專利名稱：用廉價(jià)底物培養(yǎng)微生物細(xì)胞催化油脂原料生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物油脂合成領(lǐng)域，特別是提出了一種用廉價(jià)底物培養(yǎng)微生物細(xì)胞催 化油脂原料生產(chǎn)生物柴油的方法。利用廉價(jià)底物作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的 微生物全細(xì)胞，用于催化油脂生產(chǎn)生物柴油。廉價(jià)底物包括豆粉、豆粕、玉米漿等。
背景技術(shù)：
油脂工業(yè)的前景之一-生物柴油是由生物油脂原料通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成的長鏈脂肪 酸酯類物質(zhì)，是一種新型無污染的可再生能源。生物柴油的燃燒性能可以與傳統(tǒng)的石 油系柴油媲美。同時(shí)，其與傳統(tǒng)的石油系柴油相比具有原料可再生，環(huán)境友好，閃點(diǎn) 高，十六烷值高等優(yōu)點(diǎn)。因而生物柴油的研究和應(yīng)用已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。
目前生物柴油的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法、生物酶法及超臨界流體法，其中由于生 物酶法合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、無污染物排放、油脂原料中的游離脂肪酸和 少量水不影響酶促反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的發(fā)展方向，因而日益受到人們的重視。
阻礙生物酶法制備生物柴油產(chǎn)業(yè)化的主要因素是催化劑酶的成本與化學(xué)法所使 用的酸或堿相比較高。釆用產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的微生物全細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)的商品化固定化脂 肪酶催化油脂轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油，省去了傳統(tǒng)的固定化脂肪酶生產(chǎn)過程中的分 離、純化以及固定化等步驟，可以有效地降低酶法制備生物柴油的生產(chǎn)成本。降低微生物細(xì)胞的培養(yǎng)成本，是進(jìn)一步降低微生物細(xì)胞催化生產(chǎn)生物柴油生產(chǎn) 成本的關(guān)鍵。微生物培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的主要成分包括氮源、碳源以及少量無機(jī)鹽。 對于以生產(chǎn)酶蛋白為主要目的的培養(yǎng)過程，氮源的選用尤其重要。在微生物細(xì)胞催化 油脂原料生產(chǎn)生物柴油的研究中，所用微生物細(xì)胞培養(yǎng)基氮源通常為蛋白胨。日本學(xué) 者報(bào)道了利用蛋白胨為培養(yǎng)基培養(yǎng)i .ow加e IFO 4697全細(xì)胞催化劑，然后再將培養(yǎng)得 到的全細(xì)胞催化劑用于生物柴油的制備(Kaieda M， Samukawa T, Matsumoto T， Ban K, Kondo A， Shimada Y, Noda H， Nomoto F， Ohtsuka K, Izumoto E, Fukuda H(1999) Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by i 始o(jì)戸51 07zfle lipase in a water-containing system without an organic solvent. Journal of Bioscience and Bioengineering 88:627-631)。蛋白胨價(jià)格昂貴，且用量較大，以蛋白胨為氮源制約了 微生物全細(xì)胞作為催化劑在生物柴油中的實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明提出采用廉價(jià)豆粉等作為 底物氮源培養(yǎng)微生物細(xì)胞，可以大大降低微生物細(xì)胞的培養(yǎng)成本，從而有效降低利用 微生物細(xì)胞作為催化劑生產(chǎn)生物柴油的生物催化劑成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用廉價(jià)底物培養(yǎng)微生物細(xì)胞催化油脂原料生產(chǎn)生物 柴油的方法，降低用于生物柴油制備的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)成本。在微生物細(xì)胞的培養(yǎng) 過程中，利用相對廉價(jià)的豆粉、豆粕、玉米漿等底物作為培養(yǎng)基氮源，可以有效降低 全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)成本。
本發(fā)明的具體工藝為利用5g/L 300g/L廉價(jià)的豆粉、豆粕、玉米漿等底物作為培養(yǎng)基氮源，與其它碳源及無機(jī)鹽組合，培養(yǎng)微生物細(xì)胞，然后利用培養(yǎng)出來的全 細(xì)胞催化劑在如下條件下轉(zhuǎn)化可再生油脂制備生物柴油加入短鏈醇與油脂摩爾比為 3: 1 6: l的反應(yīng)底物，當(dāng)短鏈醇與油脂的摩爾比為3: 1-4: 1時(shí)，短鏈醇按總量的 平均數(shù)分兩步加入；當(dāng)短鏈醇與油脂的摩爾比為5: 1-6: 1時(shí)，短鏈醇按總量的平均 數(shù)分三步加入，加入基于油脂(或游離脂肪酸)質(zhì)量2 30%的微生物細(xì)胞，裝入生化 反應(yīng)器中混合均勻，加熱至30'C 6(TC，反應(yīng)10—48小時(shí)后，生物柴油的得率超過 90%。
所述廉價(jià)氮源為包括豆粉、玉米漿、豆粕、玉米蛋白、黃豆面等中的一種，或2 種、或全部的混合物。
所述微生物全細(xì)胞包括產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的細(xì)菌、酵母以及霉菌的游離及固定化細(xì) 胞。特別是及力o^^ IFO 4697游離細(xì)胞和固定化在聚氨酯泡沫載體上的固定化細(xì)胞， 以及經(jīng)交聯(lián)劑(如戊二醛等)交聯(lián)的固定化細(xì)胞。
所述可再生油脂包括各種植物油脂、動物油脂、微生物油脂、廢食用油、煉油腳 料以及游離脂肪酸等。
所述植物油脂為蓖麻油、麻風(fēng)樹油、文冠果油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米 油、棉子油、米糠油、桐油、烏桕油。
所述動物油脂為魚油、豬油、牛油、羊油。
所述微生物油脂包括酵母油脂、細(xì)菌油脂、藻類油脂。
本發(fā)明所述短鏈醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于與利用蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源相比，利用廉價(jià)氮源作為底物， 大大降低了微生物全細(xì)胞的培養(yǎng)成本，從而使利用微生物細(xì)胞催化油脂原料生產(chǎn)生物 柴油的方法在經(jīng)濟(jì)上更有競爭力，可以有效推動微生物全細(xì)胞在生物柴油制備中的應(yīng) 用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
以含20 g/L豆粉，30 g/L大豆油，1. 2g/L磷酸二氫鉀，1. 2g/L硝酸鈉，0. 244 g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基培養(yǎng)尺w7加e IFO 4697游離細(xì)胞,所得細(xì)胞總酶活與以70g/L 蛋白胨為氮源的相當(dāng)。將培養(yǎng)出來的全細(xì)胞催化劑在如下條件下進(jìn)行催化大豆油制備 生物柴油，加入短鏈醇與油脂摩爾比為4: 1的反應(yīng)底物，短鏈醇按總量的平均數(shù)分 兩步加入，即反應(yīng)初始加入2摩爾，反應(yīng)5小時(shí)后再加入2摩爾；加入基于油脂質(zhì)量 5%的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至4(TC，總共反應(yīng)12小時(shí)后， 以豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為90%。
實(shí)施例2
以含200 g/L玉米漿(玉米漿含氮量約4. 5%)， 30 g/L大豆油，1. 2g/L磷酸二 氫鉀，1.2g/L硝酸鈉，0.244g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中加入50-200 粒邊長4-12mm的聚氨酯泡沫顆粒作為載體，對細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，IFO 4697細(xì)胞直接長入載體內(nèi)部，培養(yǎng)得到固定化兄oo^ae IFO 4697細(xì)胞。 將培養(yǎng)出來的全細(xì)胞催化劑在如下條件下進(jìn)行催化棕櫚油制備生物柴油，加入短鏈醇 與油脂摩爾比為5: l的反應(yīng)底物，短鏈醇按總量的平均數(shù)分別在O小時(shí)，3小時(shí)和6 小時(shí)分三步加入，加入基于油脂質(zhì)量12%的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻， 加熱至4(TC，總共反應(yīng)10小時(shí)后，以豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油 轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為951 實(shí)施例3
以含15g/L豆粉，30g/L大豆油，2g/L磷酸氫二銨，1.2g/L磷酸二氫鉀， 0. 35g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入50-200粒邊長4-12mm的聚氨酯泡 沫顆粒作為載體，對細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，義W7加elF0 4697細(xì)胞直 接長入載體內(nèi)部。培養(yǎng)得到固定化及力o^flelF0 4697細(xì)胞。將培養(yǎng)出來的全細(xì)胞催化 劑在如下條件下進(jìn)行催化大豆油制備生物柴油，加入短鏈醇與油脂摩爾比為5: 1的 反應(yīng)底物，短鏈醇按總量的平均數(shù)分別在0小時(shí)，3小時(shí)和6小時(shí)分三步加入，加入 基于油脂質(zhì)量8%的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至40°C，總共反 應(yīng)9小時(shí)后，以豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為 92%。
實(shí)施例4
以含30 g/L豆粕，30 g/L橄欖油，1. 2g/L磷酸二氫鉀，1. 2g/L硝酸鈉，0. 244 g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入50-200粒邊長4-12m的聚氨酯泡沫顆 粒作為載體，對細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，i .o^加"F0 4697細(xì)胞直接長 入載體內(nèi)部，培養(yǎng)得到固定化及.00^/" 0 4697細(xì)胞。然后將培養(yǎng)所得固定化細(xì)胞在 含0.1%的戊二醛溶液中交聯(lián)30min。將交聯(lián)后的固定化全細(xì)胞催化劑在如下條件下進(jìn) 行催化麻風(fēng)樹油制備生物柴油，加入短鏈醇與油脂摩爾比為6: 1的反應(yīng)底物，短鏈 醇按總量的平均數(shù)分別在0小時(shí)，8小時(shí)和15小時(shí)分三步加入，加入基于油脂質(zhì)量 25%的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勾，加熱至45'C，總共反應(yīng)20小時(shí)后， 以豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為94%。
實(shí)施例5
以含30g/L豆粉，30g/L油酸，1.2g/L磷酸二氫鉀，1. 2g/L硝酸鈉，0.244 g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入50-200粒邊長4-12mm的聚氨酯泡沫顆 粒作為載體，對細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，i .07加elF0 4697細(xì)胞直接長 入載體內(nèi)部。培養(yǎng)得到固定化i ,oo^aelF0 4697細(xì)胞，然后將培養(yǎng)所得固定化細(xì)胞在 含0.1%的戊二醛溶液中交聯(lián)30min。將交聯(lián)后的固定化全細(xì)胞催化劑在如下條件下進(jìn) 行催化棉籽油制備生物柴油，加入短鏈醇與油脂摩爾比為5: 1的反應(yīng)底物，短鏈醇 按總量的平均數(shù)分別在0小時(shí)，3小時(shí)和6小時(shí)分三步加入，加入基于油脂質(zhì)量20% 的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至40'C,總共反應(yīng)10小時(shí)后，以 豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為90%。實(shí)施例6
以含30 g/L玉米蛋白，30 g/L油酸甲酯，1.2g/L磷酸二氫鉀，L2g/L硝酸 鈉，0.244 g/L無水硫酸鎂為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入50-200粒邊長4-12咖的聚 氨酯泡沫顆粒作為載體，對細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，i .ow加e IFO 4697 細(xì)胞直接長入載體內(nèi)部。培養(yǎng)所得固定化i .oo^"elF0 4697細(xì)胞。將培養(yǎng)所得固定化 細(xì)胞在含0.1%的戊二醛溶液中交聯(lián)30min。將交聯(lián)后的固定化全細(xì)胞催化劑在如下條 件下進(jìn)行催化大豆油制備生物柴油，加入短鏈醇與油脂摩爾比為5: 1的反應(yīng)底物， 短鏈醇按總量的平均數(shù)分別在O小時(shí)，5小時(shí)和10小時(shí)分三步加入，加入基于油脂質(zhì) 量20%的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至35'C，總共反應(yīng)14小時(shí) 后，以豆粉為氮源培養(yǎng)出的全細(xì)胞催化劑催化大豆油轉(zhuǎn)化的生物柴油得率為92%。
根據(jù)上述實(shí)施例，以豆粉、豆粕、玉米漿等廉價(jià)有機(jī)氮源可以有效培養(yǎng)產(chǎn)胞內(nèi)脂 肪酶的微生物全細(xì)胞，然后將培養(yǎng)得到的全細(xì)胞催化劑用于生物柴油的制備。該方法 可以大大降低微生物細(xì)胞的培養(yǎng)成本，以及生物柴油制備中的生物催化劑的成本。
權(quán)利要求
1、一種用廉價(jià)底物培養(yǎng)微生物細(xì)胞催化油脂原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于工藝為用5g/L～300g/L豆粉、豆粕、玉米漿或黃豆面底物作為培養(yǎng)基氮源，與其它碳源及無機(jī)鹽組合，培養(yǎng)微生物細(xì)胞，然后利用培養(yǎng)出來的全細(xì)胞催化劑在如下條件下轉(zhuǎn)化可再生油脂制備生物柴油；所述的如下條件是加入短鏈醇與油脂摩爾比為3∶1～6∶1的反應(yīng)底物，當(dāng)短鏈醇與油脂的摩爾比為3∶1-4∶1時(shí)，短鏈醇按總量的平均數(shù)分兩步加入；當(dāng)短鏈醇與油脂的摩爾比為5∶1-6∶1時(shí)，短鏈醇按總量的平均數(shù)分三步加入，加入基于油脂或游離脂肪酸質(zhì)量2～30％的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至30℃～60℃，反應(yīng)10-48小時(shí)后，生物柴油的得率超過90％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其特征在于所述的培養(yǎng)基氮源 為豆粉、豆粕、玉米漿或黃豆面中的2種或全部的混合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物全細(xì)胞包括產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的細(xì)菌、酵母或霉菌的游離及固定化細(xì)胞；所述的霉菌的游離及固定化細(xì)胞包括 i .oo;加e IFO 4697游離細(xì)胞和固定化在聚氨酯泡沫載體上的固定化細(xì)胞，以及經(jīng)交聯(lián) 劑交聯(lián)的游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于交聯(lián)劑為戊二醛。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述短鏈醇為甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇或戊醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述可再生油脂包括各種植物油脂、動物油脂、微生物油脂、廢食用油、煉油腳料或游離脂肪酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于所述植物油脂為蓖麻油、麻風(fēng)樹油、文冠果油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉子油、米糠油、桐油或?yàn)蹊暧汀?br> 8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于所述動物油脂為魚油、豬油、牛油或羊油。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于所述微生物油脂包括酵母油脂、細(xì)菌油脂或藻類油脂。
全文摘要
一種用廉價(jià)底物培養(yǎng)微生物細(xì)胞催化油脂原料生產(chǎn)生物柴油的方法，屬于生物油脂合成領(lǐng)域。工藝為用5g/L～300g/L豆粉、豆粕、玉米漿或黃豆面底物作為培養(yǎng)基氮源，與其它碳源及無機(jī)鹽組合，培養(yǎng)微生物細(xì)胞，然后利用培養(yǎng)出來的全細(xì)胞催化劑在如下條件下轉(zhuǎn)化可再生油脂制備生物柴油加入短鏈醇與油脂，加入基于油脂或游離脂肪酸質(zhì)量2～30％的微生物細(xì)胞，裝入生化反應(yīng)器中混合均勻，加熱至30℃～60℃，反應(yīng)10-48小時(shí)后，生物柴油的得率超過90％。優(yōu)點(diǎn)在于，有效降低全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)成本。
文檔編號C12P7/64GK101307342SQ20081011537
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者劉德華, 偉 杜, 偉 里 申請人:清華大學(xué)