定其內(nèi)含子區(qū)與終止密碼子。拼接晉麥61的cDNA序列，進行翻譯獲得Psy-Blc蛋白序列。
Psy-Blc蛋白的序列如序列表的序列5所示，Psy-Blc蛋白的編碼基因序列如序列表的序列6所示。
4、Psy-Bld蛋白及其編碼基因的獲得 應(yīng)用引物P7B1擴增寧98084小麥的基因組DNA，分析PCR產(chǎn)物的序列，并根據(jù)該序列，同時參考Psy-Bla的序列，設(shè)計引物P7B5和P7B6，PCR擴增寧98084小麥的基因組DNA，獲得了Psy-Bld基因的全長序列。將Psy-Bld的基因序列與Psy-Bla的基因序列進行比對，確定其內(nèi)含子區(qū)與終止密碼子。拼接寧98084小麥的cDNA序列，進行翻譯獲得Psy-Bld蛋白序列。
Psy-Bld蛋白的序列如序列表的序列7所示，Psy-Bld蛋白的編碼基因序列如序列表的序列8所示。
來源于普通小麥的4個黃色素含量性狀相關(guān)蛋白(Psy-Bla、Psy-Blb、Psy-Blc、Psy-Bld)編碼基因等位基因的序列比對如圖1所示。
實施例2、小麥黃色素含量與基因型的相關(guān)性分析 一、功能標記引物的設(shè)計 根據(jù)序列表中的序列2、序列4、序列6和序列8設(shè)計一對引物P1和P2(序列表中的序列9和序列表中的序列10)如下 P1(上游引物)5’-GCCACAACTTGAATGTGAAAC-3’， P2(下游引物)5’-ACTTCTTCCATTTGAACCCC-3’。
用引物P1和P2，可以擴增序列表中序列2所示核苷酸中151bp的核苷酸序列；可以擴增序列表中序列4所示核苷酸中156bp的核苷酸序列；不能擴增出序列表中序列6和序列8所示核苷酸中151bp或156bp的核苷酸序列。
根據(jù)序列表中的序列6和序列8設(shè)計一對引物P3和P4(序列表中的序列11和序列表中的序列12)如下 P3(上游引物)5’-GCCACCCACTGATTACCACTA-3’， P4(下游引物)5’-CCAAGGTGAGGGTCTTCAAC-3’。
用引物P3和P4，可以擴增出序列表中序列6所示核苷酸中428bp的核苷酸序列；不能擴增出序列表中序列8所示核苷酸中428bp的核苷酸序列。
二、小麥黃色素含量與所述基因的相關(guān)性分析 取217份來源于中國國家種質(zhì)資源庫的小麥品種，見表1。每份小麥品種取300粒種子，其中297粒檢測黃色素含量，3粒提取基因組DNA。
1、小麥籽粒黃色素含量的檢測 檢測黃色素含量的具體方法如下 將待測的籽粒用旋風(fēng)磨磨成面粉；稱取3.000g樣品放入約30ml具塞試管或試劑瓶內(nèi)，加入15.0ml水飽和正丁醇(100ml正丁醇加20ml蒸餾水，反復(fù)混勻，取飽和液部分)，蓋緊塞子，放在混旋器上混合，使樣品粉末充分濕潤；把樣品瓶放在往復(fù)振蕩機上振蕩1h，然后靜置10min；將上部液體倒入離心管內(nèi)，在4000rpm的離心機上離心約10min至液體清亮為止；每一批次均以中優(yōu)9507面粉作為對照，取1.0cm比色皿，用分光光度計在436.5nm下測定離心后上清液的吸光度A；最終的黃色素含量(mg/kg)數(shù)值即為30.1A。
217份樣本黃色素含量的檢測結(jié)果見表3。
2、小麥基因型的測定 按常規(guī)方法提取小麥的基因組DNA，然后進行以下步驟 1)第一次基因分型 ①以小麥基因組DNA為模板，P1和P2為引物，進行PCR。
PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5μmol·L-1)各1μl，dNTP(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補充反應(yīng)體系至20μl。
PCR反應(yīng)程序為首先95℃、5min；然后95℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共35個循環(huán)；最后72℃、5min。
擴增產(chǎn)物于4℃保存。
②6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 取20μl擴增產(chǎn)物，加入4μl變性載樣指示劑(98％去離子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚藍和0.1％二甲苯青)，94℃變性5min后，立即放入冰水混合物中冷卻5-10min。取6μl變性的擴增樣品進行電泳分離，銀染顯色。
圖2為15個樣本的第一次分型鑒定結(jié)果。泳道M表示分子量標準(Marker)；泳道01至15分別為以下品種的小麥京冬8、冀麥38、寧98084、云麥42、皖麥38、煙農(nóng)18、陜150、寧99415-8、山農(nóng)1355、豫麥49號、鄭州992、河農(nóng)2552、冀3475、晉麥50、中優(yōu)9701。
2)第二次基因分型 ①將步驟1)中沒有得到擴增條帶的樣本，以小麥基因組DNA為模板，P3和P4為引物，重新進行PCR。
PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5μmol·L-1)各1μl，dNTP(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補充反應(yīng)體系至20μl。
PCR反應(yīng)程序為首先95℃、5min；然后95℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共35個循環(huán)；最后72℃、5min。
擴增產(chǎn)物于4℃保存。
②將PCR擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
圖3為15個樣本的第二次分型鑒定結(jié)果。泳道M表示分子量標準(Marker)；泳道01至15分別為以下品種的小麥京冬8、冀麥38、寧98084、云麥42、皖麥38、煙農(nóng)18、陜150、寧99415-8、山農(nóng)1355、豫麥49號、鄭州992、河農(nóng)2552、冀3475、晉麥50、中優(yōu)9701。
217個份樣本的基因型測定結(jié)果見表3。
表3小麥的基因型和黃色素含量檢測結(jié)果 注“-”表示無擴增產(chǎn)物。
3、基因分型檢測結(jié)果驗證 對217個樣本的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明，151bp PCR產(chǎn)物是序列2(Psy-Bla基因)的自5′末端第2566-2716位脫氧核糖核苷酸，156bp PCR產(chǎn)物是序列4(Psy-Blb基因)的自5′末端第2566-2721位脫氧核糖核苷酸，428bp PCR產(chǎn)物是序列6(Psy-Blc基因)的自5′末端第2157-2584位脫氧核糖核苷酸，與電泳分型鑒定的結(jié)果一致。
217個樣本中，86個樣本基因型為Psy-Bla；95個樣本基因型為Psy-Blb；36個樣本基因型為Psy-Blc；2個樣本基因型為Psy-Bld。對不同基因型小麥的黃色素含量進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)有顯著差異，見表4。
表4小麥等位變異與籽粒黃色素含量關(guān)系的統(tǒng)計分析結(jié)果
通過小麥黃色素含量與所述基因的相關(guān)性分析，得出以下結(jié)論 以小麥基因組DNA為模板，先用引物P1和P2進行擴增，如果擴增出151bp的條帶，說明基因型為Psy-Bla，具有較低黃色素含量；如果擴增出156bp的條帶，說明基因型為Psy-Blb，具有低黃色素含量；對沒有擴增條帶的樣本，用引物P3和P4進行擴增，如果擴增出428bp的條帶，說明基因型為Psy-Blc，具有高的黃色素含量。
序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
<120>一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
<130>CGGNARY81358
<160>12
<210>1
<211>421
<212>PRT
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>1
Met Ala Thr Thr Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ala Ala Arg Asp Gly Val Gln Cys Ser Arg Met Leu Pro Arg
20 25 30
Arg Arg Gln Gln Arg Pro Arg Trp Val Leu Cys Ser Leu Lys Tyr Gly
35 40 45
Cys Leu Gly Val Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Ala
50 55 60
Ser Pro Val Tyr Ser Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Glu Ala Ala
65 70 75 80
Val Ala Val Val Ser Ser Glu Gln Lys Val Tyr Asp Val Val Leu Lys
85 90 95
Gln Ala Ala Leu Leu Lys Arg Gln Leu Arg Pro Gln Gln Ala Ala Pro
100 105 110
Pro Ala Val Ala Arg Glu Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Lys
115 120125
Ala Tyr Ala Arg Cys Gly Glu Ile Cys Glu Glu Tyr Ala Lys Thr Phe
130 135 140
Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro
165 170 175
Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg
180 185 190
Leu Glu Asp Leu Phe Ala Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala
195 200 205
Leu Ser Asp Thr Ile Thr Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys
210 215 220
Asp Met Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys
225 230 235 240
Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val
245 250 255
Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala
260 265 270
Thr Ala Glu Ser Val Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn
275 280 285
Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Ile Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp
305 310 315 320
Glu Asp Ile Val Lys Gly Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met
325 330 335
Lys Arg Gln Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg
340 345 350
Gly Val Thr Glu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr
370 375 380
Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu
385 390 395 400
Ala Leu Pro Val Ala Tyr Gly Lys Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Leu
405 410 415
Arg Asn Asn Gln Thr
420
<210>2
<211>2935
<212>DNA
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>2
atggccacca ccgtcacgct gctgctcggg gcagcctcgt cccccggtga tggcgccgcg 60
cgggacggcg tccagtgctc ccgcatgttg cctaggagga ggcagcagag gccgcggtgg 120
gtgctctgct cgctcaagta cggctgcctc ggcgtcggcg agccggggga ggcgggaacc 180
cggagcgcgg cgtcgccggt ctactccagc ctcaccgtca gccccggcgg cgaggcggcc 240
gtcgccgtcg tctcctcgga gcagaaggtg tacgacgtgg tgctgaagca ggcggcattg 300
ctcaagcgcc agctccggcc acagcaggcg gcgccgcccg ccgtagccag ggagctggac 360
gcgccgcgcg gtgggctcgg gaaggcctac gcccgctgcg gcgagatctg cgaggagtac 420
gccaagacct tctacctcgg tacggtgctc cttcatgcat gcttactctg tttttcttga 480
gccatggtgg cagtctgccg catgccaagc ccatgttctg atgatcatgg agctcacccg 540
ttcatgtctg gtcgtgcatg gcagggacct tgctgatgac agaggagcgg cgacgcgcca 600
tatgggccat ctacggtaat caatctgaaa cctcaccatg cctggcttgg accctccatt 660
gttgctcccc tgctgtagta tcagtatgtg tcacacagtg tcagttagtt tcagtaatgt 720
gactgaaaat ggagctagtt tcattttcac ttcagatcgt cagaaagggc atgcccacat 780
tttgcatcag ttaaattgct acatattgta tttaacagca acttgcaaga atctttgaca 840
ctccccaaga ttattggcca cttttgtttt cagttaatgg cgtaaactag ttctggatgc 900
gaataatggc aaatagaaac atcgtggaac ttgcatgcta tacatttata tagatactcc 960
tatatagtat agtcagtgaa gaataaaggc ctcacataac acttttttta tatgccatta1020
tgtgtggaag aatcaaatta ggctttttgt tggctaaatg gcctcaatag gatcaaagta1080
catgagaaaa gtttgcaaga acatattcct cactacttaa ggaatgtgaa cctgaggttc1140
tgtcagttct aaatgagata tactctaggc atcgaacact ttcagaatct gatgtatagc1200
atcatttgtg cagtgtggtg caggaggaca gacgagctgg tggacggtcc caacgcgtcg1260
cacatcacgc cgcaggcgct ggaccggtgg gagaggaggc tggaggacct cttcgccggg1320
cgcccctacg acatgctcga cgccgcgctc tccgacacca tcaccaagtt ccccatagat1380
attcaggtac cagctcgccg gtgcataatt gttcagtcca cattgtatga ttctggtaga1440
agaacagagt ggtggtggat attccctgtc agcatcagat tctccctaga cctcacaatc1500
tcagtgcaag atgaccggaa agtccgtgat tggtcaaaat tgtttcgttt gtcggccttt1560
tattagtctc tgatgctgtt attgagttgt atgaactttt cacacattgt agtgggggct1620
tatccagttg actagacgta tagtgggaat catctggtca aagatatgtt taatcaaagt1680
ggggaaatta tagggagaat tttcaataag aattagtcct gaacatgcca agaacaagca1740
ggaacttgga gatgatgtag aaggagaaat gaaaacatga attattgggc tgtattcctg1800
gtcactgttt tttaccggag attgtgcttt tcggtctaat ttctcctaca aaccgcgtta1860
ctgtgtattt cttttcttaa taaaatcggc agagctactg ccttgcattg tcaataagaa1920
aaagttcatg ggttgttctt agcactacta cttatgaact atattattga tattctaaaa1980
tgaccaatta cttttacata tgccagccct tcaaggacat gatcgacggg atgcggacgg2040
acctcaagaa ggcaagatac aagaacttcg atgagctcta catgtactgc tactacgtcg2100
caggcacggt ggggctgatg agcgtcccgg tgatgggcat tgcgcccgag tccaaggcga2160
cggctgagag cgtctacggc gccgctctgg ctctcgggtt ggcgaaccag ctcaccaaca 2220
tactcaggga tgtcggagaa gagtaagcca ctcactcact accaatacag tgcaatgatt 2280
tttccttgta caatcatgat atggacattt tgagatagca ctatcctgaa tgttctggtg 2340
tttcgactaa ttttccagtg caagaagagg aaggatatat ttgccgcaag acgagctcgc 2400
ggaggcaggg ctctccgatg aagacatcgt caaaggagtc gtcactgaca agtggaggaa 2460
attcatgaag aggcagatca agagggcaag gatgttcttc gaggaggcag agcgaggggt 2520
gaccgagctc aggaaggaga gccggtggcc ggtaagtgcc ctaaagccac aacttgaatg 2580
tgaaacaaaa ctacatatag atctcatcat tgttaattat cagtagcaaa aatgaagcta 2640
tgtctagttt ataccccccc ccctcccact tggtataatc attgaaaaaa aatttagggg 2700
ttcaaatgga agaagtatca gtagagtgat aatatggttt tcaatttcat tgcaattgca 2760
ggtttgggcc tctctgttgt tgtaccggca gatcctcgat gagatcgaag cgaacgacta 2820
caacaacttc accaagaggg cctatgttgg aaaggcgaag aaagtgttgg cgctccctgt 2880
cgcatacggg aaatcgctgc tcttaccgtc ttcactgaga aataaccaga cctag 2935
<210>3
<211>421
<212>PRT
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>3
Met Ala Thr Thr Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ala Ala Arg Asp Gly Val Gln Cys Ser Arg Met Leu Pro Arg
20 25 30
Arg Arg Gln Gln Arg Pro Arg Trp Val Leu Cys Ser Leu Lys Tyr Gly
35 40 45
Cys Leu Gly Val Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Ala
50 55 60
Ser Pro Val Tyr Ser Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Glu Ala Ala
65 70 75 80
Val Ala Val Val Ser Ser Glu Gln Lys Val Tyr Asp Val Val Leu Lys
85 90 95
Gln Ala Ala Leu Leu Lys Arg Gln Leu Arg Pro Gln Gln Ala Ala Pro
100 105 110
Pro Ala Val Ala Arg Glu Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Lys
115 120 125
Ala Tyr Ala Arg Cys Gly Glu Ile Cys Glu Glu Tyr Ala Lys Thr Phe
130 135 140
Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp
145150 155 160
Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro
165 170 175
Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg
180 185 190
Leu Glu Asp Leu Phe Ala Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala
195 200 205
Leu Ser Asp Thr Ile Thr Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys
210 215 220
Asp Met Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys
225 230 235 240
Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val
245 250 255
Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala
260 265 270
Thr Ala Glu Ser Val Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn
275 280 285
Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Ile Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp
305 310 315 320
Glu Asp Ile Val Lys Gly Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met
325 330 335
Lys Arg Gln Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg
340 345 350
Gly Val Thr Glu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr
370 375 380
Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu
385 390 395 400
Ala Leu Pro Val Ala Tyr Gly Lys Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Leu
405 410 415
Arg Asn Asn Gln Thr
420
<210>4
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<212>DNA
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>4
atggccacca ccgtcacgct gctgctcggg gcagcctcgt cccccggtga tggcgccgcg 60
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gcgccgcgcg gtgggctcgg gaaggcctac gcccgctgcg gcgagatctg cgaggagtac 420
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ttcatgtctg gtcgtgcatg gcagggacct tgctgatgac agaggagcgg cgacgcgcca 600
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gttgctcccc tgctgtagta tcagtatgtg tcacacagtg tcagttagtt tcagtaatgt 720
gactgaaaat ggagctagtt tcattttcac ttcagatcgt cagaaagggc atgcccacat 780
tttgcatcag ttaaattgct acatattgta tttaacagca acttgcaaga atctttgaca 840
ctccccaaga ttattggcca cttttgtttt cagttaatgg cgtaaactag ttctggatgc 900
gaataatggc aaatagaaac atcgtggaac ttgcatgcta tacatttata tagatactcc 960
tatatagtat agtcagtgaa gaataaaggc ctcacataac acttttttta tatgccatta1020
tgtgtggaag aatcaaatta ggctttttgt tggctaaatg gcctcaatag gatcaaagta1080
catgagaaaa gtttgcaaga acatattcct cactacttaa ggaatgtgaa cctgaggttc1140
tgtcagttct aaatgagata tactctaggc atcgaacact ttcagaatct gatgtatagc1200
atcatttgtg cagtgtggtg caggaggaca gacgagctgg tggacggtcc caacgcgtcg1260
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cgcccctacg acatgctcga cgccgcgctc tccgacacca tcaccaagtt ccccatagat1380
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tgaccaatta cttttacata tgccagccct tcaaggacat gatcgacggg atgcggacgg 2040
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caggcacggt ggggctgatg agcgtcccgg tgatgggcat tgcgcccgag tccaaggcga 2160
cggctgagag cgtctacggc gccgctctgg ctctcgggtt ggcgaaccag ctcaccaaca 2220
tactcaggga tgtcggagaa gagtaagcca ctcactcact accaatacag tgcaatgatt 2280
tttccttgta caatcatgat atggacattt tgagatagca ctatcctgaa tgttctggtg 2340
tttcgactaa ttttccagtg caagaagagg aaggatatat ttgccgcaag acgagctcgc 2400
ggaggcaggg ctctccgatg aagacatcgt caaaggagtc gtcactgaca agtggaggaa 2460
attcatgaag aggcagatca agagggcaag gatgttcttc gaggaggcag agcgaggggt 2520
gaccgagctc aggaaggaga gccggtggcc ggtaagtgcc ctaaagccac aacttgaatg 2580
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<212>PRT
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>5
Gly Thr Leu Leu Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile
1 5 10 15
Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala
20 25 30
Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg Leu Glu
35 40 45
Asp Leu Phe Ala Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser
50 55 60
Asp Thr Ile Thr Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys Asp Met
65 70 75 80
Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys Asn Phe
85 90 95
Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu
100 105 110
Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Thr Ala
115 120 125
Glu Ser Val Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn Gln Leu
130 135 140
Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Ile
145 150 155 160
Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp
165 170 175
Ile Phe Arg Gly Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met Lys Arg
180 185 190
Gln Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg Gly Val
195 200 205
Thr Glu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu
210 215 220
Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn
225 230 235 240
Phe Thr Arg Arg Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu Ala Leu
245 250 255
Pro Val Ala Tyr Gly Arg Ser Leu Leu Leu Pro Tyr Ser Leu Arg Asn
260 265 270
Asn Gln Thr
275
<210>6
<211>2844
<212>DNA
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>6
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<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>7
Met Ala Thr Thr Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ala Gly Leu Ala Ala Gly Asp Gly Thr Ala Arg Asp Gly Val
20 25 30
Gln Cys Ser Arg Leu Leu Pro Arg Arg Arg Gln Gln Arg Pro Arg Trp
35 40 45
Val Leu Cys Ser Leu Lys Tyr Gly Cys Leu Gly Val Gly Glu Pro Gly
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Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Ala Ser Pro Val Tyr Ser Ser Leu Thr
65 70 75 80
Val Ser Pro Gly Gly Asp Ala Ala Val Ala Val Val Ser Ser Glu Gln
85 90 95
Lys Val Tyr Asp Thr Val Val Lys Gln Ala Ala Leu Leu Lys Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Pro Gln Gln Gln Gln Ala Ala Pro Pro Ala Val Ala Arg Glu
115 120 125
Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Glu Ala Tyr Ala Arg Cys Gly
130 135 140
Glu Ile Cys Glu Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Leu Leu
145 150 155 160
Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys
165 170 175
Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr
180 185 190
Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg Leu Glu Asp Leu Phe Ala
195 200 205
Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Ile Thr
210 215 220
Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys Asp Met Ile Asp Gly Met
225 230 235 240
Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys Asn Phe Asp Glu Leu Tyr
245 250 255
Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro
260 265 270
Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Thr Ala Glu Ser Val Tyr
275 280 285
Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu
290 295 300
Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Pro Gln
305 310 315 320
Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ile Phe Lys Gly
325 330 335
Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met Lys Arg Gln Ile Lys Arg
340 345 350
Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Leu Arg
355 360 365
Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Gln
370 375 380
Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg
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Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu Ala Leu Pro Val Ala Tyr
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<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>8
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atgaacatag caagaacaaa aaagaacttg gcaacgatct agaggtataa caggaatcag1800
gggaagtcta aggctctgtt tggtttatcg tttccatttc aaatacccct gtataactta1860
cagacctccg cccgtcgttt tgctttccgg ccggaaatag ctcttggtca gtaagttaca1920
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tcatacctga aatagcatta tgagaatgtt cttggttctg gttagtacta ttacttgaaa2040
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ttgtctagat acggatgtat ttaacactaa aacataactg gatacatccg tatttagaca2280
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aaaatttttt tatataaatt tggtcaaagt ttgtaaagtt tgactttcaa aaaaaattat2400
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agaacttcga cgagctctac atgtactgct actacgttgc aggtacggtg gggctgatga2580
gcgtcccggt gatgggcatt gcgcccgagt ccaaggcgac ggccgagagc gtctacggcg2640
ccgctctggc tctcgggctc gcgaaccagc tcaccaacat actcagggat gttggagaag2700
agtaagccac ccactgatta ccactaaaat gcaacggttt tcccttcctc taaagaacag2760
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aagaccagca aaaaagaaac ctatgtgtat ttcaaggggg gccgctgccc ctcaccttgg3180
tataatcatt gaagaataaa tattaggggc ttaaatagaa gaaagtatca cttgagtgat3240
aatatggttt tgcattgcaa ttgcaggttt gggcctctct gttgctatac cggcagatcc3300
tcgacgagat cgaagcgaac gactacaaca acttcaccaa gagggcctat gttgggaagg3360
cgaagaaggt gctggcgctc cctgtcgcgt acgggagatc gctgctctta ccgtattcac3420
tgagaaataa ccagacctag3440
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gccacaactt gaatgtgaaa c21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acttcttcca tttgaacccc 20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gccacccact gattaccact a21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccaaggtgag ggtcttcaac 20
權(quán)利要求
1、一種檢測小麥黃色素含量性狀的標記引物A，是由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對引物。
2、一種檢測小麥黃色素含量性狀的標記引物B，是由序列表中序列11的核苷酸序列和序列12的核苷酸序列組成的一對引物。
3、一種檢測小麥黃色素含量性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的標記引物A進行PCR擴增，檢測PCR擴增產(chǎn)物中是否有156bp的條帶或151bp的條帶；如PCR擴增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，再以所述待測小麥基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的標記引物B進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物中是否有428bp的條帶。
4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中，如所述標記引物A的PCR擴增產(chǎn)物中有156bp的條帶或151bp的條帶，所述待測小麥為候選低黃色素含量小麥；如所述標記引物Λ的PCR擴增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，而所述標記引物B的PCR擴增產(chǎn)物中有428bp的條帶，所述待測小麥為候選高黃色素含量小麥。
5、如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于用所述標記引物A進行PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物通過6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測；用所述標記引物B進行PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
6、如權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為普通小麥。
7、一種蛋白，是如下1)或2)或3)或4)或5)的蛋白質(zhì)
(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(5)將序列1、3、5或7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的由序列1、3、5或7衍生的蛋白質(zhì)。
8、權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。
9、如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子
1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
3)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子；
4)其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；
5)在嚴格條件下與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
6)與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
10、權(quán)利要求3-5中任一所述方法在培育低黃色素含量小麥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白是由序列表中序列1或3或5或7以及它們經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了該蛋白的編碼基因和基于小麥基因等位變異的特異性功能標記。利用本發(fā)明的標記，通過兩次基因分型，可判斷小麥攜帶的黃色素含量相關(guān)基因。應(yīng)用本發(fā)明，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本。本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、周期短的優(yōu)點，適于推廣應(yīng)用，對快速改良小麥面制品顏色具有重要的理論意義和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12Q1/68GK101289695SQ20081011325
公開日2008年10月22日 申請日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者夏先春, 何中虎, 何心堯 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所