專利名稱：海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，涉及一種適用于植物細(xì)胞離 體培養(yǎng)植抹再生和體細(xì)胞突變體定向篩選方法，屬于植物培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域。
海雀稗(戶^;^/"/z7 rag/朋/^/z;Sw.)作為草坪草，在世界熱帶與亞熱帶地 區(qū)廣為種植，是繼狗牙根、結(jié)縷草和假儉草等暖季型禾草之后興起的后起之秀 (解新明，盧小良.海雀稗種質(zhì)資源的優(yōu)良特性及其利用價(jià)值[J],華南農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 25(增刊II): 64-67 )。近年來(lái)海雀稗在蘇、浙、滬地區(qū)得 到推廣種植，但其綠期與當(dāng)?shù)胤N植的狗牙根和結(jié)縷草相比短7-25 d，迫切需 要提高海雀稗的耐寒性，延長(zhǎng)綠期。三倍體的海雀稗因花粉敗育、自交不親 和等障礙(馬國(guó)華，趙南先.雀稗屬細(xì)胞學(xué)和繁殖生物學(xué)研究[J],亞熱帶植 物科學(xué)，2003, 32 (3): 5-9 )，給常規(guī)育種工作帶來(lái)困難。
植物體細(xì)胞突變體篩選技術(shù)為植物品種改良開(kāi)辟了細(xì)胞和分子生物學(xué)育 種新途徑。體細(xì)胞突變體篩選是在植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，結(jié)合施加相應(yīng)的選擇 壓進(jìn)行定向誘變，有利于篩選出期望的體細(xì)胞突變體。國(guó)外一些學(xué)者以-3。C作 為組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)篩選耐寒變異的脅迫條件，在煙草、辣椒、胡蘿卜、水稻等 作物上得到耐寒的愈傷組織，但最終都未能分化出再生植抹(Takeuchi M,
Tetuo N, Huruya P. Plant tissue culture technology[M]. Asakura Publishing Co. Lid, 1984， 105-106; Japan Agriculture, Forestry and Fisheries Technology Conference Services Bureau. 1987， Experiments study the achievement book, III 68-69 )。在水稻上，金潤(rùn)洲等通過(guò)愈傷組
織在15'C下連續(xù)繼代培養(yǎng)3個(gè)月，獲得了耐冷突變體材料(金潤(rùn)洲，都興林, 王景余，等.粳稻體細(xì)胞耐泠變異的誘導(dǎo)篩選技術(shù)[J].作物品種資源，1999, (2): 27-29 )。；翟國(guó)堂以4°C的溫度處理愈傷組織，供試的4個(gè)品種都得到了 耐寒變異林系(翟國(guó)堂.水稻變異體篩選[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996， 1背景技術(shù)：
3(3): 209-213 ); Bert in和Bouharmont則以5-10。C為選擇壓，在4個(gè)品種中 獲得了耐寒哭變體(BertinP， Bouharmont J. Use of somaclonal variation and in vitro selection forchilling tolerance improvement in rice[J]. Euphycita， 1997, 96 (1): 135-142.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，溫度設(shè)置 為0°C，研究低溫培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和綠苗分化的影響，運(yùn)用離體培 養(yǎng)技術(shù)從耐寒突變細(xì)胞再生出植抹，建立海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法， 獲得海雀稗耐寒突變體植抹。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
1、海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是
1) 材料
選用海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，0°C為低溫篩選壓；
2) 培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，添加蔗糖30
g/L;
愈傷組織繼代培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成2,4-二氯 苯氧乙酸2. 0 rag/L,6-芐基氨基嘌呤0. 05 mg/L，瓊脂條16 g/L;
愈傷組織分化培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成6-千基氨基 嘌呤2. 0 mg/L,瓊脂條8 g/L;
上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5. 8;
3) 方法
將顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，用作低溫 處理材料；冰箱溫度設(shè)置為0。C，低溫培養(yǎng)時(shí)間分別為60d;經(jīng)過(guò)低溫培養(yǎng)和 篩選的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上形成綠苗；綠苗再轉(zhuǎn)移到愈傷組 織分化培養(yǎng)基上，發(fā)育成具有根、莖、葉的完整再生植抹。
作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步完善和補(bǔ)充，本發(fā)明還包括以下附加的技 術(shù)特征，以便在實(shí)施時(shí)根據(jù)需要選用
所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行。
所述的愈傷組織低溫培養(yǎng)在無(wú)光源的冰箱內(nèi)進(jìn)行。所述的愈傷組織分化在光照條件下進(jìn)行。
所述的培養(yǎng)室溫度為26±2°C,光照強(qiáng)度為1500 lx，光照時(shí)間為16h/d。 本發(fā)明與現(xiàn)有4支術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積4及效果
本發(fā)明克服在現(xiàn)有植物耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法中，溫度設(shè)置在4-15 。C之間，篩選壓偏^氐，耐寒性改良達(dá)不到預(yù)期效果的缺陷。在離體培養(yǎng)條件下， 選用具有高頻率植^^朱再生能力的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，進(jìn)行低溫(TC培 養(yǎng)和篩選，提高耐寒突變體篩選的育種效果。本發(fā)明建立的海雀稗耐寒體細(xì)胞 突變體篩選方法適宜用于植物體細(xì)胞突變體篩選，為在細(xì)胞水平上開(kāi)展植物細(xì) 胞突變體育種提供條件。
以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，溫度"^殳置為0°C,培養(yǎng)時(shí)間60 d， 愈傷組織綠苗分化率為23%，獲得的再生植抹的半致死溫度與對(duì)照植抹相比明 顯降低，SRAP分子測(cè)定確認(rèn)獲得了海雀稗耐寒突變體植抹。海雀稗顆粒狀胚 性愈傷組織在(TC下，培養(yǎng)65 d、 70 d也得到了批量再生4ij朱。


對(duì)照愈傷組織。 (TC培養(yǎng)60 d的愈傷組織。 對(duì)照愈傷組織分化綠苗。 0'C培養(yǎng)60 d的愈傷組織分化綠苗。 (TC培養(yǎng)60 d的再生植抹。 與耐寒性相關(guān)SRAP標(biāo)記鑒定。
具體實(shí)施例方式
1. 材料和方法 1. 1試驗(yàn)材料
以海雀稗品種"Adalay，，(尸a柳/鵬ra^ ./2"腿Sw. cv. Adalay)幼穗誘 導(dǎo)產(chǎn)生的顆粒狀胚性愈傷組織為材料(梁流芳，佘建明，吳瑛瑛，等.海雀稗 幼穗離體培養(yǎng)植林再生[J].草地學(xué)報(bào)，2008, 16 (6): 590-593 )。
1. 2培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T， Skoog F. A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue
圖1: 圖2: 圖3: 圖4: 圖5: 圖6:cultures[J]. Physiol plant, 1962, 15:473 ~ 497 )和B5維生素(Gamborg 0 L， Miller R A， 0jima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot eel 1 s [J] Exp. Cell Res., 1968. 50: 151 ~ 158 )組成，為 植物組織培養(yǎng)中一種常用的培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L;
愈傷組織繼代培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成2, 4-二氯苯氧 乙酸(簡(jiǎn)稱2，4-D,上海化學(xué)試劑四廠)2. Omg/L， 6-千基氨基。票呤(簡(jiǎn)稱 BAP,上海雪滿生物科技有限公司)0. 05mg/L，瓊脂條(乘風(fēng)牌，福建泉州市 泉港化工廠)16 g/L;
愈傷組織分化培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成6-千基氨基噪 呤(簡(jiǎn)稱BAP,上海雪滿生物科4支有P艮公司)2.0 mg/L,瓊脂條(乘風(fēng)牌， 福建泉州市泉港化工廠)8 g/L;
上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5. 8;
1. 3方法
將顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，用作低溫
處理材料；冰箱溫度設(shè)置分別為o士rc、 6土rc，再在此溫度條件下分別進(jìn)
行0 d、 30 d、 45 d、 60 d、 75 d、 90 d的低溫培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)低溫培養(yǎng)和篩選的 愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上形成綠苗；綠苗再轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化 培養(yǎng)基上，發(fā)育成具有根、莖、葉的完整再生植林。
愈傷組織繼代培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行；愈傷組織低溫培養(yǎng)在無(wú)光源的冰箱內(nèi) 進(jìn)行；愈傷組織分化和生根培養(yǎng)在光照條件下進(jìn)行；培養(yǎng)室溫度為26±2°C， 光照強(qiáng)度為1500 lx，光照時(shí)間為16 h/d。 2. 結(jié)果
2.1低溫對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響
在6。C低溫條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒狀愈傷組織由黃色逐漸轉(zhuǎn) 為淺棕褐色到深棕褐色，愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)。
在0。C低溫條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒狀愈傷組織由黃色逐漸轉(zhuǎn) 為淺褐色到深褐色、黑色，愈傷組織生長(zhǎng)受抑(圖l,圖2)。
愈傷組織在低溫條件下培養(yǎng)45 d、 60 d和75 d,其褐化率基本上都維持 在70°/。左右。經(jīng)過(guò)低溫培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，部分深
6褐色或黑色的愈傷組織也能分化出綠苗，這一結(jié)果表明愈傷組織的褐化程度并 不能作為衡量愈傷組織綠苗分化率的標(biāo)準(zhǔn)。
2. 2低溫對(duì)愈傷組織分化的影響
表1顯示在6'C和(TC條件下，培養(yǎng)30 d對(duì)愈傷組織的綠苗分化能力影響 均不明顯，愈傷組織的綠苗分化率在85%左右，比對(duì)照略有下降；培養(yǎng)45 d, 綠苗分化率分別為60%和50%左右；培養(yǎng)60d對(duì)愈傷組織的綠苗分化能力影響 明顯，綠苗分化率分別降至30%和20%以上；(TC下培養(yǎng)75 d,愈傷組織完全 喪失分化植抹的能力；6'C條件下培養(yǎng)90 d，愈傷組織的綠苗分化率為10%。
對(duì)照愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21 d分化出大量綠芽 (圖3)。從冰箱內(nèi)取出低溫(TC培養(yǎng)的愈傷組織，直接轉(zhuǎn)到愈傷組織分化培養(yǎng) 基上，21 d分化出少量綠芽(圖4)。低溫篩選得到的綠芽轉(zhuǎn)到上述相同的新 鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)一步發(fā)育成具有根、莖、葉的完整再生植抹(圖5)，試管苗 移栽成活率達(dá)95%以上。
表1低溫培養(yǎng)對(duì)愈傷組織分化的影響
培養(yǎng) 天數(shù)6°C0°C愈傷總數(shù)綠苗 愈傷數(shù)綠苗 分化率(％)愈傷總數(shù)綠苗 愈傷數(shù)綠苗 分化率(％)
0857891. 7726894. 4
30776584. 4806986. 3
45834959. 0864451. 2
60862832. 6781823. 1
75741621. 68100
9078810. 37500
2. 3體細(xì)胞突變體植林半致死溫度(LT5Q)檢測(cè)
參考朱根海等的方法(朱根海，朱培仁.小麥抗凍性的季節(jié)變化及溫度對(duì) 脫鍛煉的效應(yīng)[J].南京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，7(2): 9-16),葉片用蒸餾水漂洗干 凈，再用吸水紙吸干表面水分。溫度設(shè)置為4°C、 (TC、 -4。C和-8。C，溫度用 干冰和乙醇調(diào)整，溫度波動(dòng)在士O. 5。C的范圍內(nèi)。各種溫度處理2h，解凍0.5 h,加去離子水20 ml，真空滲入30 s后，置于室溫下放置2 h。用DDS-307A
7型電導(dǎo)儀上測(cè)定水凍電導(dǎo)率，然后置于沸水浴中20 S,冷卻后測(cè)煮沸電導(dǎo)率
值。按下列公式計(jì)算電解質(zhì)透出率電解質(zhì)透出率(°/。)=(水凍電導(dǎo)率/煮沸 電導(dǎo)率)x 100。
低溫脅迫下細(xì)胞電解質(zhì)透出率與溫度的關(guān)系曲線呈S型，與Logistic方 程Y-K/ (l+ae )具有較好的擬合度，求該方程二介導(dǎo)數(shù)，并令其等于0，即 可獲得曲線的拐點(diǎn)X= ( lna ) /b，即為半致死溫度(LT50)。
對(duì)照植抹葉片、(TC低溫培養(yǎng)30d、 45 d、 60 d再生植抹葉片的半致死溫 度分別為-5.69、 -6.07、 -6.35和-6. 63。半致死溫度檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò) 耐寒體細(xì)胞突變體篩選得到的植抹的抗寒性比對(duì)照植抹都得到不同程度的提 高(表2)。
表2體細(xì)胞突變體和對(duì)照葉片的電導(dǎo)率Logistic方程參數(shù)及半致死溫度
低溫處理天數(shù)(d)3bk半致死溫度rc)
075. 2-O. 350.99-5. 69
3088. 8-O. 360. 99-6. 07
4510. 12-O. 360. 99-6. 35
6011. 15-O. 360. 99-6. 63
2.4體細(xì)胞突變體植林SRAP分子鑒定
檢測(cè)5份材料l為原始對(duì)照植抹，2為對(duì)照組培植抹，3為0。C培養(yǎng)和篩 選30 d得到的植4朱，4為(TC培養(yǎng)和篩選45 d得到的檔4朱，5為(TC培養(yǎng)和篩 選60 d得到的植抹。
基因組DNA提取和檢測(cè)以上述5份材料的幼葉為材料，采用CTAB( cetyl -trimethyl ammonium bromide,十六烷基三曱基溴化銨)法(Pich U, Schubert I. Miniprep method for isolation of DNA from plants with a high content ofpolyphenolics [門.Nucleic Acids Research, 1993, 21 (14): 28-33.) 提取基因組DNA，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。
SRAP-PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積為15 juL,包括IX buffer, 1.5 mmol/L MgCl2， 0.2 mmol/L dNTP， 200 nmmol/L引物，40 ng DNA， 1U Tag酶。反應(yīng)在 MJ Research Thermal Cycler PTC-IOOPOM義上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 預(yù)變性4 min; 94。C變性l rain， 35。C退火l min, 72。C延伸l min, 5個(gè)循環(huán)；
894。C變性lmin， 50。C退火1 min， 72。C延伸10 s, 35個(gè)循環(huán);72。C延伸10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠分離，銀染觀察。
8對(duì)SRAP引物組合對(duì)海雀稗顆粒狀愈傷組織經(jīng)過(guò)(TC低溫培養(yǎng)和篩選后獲 得的再生植抹進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出IO個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記。其中標(biāo)記 L1R2-2000、 L2R7-230和L10R3-250在海雀稗顆粒狀愈傷組織經(jīng)過(guò)(TC低溫培 養(yǎng)和篩選的再生核j朱中都存在，標(biāo)記L10R1-1700在未經(jīng)^氐溫培養(yǎng)和篩選的對(duì) 照再生植林中存在，標(biāo)記L2R1-1100、 L2R7-700和L2R7-300僅在(TC低溫培 養(yǎng)和篩選45 d和60 d的再生植抹中出現(xiàn)，而L3R4-630僅在(TC低溫培養(yǎng)和 篩選60 d的材料中出現(xiàn)(圖6 )。檢測(cè)結(jié)果表明，特異性SRAP標(biāo)記與海雀稗 體細(xì)胞突變體的耐寒性相關(guān)，海雀稗顆粒狀愈傷組織經(jīng)過(guò)(TC低溫培養(yǎng)和篩選 后獲得的再生植;昧在分子水平上發(fā)生了變異。
3. 結(jié)論
Cardona和Duncan在海雀稗的愈傷組織再生植抹中發(fā)現(xiàn)一些耐寒的植抹 (CardonaCA， Duncan R R. K/Zto cul ture， somaclonal variation, and transformation strategies with paspalum turf ecotypes. In: MB Sticklen and MP Kenna (ed) Turfgrass biotechnology-eel 1 and molecula genetic approaches to turfgrass improvement[M〗.Ann Arbor Press, MI, 1997， 229-236 )，但有關(guān)海雀稗體細(xì)胞突變體篩選尚未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，溫度設(shè)置為(TC,低溫培 養(yǎng)和篩選60d，愈傷組織綠苗分化率為23%，從經(jīng)過(guò)耐寒篩選的細(xì)胞再生出植 林。應(yīng)用耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法得到的植林的葉片半致死溫度明顯低于對(duì) 照植抹的葉片半致死溫度，SRAP分子鑒定證明獲得了耐寒體細(xì)胞突變體。試 驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明建立的海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法具有實(shí)用價(jià)值，為 在細(xì)胞水平上開(kāi)展海雀稗耐寒新品種選育提供技術(shù)支撐。
以上以一個(gè)具體的例子對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出了詳細(xì)說(shuō)明，但并非只限 于上述具體實(shí)施細(xì)節(jié)；以本發(fā)明技術(shù)方案的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)的其它數(shù)據(jù)實(shí)施本發(fā)明 的技術(shù)方案，達(dá)到了同樣的技術(shù)效果，在此不再贅述。
權(quán)利要求
1、海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是1)材料選用海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，0℃為低溫篩選壓；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，添加蔗糖30g/L；愈傷組織繼代培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤0.05mg/L，瓊脂條16g/L；愈傷組織分化培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中附加以下激素組成6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L，瓊脂條8g/L；上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；3)方法將顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，用作低溫處理材料；冰箱溫度設(shè)置為0℃，培養(yǎng)時(shí)間為60d；經(jīng)過(guò)低溫培養(yǎng)和篩選的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上形成綠苗；綠苗再轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，發(fā)育成具有根、莖、葉的完整再生植株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所迷的海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是 所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是 所述的愈傷組織低溫培養(yǎng)在無(wú)光源的冰箱內(nèi)進(jìn)行。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是 所述的愈傷組織分化在光照條件下進(jìn)行。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，其特征是 所述的培養(yǎng)室溫度為26士2。C，光照強(qiáng)度為1500 lx，光照時(shí)間為16 h/d。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種海雀稗耐寒體細(xì)胞突變體篩選方法，屬于植物培養(yǎng)方法，其是以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，在細(xì)胞水平上進(jìn)行低溫培養(yǎng)和耐寒篩選，從經(jīng)過(guò)耐寒篩選的細(xì)胞再生出植株；顆粒狀愈傷組織在附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L、6-芐基氨基嘌呤0.05mg/L的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，用作低溫培養(yǎng)的材料；在0℃低溫條件下，培養(yǎng)60d的愈傷組織轉(zhuǎn)到附加6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L的愈傷組織分化培養(yǎng)基上，綠苗分化率為23％。綠苗在附加6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L的愈傷組織分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，發(fā)育成具有根、莖、葉的完整再生植株。本發(fā)明適宜用于植物新品種選育，為在細(xì)胞水平上開(kāi)展植物體細(xì)胞突變體育種提供條件。
文檔編號(hào)A01H1/04GK101558737SQ20091009736
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者佘建明, 倪萬(wàn)潮, 葉曉青, 吳小明, 吳瑛瑛, 旭 張, 楊莉林, 梁流芳, 王松鳳, 董民強(qiáng) 申請(qǐng)人:浙江紹興白云建設(shè)有限公司;江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;杭州白云草業(yè)研究所有限公司