小麥籽粒與面粉低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥育種和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥面粉與籽粒低蛋 白含量相關(guān)的分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)俏覈?guó)最重要的糧食作物之一，長(zhǎng)江中下游麥區(qū)具有不利于小麥籽粒蛋白質(zhì) 形成和積累的生態(tài)條件，適宜發(fā)展弱筋小麥，已經(jīng)成為我國(guó)弱筋小麥生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)帶。低 蛋白質(zhì)含量是弱筋小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)，國(guó)家優(yōu)質(zhì)小麥標(biāo)準(zhǔn)GB/T17893-1999規(guī)定優(yōu)質(zhì)弱 筋小麥蛋白質(zhì)含量應(yīng)在11. 5%以下；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB8608-88規(guī)定低筋小麥粉蛋白質(zhì)含量應(yīng)在 10%以下。
[0003] 籽粒蛋白質(zhì)含量與面粉蛋白質(zhì)含量必須在收獲后才能進(jìn)行品質(zhì)測(cè)試，且易受環(huán)境 條件影響，因此選擇效率較低，分子標(biāo)記輔助選擇，可在DNA水平針對(duì)低蛋白質(zhì)含量基因?qū)?育種材料進(jìn)行選擇，因而可以在苗期進(jìn)行選擇，并且可以克服蛋白質(zhì)含量鑒定的不穩(wěn)定性， 降低表型評(píng)價(jià)的成本，提高弱筋小麥品質(zhì)育種效率。
[0004] SSR標(biāo)記作為以PCR為基礎(chǔ)的第二代分子標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是數(shù)量極為豐富， 且分布于整個(gè)基因組；二是多態(tài)性高，等位位點(diǎn)多，信息含量豐富；三是以孟德爾方式呈共 顯性遺傳，易區(qū)分純合子與雜合子；四是操作簡(jiǎn)單，可直接用PCR進(jìn)行分析，所需DNA量少。
[0005] 關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基 因關(guān)系的分析方法。近年來，該技術(shù)已在小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等遺傳學(xué)研宄上廣泛采用。
[0006] 寧麥9號(hào)是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的優(yōu)質(zhì)弱筋專用小麥品種，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和 廣泛的適應(yīng)性及抗小麥黃花葉病、赤霉病等特點(diǎn)，近年來已成為長(zhǎng)江中下游麥區(qū)小麥育種 的重要親本，以其為親本已經(jīng)育成了 15個(gè)小麥新品種。其弱筋品質(zhì)穩(wěn)定，在餅干和蛋糕加 工品質(zhì)上可媲美美國(guó)、澳大利亞進(jìn)口的優(yōu)質(zhì)軟質(zhì)小麥。發(fā)掘與寧麥9號(hào)低蛋白含量相關(guān)的 分子標(biāo)記，對(duì)弱筋小麥育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、使 用方便的一種小麥面粉與籽粒低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0008] 為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明的一種小麥籽粒與面粉低蛋白含量相關(guān) 的分子標(biāo)記，它的分子標(biāo)記分為籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記與面粉低蛋白含量分子標(biāo)記，所 述的籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC ; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT ; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
[0009] 本發(fā)明以寧麥9號(hào)及其衍生品種（系）為材料，通過關(guān)聯(lián)分析的方法，獲得小麥籽 粒與寧麥9號(hào)低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記通過關(guān)聯(lián)分析的方法，獲得小麥面粉與 寧麥9號(hào)低面粉蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記你。通過該分子標(biāo)記輔助育種，可以克服常 規(guī)品質(zhì)育種周期長(zhǎng)、苗期無法鑒定的不足。常規(guī)品質(zhì)育種只能在雜交4代后才能對(duì)蛋白質(zhì) 含量進(jìn)行檢測(cè)，利用分子標(biāo)記輔助選擇，在低世代的苗期即可對(duì)低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo) 記進(jìn)行選擇，有利于減少育種家對(duì)該性狀選擇的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率，是 一種高效、快速的育種新技術(shù)。
【附圖說明】
[0010] 圖1為【具體實(shí)施方式】中籽粒低蛋白分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果示意圖； 圖2為【具體實(shí)施方式】中面粉低蛋白分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0012] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施 方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用以解釋本 發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0013] 本【具體實(shí)施方式】米用如下技術(shù)方案：它的分子標(biāo)記分為籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記 與面粉低蛋白含量分子標(biāo)記，所述的籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC ; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT ; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
[0014] 以寧麥9號(hào)及其117個(gè)衍生品種（系）為材料，其中，衍生一代39份，衍生二代 78份。
[0015] 依據(jù)Somers等的整合遺傳連鎖圖篩選到185對(duì)多態(tài)性引物，每條染色體5-14對(duì)， 平均8. 8對(duì)。
[0016] PCR 反應(yīng)體系為 10 μ L，包含 IOXbuffer 1 μ L、15 mmol I/1 MgCl2 0· 6 μ L、2 mmol I/1 dNTP 0.8yL、20 ng μL/1引物 I yL、0.1 yL 7? 禮、20 ng yL-1 模板 DNA3 以1、去離子水3.5以1^。？0?擴(kuò)增程序?yàn)?4°0預(yù)變性5 11^11;然后94°0變性45 8,60°〇 退火45 s，72°C延伸90 s，36個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 電泳檢測(cè)。在相同位點(diǎn)上，有帶記為1，無帶記為0,缺失記為9。
[0017] 2009、2010連續(xù)兩年將寧麥9號(hào)及其117個(gè)衍生品種（系）種植于江蘇省農(nóng)科院 試驗(yàn)基地，3行小區(qū)田間種植。2010和2011年分別收獲種子晾干，利用Perton DA7200近 紅外品質(zhì)測(cè)定儀按照GB/T 24899-2010方法測(cè)定籽粒蛋白含量；用Buhler 202磨粉機(jī)將籽 粒磨成面粉后，按照GB 5511-85方法測(cè)定面粉蛋白含量。
[0018] 利用Excel 2007對(duì)基因型及表型數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析；用TASSEL 3. 0軟件的 MLM(mixed linear model)程序?qū)赡甑拿娣鄣鞍踪|(zhì)含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并估算各標(biāo)記效 應(yīng)，P〈0.0 l時(shí)認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)連續(xù)兩年關(guān)聯(lián)到的標(biāo)記位點(diǎn)。
[0019] 利用Excel 2007對(duì)基因型及表型數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析；用TASSEL 3. 0軟件的 MLM(mixed linear model)程序?qū)赡晔斋@籽粒及面粉的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并估 算各標(biāo)記效應(yīng)，P〈〇. 01時(shí)認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)連續(xù)兩年關(guān)聯(lián)到的標(biāo)記位點(diǎn)。
[0020] 利用分子標(biāo)記對(duì)小麥品種寧麥9號(hào)的衍生品系進(jìn)行籽粒與面粉蛋白質(zhì)含量預(yù)測(cè)。
[0021] 小麥籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記過程如下： 以寧麥9號(hào)及其8個(gè)衍生品系為材料，分別采用CTAB法從這些植株葉片中分離DNA，利 用上下游引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，判斷衍生品 系DNA的PCR產(chǎn)物是否與寧麥9號(hào)擴(kuò)增條帶一致。
[0022] 擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，1-8為寧麥9號(hào)衍生品系，N為寧麥9號(hào)，M為20 bp marker。 圖中出現(xiàn)2種帶型，6、7、8三個(gè)品系DNA的PCR產(chǎn)物與寧麥9號(hào)擴(kuò)增條帶一致，認(rèn)為其為 低籽粒蛋白含量品系；1-5帶型不同，判斷其為高籽粒蛋白含量品系。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/ T17893-1999定義小麥籽粒蛋白質(zhì)含量小于11. 5為"低"，大于或等于11. 5為"高"。
[0023] 基于此判定方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)小麥品系的籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，小麥?zhǔn)斋@后 按照GB/T 24899-2010方法對(duì)籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行實(shí)測(cè)并與預(yù)測(cè)結(jié)果比對(duì)，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí) 測(cè)結(jié)果吻合，結(jié)果參見下表。
[0024] 小麥面粉低蛋白含量分子標(biāo)記過程如下： 以寧麥9號(hào)及其10個(gè)衍生品系為材料，分別采用CTAB法從這些植株葉片中分離DNA， 利用上下游引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，判斷衍生 品系DNA的PCR產(chǎn)物是否與寧麥9號(hào)擴(kuò)增條帶一致。
[0025] 擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，1-10為寧麥9號(hào)衍生品系，N為寧麥9號(hào)，M為20 bp marker。 圖中出現(xiàn)3種帶型，7、8、9、10四個(gè)品系DNA的PCR產(chǎn)物與寧麥9號(hào)擴(kuò)增條帶一致，認(rèn)為 其為低面粉蛋白含量品系；1-6帶型不同，判斷其為高面粉蛋白含量品系。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB8608-88定義小麥面粉蛋白質(zhì)含量小于或等于10%為"低"，大于10%為"高"。
[0026] 基于此判定方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)小麥品系的面粉蛋白質(zhì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，小麥?zhǔn)斋@后 按照GB 5511-85方法對(duì)面粉蛋白質(zhì)含量進(jìn)行實(shí)測(cè)并與預(yù)測(cè)結(jié)果比對(duì)，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié) 果吻合，結(jié)果參見下表。
[0027] 以上所述，僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā) 明的技術(shù)方案所做的其它修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍， 均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.小麥籽粒與面粉低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于：它的分子標(biāo)記分為籽粒 低蛋白含量分子標(biāo)記與面粉低蛋白含量分子標(biāo)記， 所述的籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：CTGCTCTAAGAITCATGCAACC; 下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG; 所述的面粉低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為： 上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT; 下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT。
【專利摘要】本發(fā)明公開了小麥籽粒與面粉低蛋白含量相關(guān)的分子標(biāo)記，它涉及小麥育種和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域；它的分子標(biāo)記分為籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記與面粉低蛋白含量分子標(biāo)記，所述的籽粒低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為：上游引物序列：CTGCTCTAAGATTCATGCAACC；下游引物序列：GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG；所述的面粉低蛋白含量分子標(biāo)記引物序列為：上游引物序列：AGCTGGGTTAATAACAGAGGAT；下游引物序列：CACATAACTGTCCACTCCTTT；本發(fā)明有利于減少育種家對(duì)該性狀選擇的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率，是一種高效、快速的育種新技術(shù)。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104911266
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510315042
【發(fā)明人】姜朋, 馬鴻翔, 張平平, 張旭, 陳小霖
【申請(qǐng)人】姜朋
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月10日