專利名稱：：類球紅細(xì)菌突變株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種類球紅細(xì)菌突變株。本發(fā)明還涉及所述突變株在生產(chǎn)輔酶Q10方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：類球紅細(xì)菌1.1737可用于生產(chǎn)輔酶QIO。但在從該菌的發(fā)酵液提取輔酶Q10時(shí)，需要用層析方法吸附色素等水溶性物質(zhì)。由于該菌的發(fā)酵液為深紅色，要耗費(fèi)較大量的層析填料用于脫色，層析所用的填料用量多少與生產(chǎn)輔酶QIO的成本相關(guān)。如果能夠得到色澤較淺的類球紅細(xì)菌發(fā)酵液，則可減少層析填料的用量，直接降低輔酶Q10的生產(chǎn)成本。此外，類球紅細(xì)菌1.1737生產(chǎn)輔酶Q10的產(chǎn)量不高，通常搖瓶發(fā)酵水平僅達(dá)到20-25ppm。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的菌株，在發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10時(shí)能夠減少脫色用的層析填料的用量，而降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的另一目的是提供的菌株能夠提高輔酶Q10產(chǎn)量。本發(fā)明將出發(fā)菌株——類球紅細(xì)菌1.1737隨航天育種衛(wèi)星回收艙在太空飛行15天，從回收樣品中篩選得到了一株類球紅細(xì)菌突變株，達(dá)到了本發(fā)明的目的。該突變株命名為類球紅細(xì)菌(i/zocfoZ^cto"^/zaera/cfes)spaceQG1.1737-168CGMCCNo.2359。該突變株的菌種已經(jīng)在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2359，保藏時(shí)間2008年1月25日。所述的類球紅細(xì)菌突變株的培養(yǎng)條件為(1)固體培養(yǎng)基(％):葡萄糖0.2，牛肉膏0.3，魚蛋白胨l.O，酵母膏0.5，氯化鈉0.5，瓊脂粉1.5，pH7.0。(2)種子液(％):葡萄糖2.0，魚蛋白胨l.O，酵母粉1.0，，氯化鈉0.5，碳酸鈣0.5，pH7.2。500毫升三角瓶分裝，8層紗布封口滅菌。(3)發(fā)酵液(％):葡萄糖2.7，白砂糖2.0，玉米漿4.0，硫酸銨0.8，磷酸二氫鉀0.05，磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.025。500毫升三角瓶分裝，8層紗布封口滅菌。(4)固體培養(yǎng)條件菌種接種到帶有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或試管中，于28-37'C培養(yǎng)2-7天。(5)種子液培養(yǎng)條件用無(wú)菌接種環(huán)從培養(yǎng)皿或斜面中取菌體適量，接種到已滅菌的種子液中，28-37°C，220rpm搖床培養(yǎng)24-48小時(shí)。(6)發(fā)酵培養(yǎng)條件按照2-10%接種比例，將培養(yǎng)好種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-37°C，150-250rpm搖床培養(yǎng)3-8天。本發(fā)明的類球紅細(xì)菌(及/wcfo6ac^^//aerazVfespaceQG1.1737-168)具有如下性質(zhì)1.形態(tài)特征革蘭氏陰性球菌，顯微鏡下如圖l所示，多為單體存在。2.與出發(fā)菌株在專用固體培養(yǎng)基上的菌落特征比較本發(fā)明的類球紅細(xì)菌(J/20^^"e"http://zaerazWeyspaceQG1.1737-168)在類球紅細(xì)菌專用培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，圓形有凸起，表面濕潤(rùn)有光澤，邊緣整齊(見圖2)。而出發(fā)菌株——類球紅細(xì)菌(i/w^^"ew/^aeraW^1.1737)在類球紅細(xì)菌專用培養(yǎng)基上菌落呈深粉紅色(見圖3)。3.生理生化特征該菌株為微好氧菌，革蘭氏陰性，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，脲酶陰性，半乳酶陰性，不產(chǎn)生H2S，不能還原硝酸鹽。4.碳源利用能以蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等為碳源；不能利用鼠李糖、密二糖、精氨酸、色氨酸、賴氨酸木糖等為碳源。5.和出發(fā)菌株在麥芽糖利用方面的比較類球紅細(xì)菌spaceQG1.1737-168不能利用麥芽糖，而類球紅細(xì)菌1.1737能利用麥芽糖。6.在輔酶Q10生產(chǎn)中的比較出發(fā)菌株發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的發(fā)酵液為深紅色，而本發(fā)明的類球紅細(xì)菌spaceQG1.1737-168的發(fā)酵液為淺粉紅色。從該菌的發(fā)酵液提取輔酶Q10時(shí)，不僅比出發(fā)菌株降低層析填料成本的io%，而且輔酶Q10產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高30%。表1是本發(fā)明的spaceQG1.1737-168的微生物學(xué)特性的具體檢測(cè)內(nèi)容及結(jié)果:表l微生物學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注"+"表示陽(yáng)性，"-"表示陰性用本發(fā)明的突變菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10時(shí)，從發(fā)酵液中提取輔酶Q10的方法是1.樣品處理和提取向發(fā)酵液中加入酸，可選用鹽酸、硫酸、磷酸中的一種或幾種的混合物，調(diào)pH值到1-5，之后加入堿，可選用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水中的一種或幾種的混合物，使pH值回復(fù)到6-8，將菌液離心后取菌體，加入有機(jī)溶劑混合均勻，溶劑可選用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一種或幾種的混合物。20-5(TC搖床，100-200卬m條件下提取1-10小時(shí)。提取液離心后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。2.柱層析利用不銹鋼或玻璃的加壓柱、常壓柱或減壓柱作為層析柱，以硅膠或氧化鋁作固定相，上樣前用洗脫劑飽和柱子。洗脫劑為正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一種或幾種的混合物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得浸膏用正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一種或幾種的混合物溶解上樣。樣品過柱的同時(shí)，進(jìn)行薄層分析。當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果一致時(shí)，即可開始正樣收集，當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果不一致時(shí)，停止收集。3.樣品檢湖U按照中華人民共和國(guó)藥典中輔酶Q10的檢測(cè)方法進(jìn)行。圖1是spaceQG1.1737-168顯微鏡下照片；圖2是spaceQG1.1737-168菌落圖；圖3是1.1737菌落圖。菌種保藏信息名稱類球紅細(xì)菌(i/wfito6a"er5ptoera/(iM)spaceQG1.1737-168CGMCCNo.2359;保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏編號(hào)CGMCCNo.2359;保藏時(shí)間2008年1月25日。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1類球紅細(xì)菌突變株空間誘變育種1.航天育種衛(wèi)星搭載樣品準(zhǔn)備取生長(zhǎng)良好的類球紅細(xì)菌1.1737菌體培養(yǎng)物在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到搭載專用管中，擰緊管蓋，接口處用封口膜封口后裝入搭載用大管，送交搭載前于4'C保存。此搭載管放入"實(shí)踐八號(hào)"航天育種衛(wèi)星的實(shí)驗(yàn)裝置中，在太空中隨飛船飛行15天后回收。2.搭載的空間環(huán)境在本次育種衛(wèi)星飛行過程中，空間環(huán)境的相關(guān)數(shù)據(jù)為衛(wèi)星姿態(tài)控制為三軸穩(wěn)定姿態(tài)，其中衛(wèi)星的I象限指向地面，衛(wèi)星回收艙小頭為飛行方向。育種衛(wèi)星軌道為橢圓形傾斜軌道，衛(wèi)星運(yùn)行在近地點(diǎn)高度為180km遠(yuǎn)地點(diǎn)高度為460km的軌道上，軌道傾角為63°，近地點(diǎn)位置在北緯35。附近，衛(wèi)星飛行15天，共飛行236圈，236圈通過回收區(qū)中心。測(cè)試結(jié)果表明，本次飛行試驗(yàn)期間空間輻射劑量最大為5.893mGy，最小2.484mGy。平均日劑量在0.4010.169mGy之間。衛(wèi)星在軌期間種子測(cè)溫點(diǎn)的最大溫度為20.72°C，最低溫度為7.21°C。3.空間試驗(yàn)條件設(shè)置本研究中考慮的空間誘變因素為微重力和輻照兩個(gè)方面。因此設(shè)計(jì)空間單一輻照、單一微重力以及輻照和微重力復(fù)合因素等三個(gè)試驗(yàn)條件。在育種衛(wèi)星中安放lg離心機(jī)，以克服空間微重力的影響，營(yíng)造單一輻照條件；在衛(wèi)星中放置鉛罐，屏蔽掉空間絕大部分輻射劑量，營(yíng)造單一微重力條件；樣品直接放置在種子星鐵罐中，使其處于輻照和微重力復(fù)合條件下。實(shí)施例2類球紅細(xì)菌突變株的地面篩選、分離、提取1、地面篩選在無(wú)菌條件下取培養(yǎng)面積為0.5平方厘米的搭載回收樣品，用5毫升無(wú)菌水洗脫菌體到無(wú)菌離心管中，用移液器吸打均勻菌體洗脫液，取0.5毫升該菌液到4.5毫升無(wú)菌水中，吸打均勻，以此類推，做倍比稀釋。取104和10—5稀釋液涂布到平板培養(yǎng)基，每塊平板上涂100-150微升稀釋菌液，每個(gè)稀釋梯度涂多塊平板。待菌液被培養(yǎng)基吸收后于培養(yǎng)箱中28-37"C倒置培養(yǎng)2-7天。待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選顏色變淺或呈粉色，且菌落較大的用小量搖瓶發(fā)酵，進(jìn)行初篩。初篩菌株的發(fā)酵液于8000rpm條件下離心8分鐘，取沉淀60-8(TC烘干，研磨后按質(zhì)量體積比(1:100)加入無(wú)水乙醇，超聲處理l-2小時(shí)。處理液8000rpm條件下離心10分鐘，取上清液利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。挑選輔酶Q10含量比對(duì)照菌株高的淺顏色菌落進(jìn)行復(fù)篩。在平板培養(yǎng)物中共獲得328個(gè)單菌落，其中顏色淺，菌落大的73個(gè)。將此73個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。2.樣品處理和提取向各發(fā)酵液中分別加入6mol/L的鹽酸，調(diào)pH值到2-4，之后加入6mol/L氫氧化鈉溶液，使pH值回復(fù)到6-8，將菌液于8000rpm條件下離心IO分鐘，取菌體，按照固液比例(1:10)加入石油弊，打散菌體，使之與提取溶劑混合均勻。45。C搖床，180rpm條件下提取2小時(shí)。提取液8000rpm條件下離心IO分鐘，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得浸膏用石油醚和乙酸乙酯的混合物溶解上樣。3、用柱層析提取輔酶QIO，比較不同硅膠用量對(duì)分離產(chǎn)物產(chǎn)率的影響1)方法利用不銹鋼常壓柱作為層析柱，以60-100目的硅膠作固定相，柱子徑高比為1:15，樣品與硅膠的質(zhì)量之比為1:10，上樣前用洗脫劑飽和柱子。洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合物。樣品過柱的同時(shí)，進(jìn)行薄層分析。當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果一致時(shí)，即可開始正樣收集，當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果不一致時(shí)，停止收集。試驗(yàn)了出發(fā)菌株和突變株在上樣量基本相同條件下，層析柱中三種硅膠用量對(duì)分離產(chǎn)物產(chǎn)率的影響。2)結(jié)果見下表。表2層析用不同硅膠用量的輔酶Q10產(chǎn)率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>CK:對(duì)照物(出發(fā)菌株類球紅細(xì)菌1.1737)發(fā)酵樣品;Sl:spaceQG1.1737-168菌株發(fā)酵樣品。表中可看出，在硅膠用量減少10%的條件下，spaceQG1.1737-168的樣品仍然可以得到很好的分離效果，而對(duì)照菌株在相同硅膠用量條件下分離不完全。3)結(jié)論由于spaceQG1.1737-168和對(duì)照菌株的發(fā)酵液顏色不同，顏色淺，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所得的樣品顏色也淺較多，可節(jié)省層析填料，降低層析成本。4、檢測(cè)輔酶Q10含量1)方法按照中華人民共和國(guó)藥典中輔酶Q10的檢測(cè)方法進(jìn)行。將步驟2中得到的73個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，利用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中輔酶Q10含量，并與出發(fā)菌株發(fā)酵液中CoQ10含量對(duì)照。檢測(cè)條件如下高效液相色譜，PDA檢測(cè)器；色譜柱Kromasil-C18-5pm4.6xl50mm;流速lml/min;柱溫25°C;檢測(cè)時(shí)間8min;進(jìn)樣體積5pl;出峰時(shí)間6-7min左右；紫外吸收275nm;清洗針頭溶劑乙醇；檢測(cè)方法甲醇乙醇(5:95);平衡柱子甲醇/乙醇=5/95，lml/min;沖柱子100%甲醇飽和，流速lml/min。輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司2)下表列出了19個(gè)輔酶Q10含量比對(duì)照菌高的突變株，其中樣品編號(hào)168的是spaceQG1.1737-168表3類球紅細(xì)菌部分突變株和出發(fā)菌株發(fā)酵液中輔酶QIO含量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對(duì)這些突變株進(jìn)行連續(xù)五次發(fā)酵，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行，進(jìn)行復(fù)篩，并與出發(fā)菌株以相同條件進(jìn)行比較。最終發(fā)現(xiàn)編號(hào)168的突變株發(fā)酵水平和發(fā)酵液顏色穩(wěn)定，輔酶Q10含量始終高于對(duì)照的輔酶Q10含量的30n/。以上，將其命名為spaceQG1.1737-168，并利用其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行層析試驗(yàn)。復(fù)篩結(jié)果見表4:表4出發(fā)菌株與168號(hào)突變株連續(xù)發(fā)酵輔酶Q10含量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)spaceQG1.1737-168CGMCCNo.2359。2.權(quán)利要求1所述的類球紅細(xì)菌，其16SrDNA部分的序列的GenBank登錄號(hào)是EU682411。3.權(quán)利要求1或2所述的類球紅細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10方面的應(yīng)用。4.權(quán)利要求3所述的類球紅細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10方面的應(yīng)用，其中從發(fā)酵液中提取輔酶Q10的方法是1)樣品處理和提取在發(fā)酵液中加入酸，調(diào)pH值到l-5，之后加入堿，使pH值回復(fù)到6-8，將菌液離心后取菌體，加入有機(jī)溶劑混合均勻；20-50'C搖床，100-200rpm條件下提取1-IO小時(shí)；提取液離心后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；2)柱層析以硅膠或氧化鋁作固定相，洗脫劑為正己垸、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一種或幾種的混合物；3)檢測(cè)收集液中的輔酶QIO。全文摘要本發(fā)明提供了一種類球紅細(xì)菌突變株。該突變株在發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10時(shí)能夠減少分離層析填料的用量，從而降低生產(chǎn)成本。該菌株還能夠提高輔酶Q10的產(chǎn)量。文檔編號(hào)C12N1/20GK101285048SQ20081011383公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日發(fā)明者磊黨,紅印,欣龐,章文荻,靳明慧申請(qǐng)人:中國(guó)空間技術(shù)研究院;天辰神舟實(shí)業(yè)有限公司