專利名稱：：一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖呼吸與綜合征病毒引起的，以懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙及仔豬和育肥豬的呼吸道疾病為主要癥狀的傳染病。該病1987年首次在美國報(bào)道，此后在加拿大、德國、西班牙、英國也相繼報(bào)道了該病的發(fā)生。1995年，我國大陸發(fā)現(xiàn)了此病，且在多個(gè)省份開始流行。隨后在1996年和1997年相繼從疑似的病例中分離到了該病病源。豬繁殖與呼吸綜合征病毒現(xiàn)已成為我國危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要原因之一。另外，動(dòng)物產(chǎn)品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的污染也會帶來食品衛(wèi)生問題。因此，豬繁殖與呼吸綜合征病毒的防治、凈化需要敏感、特異的檢測、診斷技術(shù)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒的現(xiàn)有檢測方法很多，大致可以分為三大類，即病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷法。病原學(xué)診斷方法包括組織學(xué)診斷、動(dòng)物接種試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)法，需要一定數(shù)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且實(shí)驗(yàn)周期較長。血清學(xué)診斷方法包括間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。分子生物學(xué)診斷方法主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)與熒光核酸探針。分子生物學(xué)診斷方法比前兩種方法快速、靈敏，但需要使用特殊的儀器，如PCR儀，而熒光探針的制備比較昂貴，不適于基層應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)的快速檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測試劑盒。本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒，包括三對引物，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionN咖berU87392中MN基因結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的環(huán)形引物對。上述三對引物針對的MN基因，為國際公認(rèn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲株41-2332型毒株的保守基因。豬繁殖與呼吸綜合征病毒分為歐洲株與美洲株，我國流行的是美洲株。VR-2332型毒株是美洲株的經(jīng)典毒株，為鑒定美洲株的國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)株。所以本發(fā)明的試劑盒可以檢測所有豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲株。上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒在使用過程中，所述的內(nèi)側(cè)引物對、外側(cè)引物對和環(huán)形引物對作為一個(gè)整體組使用，使用時(shí)應(yīng)該盡量避免引物二聚體的形成。所述內(nèi)側(cè)引.物對包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照；所述陽性對照為豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392的RNA。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑具體可為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HCl、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對、所述外側(cè)引物對及所述環(huán)形引物對，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HC10.5nmo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25nmol、Tween200.025uL、MgS040.2-20umo1、甜菜堿20umo1、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04-0.06,1，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.004-0.008,1，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量優(yōu)選如下Tris-HC10.5umo1、KC10.25wmol、(NH4)2S040.25ymol、Tween200.025uL、MgS040.2umo1、甜菜堿20,1、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04urao1,所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.004yraol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0.02ymo1。所述試劑盒還包括熒光顯色劑，任何常規(guī)熒光顯示劑均可，如熒光染料SYBRGREENI。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。本發(fā)明還提供了一種檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，是用所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒對來自死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。所述檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒。直接檢視時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照的體積配比為23:2:2。顯色檢測時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照熒光顯色劑的體積配比為23:2:2(1-3);LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照熒光顯色劑的體積配比優(yōu)選為23:2:2:1。可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒。①直接檢視裝有陽性對照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說明待檢樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說明樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陽性。②顯色檢測在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽性對照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說明豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說明樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陽性。本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的檢測原理如下.根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒麗基因序列(序列表的序列1)保守區(qū)的特定區(qū)域設(shè)計(jì)了一組用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(內(nèi)側(cè)上游引物FIP和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對(環(huán)形上游引物L(fēng)F和環(huán)形下游引物L(fēng)B)。三對引物和豬繁殖與呼吸綜合征病毒麗基因序列保守區(qū)的八個(gè)特定區(qū)域的序列完全配對，確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法的特異性。F3:SEQIDN02:GGGGGTGTACTCAGCCATAG(序列表的序列2);B3:SEQIDN03:ACGAGGCTTTTTAACCCG(序列表的序列3);FIP:SEQIDNO4:CACTTTCAACGTGGTGGGCATTTTCCTCCAGATGCCGTTTGTG(序列表的序列4);BIP:SEQIDNO5:GGTTTCATCCGATTGCGGCAAATTTTAATGTGCCGTTGACCGTAG(序列表的序列5);LF:SEQIDN06:CCAGAATGTACTTGCGGCCTAG(序列表的序列6);LB:SEQIDN07:ATTTGTCGTCCGGCGTCCC(序列表的序列7)。所述的引物組與所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒U87392序列中MN基因上8個(gè)特定區(qū)域結(jié)合，見表l表1引物組與所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒U87392序列中MN基因的結(jié)合區(qū)域<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述引物組在AMV反轉(zhuǎn)錄酶和具有高度鏈置換催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成對模板RNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增過程分為三個(gè)階段，具體如下(1)反轉(zhuǎn)錄階段在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，樣本RNA被反轉(zhuǎn)錄為cDNA。(2)循環(huán)起始階段一端內(nèi)側(cè)引物先與模板結(jié)合并啟動(dòng)DNA合成。相同一端的外側(cè)引物隨后與模板結(jié)合啟動(dòng)DNA合成，并發(fā)生鏈置換釋放出含有內(nèi)側(cè)引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成并發(fā)生鏈置換，最后形成一個(gè)初始的莖環(huán)DNA。(3)反應(yīng)循環(huán)階段內(nèi)側(cè)引物與初始莖環(huán)DNA結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換DNA合成，可產(chǎn)生另一個(gè)初始莖環(huán)DNA和一個(gè)新的兩倍長度的莖環(huán)DNA。這些莖環(huán)DNA可作為模板繼續(xù)與內(nèi)側(cè)引物結(jié)合啟動(dòng)鏈置換DNA合成，并且每次合成均可使莖環(huán)DNA的莖長度成倍增長。進(jìn)入循環(huán)階段后，會產(chǎn)生許多分子大小不同的莖環(huán)DNA，這些莖環(huán)DNA還可作為模版與環(huán)形引物結(jié)合，啟動(dòng)更多的DNA合成并發(fā)生鏈置換。最后經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的等溫?cái)U(kuò)增，目的DNA可累積109拷貝。應(yīng)用本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒進(jìn)行檢測，特異性高且靈敏度高，可檢測出6-IO個(gè)拷貝的目的RNA。與PCR檢測方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒檢測，不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬或水浴鍋即可，并且檢測結(jié)果使用熒光染料來觀察即可，操作簡單方便。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于基層現(xiàn)場進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測及食品中可能污染的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測，特別適于基層臨床醫(yī)學(xué)檢測工作及現(xiàn)場即時(shí)檢測。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒可包括如下步驟(1)RNA的提取本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測各種分泌物中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，如血液，肺臟，精液等。不同來源的總RNA提取可參考相應(yīng)資料，或使用相應(yīng)RNA提取試劑盒。(2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增①在裝有23u1的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2u1模板RNA;②于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上60-65。C放置20-90分鐘，取出。在步驟②完成后，取出前，還可以再調(diào)水浴鍋溫度到80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘，目的是能夠終止反應(yīng)，以便長期保存反應(yīng)結(jié)果。(3)結(jié)果判定可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒。①直接檢視裝有陽性對照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說明待檢樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說明樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陽性。②顯色檢測在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽性對照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說明豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說明樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陽性。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的制備一、引物的合成人工合成以下3對引物F3:GTGAATTGGAATATGGTAACTGC;B3:CCATTCCCTGCCATCCTC;FIP:CGATGGTGAGAGGGTGGATGTTTTCAAACTCCAATAGGGGCG;BIP:CTTGCGACTGGGCTCAGAAATTTTCTGCTATAGCTCCAAATAGTCC;LF:TGTGGAATGGCATACTAGAGTT;LB:AGCCCTCAAGGAGAGAGA。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HCl、0.25umolKC1、0.25uraol(NH4)2S04、Tween200.025uL、0.2uraolMgS04、20Umol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035腸1、0,04"mol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.04ymol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.004ymol上游外側(cè)引物(F3)、0.004ymol下游外側(cè)引物(B3)、0.02umo1上游環(huán)形引物(LF)、0.02umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝該試劑盒由以下物質(zhì)組成步驟二配制的LAMP反應(yīng)液、豬繁殖與呼吸綜合征病毒VR-2332型毒株RNA(陽性對照)(美國ATCC菌種庫)、滅菌雙蒸水(陰性對照)、熒光染料SYBRGREENI。實(shí)施例2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0,5umo1Tris-HC1、0.25nmo1KC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、20umolMgS04、20卩mol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各O.035rnnol、0.06iimo1上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.06umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.008nmo1上游外側(cè)引物(F3)、0.008umol下游外側(cè)引物(B3)、0.04ymo1上游環(huán)形引物(LF)、0.04nmol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23nLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HCl、0.25umo1KC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025tiL、10umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05uraol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.05umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.006umol上游外側(cè)引物(F3)、0.006umol下游外側(cè)引物(B3)、0.03umo1上游環(huán)形引物(LF)、0.03umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例4、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例1制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總RNA收集血液，按血液:抗凝劑=5:1的比例加入抗凝劑擰檬酸葡萄糖溶液。用0.25mL全血加0.75mLTRIzo1LSReagent,劇烈振蕩，室溫放置5min;加入200uL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置10min后，4"C下12000g離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)入新離心管；在水相中加入等體積異丙醇，室溫沉淀10min后，4"C下12OOOg離心10min，吸棄上清，加入75。/。乙醇lmL輕輕振搖后，4r下7500g離心5min;將沉淀自然風(fēng)干后，溶于20uL無核酸酶的蒸餾水中，并加O.5pLRNase抑制劑(30U/txL)，所制備RNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測或C:存于-8(TC備檢。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述2只豬的RNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到病豬的RNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的RNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23pL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上60'C放置90分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入1pL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例5、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例2制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述2只豬的RNA樣本的進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本的檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的L扁P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的RNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的RNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23nL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23^L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入L滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在金屬浴鍋上65。C放置70分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入2uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例6、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例3制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述2只豬的RNA樣本的進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本的檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的RNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的RNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2iiL豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6CTC放置50分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3pL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例7、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的死豬，l只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例1制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述2只豬的RNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到病豬的RNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2i!L步驟一得到健康豬的RNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65。C放置30分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3UL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例8、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的死豬，1只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例1制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述2只豬的RNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23wL的L細(xì)P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的RNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23tiL的L扁P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的RNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2i:L豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的L雇P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2iiL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置20分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到9(TC反應(yīng)2min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3iiL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例9、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒靈敏度的檢測制備O.5Xl()4拷貝/yL、0.5X103拷貝/uL、0.5X102拷貝/uL、5拷貝/nL和0.5拷貝/uLMN基因的質(zhì)粒樣本。采用實(shí)施例3制備的試劑盒對質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測。一、質(zhì)粒的制備使用豬繁殖與呼吸綜合征病毒VR-2332型毒株RNA制備質(zhì)粒。根據(jù)PCR方法擴(kuò)增得到VR-2332型毒株MN基因片段，再與T載體連接后即形成所需要的麗基因的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒分子對應(yīng)一個(gè)拷貝的M^基因。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)?？呻S著感受態(tài)細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。最后從感受態(tài)細(xì)胞中提取純化MN基因質(zhì)粒。得到的質(zhì)?？赏ㄟ^分光光度計(jì)法測定并計(jì)算拷貝數(shù)濃度。用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到所需要的濃度，即0.5X104拷貝/uL、0.5X103拷貝/uL、0.5Xl()2拷貝/yL、5拷貝/uL禾卩0.5拷貝/pL。檢測時(shí)加入各濃度質(zhì)粒2uL，每個(gè)反應(yīng)中對應(yīng)含有10，考貝/uL、1(f拷貝/uL、104考貝/yL、10拷貝/yL、l拷貝"L的質(zhì)粒樣本。二、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測分別對上述各濃度的質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2wL步驟一得到0.5X101拷貝/yL的質(zhì)粒樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X103拷貝/uL質(zhì)粒樣本，做為檢測組2;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X102拷貝/nL質(zhì)粒樣本，做為檢測組3;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到5拷貝/wL質(zhì)粒樣本，做為檢測組4;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5拷貝/uL質(zhì)粒樣本，做為檢測組5;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2ixL豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA，做為陽性對照組；在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65'C放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。檢測組l的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3yL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。檢測組1的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，可檢測出6-10個(gè)拷貝的目的DNA。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用<130>CGGNARY81462<160>7〈210〉1〈211〉886<212>DNA〈213〉豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcinerespiratoryandreproductivesyndromevirus)〈400〉13tggggtcgtccttagatgacttctgtcatctccacaaaaggtgcttttg60gcgttttctattacctacacgCC3gtg3tgatatatgccctaaaggtgagtcgcggccga120ctgctagggcttctgcaccttttgatcttcctgaattgtgctttcaccttcgggtacatg180actttcgcgcact"t"tcagagtaca^t3aggtcgcgctcsctatgggagcagtagttgca240ctcctttggggggtgtactcagccatagaaacctggaaMtcatcacctccagatgccgt300ttgtgcttgctaggccgcaagtacattxtggcccctgcccaccacgttgaaagtgccgca360cggtttcatxcgattgcggcaaatgataaccacgcatttgtcgtccggcgtcccggctcc420actacggtcaacggcacattggtgcccgggtcgtgttgggtggcagaaaa480gctgttaaac鄉(xiāng)gagtgg"taaaccttgtcaaatatgccaaata_aca_acggcaagcagca540ga卿gaaaggccagccagtcaatcagctgtgccagatgctgggta卿t600catcgctc已gCC已gSLggC肌gggaccggga660cccggagaagccccattttcctctagcgactgaagatgatgtc3gacatcactttacccc720bgtg鄉(xiāng)ggcaattgtgtctgtcgtcaatccagaccgcctttaMcaaggcgctgggac780ttgcaccctgtcagattcagttacactgtggagtttagtttgcctacgca840tcatactgtgcgcctgatccgcgtcacagcatcaccctcagcatga886<210>2〈211〉20<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉2gggggtgtactcagccatag20<210〉3〈211〉18〈212〉靈<213〉人工序列<400〉3acgaggctttttaacccg18<210〉4<211〉43<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉4cactttcaacgtggtgggcattttcctccagatgccgtttgtg43〈210〉5<211〉45〈212〉腿〈213〉人工序列<400>5ggtttcatccgattgcggcaaattttaatgtgccgttgaccgtag45<210>6<211〉22<212〉DNA〈213〉人工序列<■〉6ccagaatgtacttgcggcctag22〈210〉7〈211〉19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉7atttgtcgtccggcgtccc19權(quán)利要求1、一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒，包括三對引物，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的環(huán)形引物對。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照；所述陽性對照為豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392的RNA。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HCl、KC1、(NH4)2S04、T戮n20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對、所述外側(cè)引物對及所述環(huán)形引物對，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HC10.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25ymol、Tween200.025iiL、MgS040.2-20umo1、甜菜堿20umo1、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04-0.06umol，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.004-0.008umol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0.02-0.04ymol;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述MgS04優(yōu)選0.2iimo1，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.04txmo1，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.004timol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.02ymol。6、如權(quán)利要求1至5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括熒光顯色劑。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGREENI。8、如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。9、一種檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，是用權(quán)利要求1至8中任一所述的試劑盒對來自死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-90"C反應(yīng)2-10分鐘的步驟。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對引物，即與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberU87392中MN基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對、外側(cè)引物對和環(huán)形引物對。試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照、和熒光顯色劑，陽性對照為豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法。本發(fā)明的試劑盒，檢測靈敏度高，6-10個(gè)拷貝即可檢測出目的RNA，操作簡單方便，特別適于基層現(xiàn)場進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測及食品中可能污染的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測。文檔編號C12Q1/70GK101343672SQ200810116339公開日2009年1月14日申請日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者吳文學(xué),張躍偉,李佳禾,李旭妮申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)