專利名稱：：利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的合成方法，該方法利用了家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：目前，已廣泛利用基因重組技術(shù)并使用酵母活細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)(下文中往往稱為"細(xì)胞系統(tǒng)")作為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。但是，活細(xì)胞由于其功能保留而表現(xiàn)出外源蛋白質(zhì)消失的傾向，并且由于活細(xì)胞中細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的表達(dá)阻止了細(xì)胞生長而存在許多不能被容易表達(dá)的蛋白質(zhì)。而體外表達(dá)系統(tǒng)相對而言沒有上述細(xì)胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成上的限制，并能在不傷害生物體的情況下合成蛋白質(zhì)。另外由于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不伴有培養(yǎng)等操作，因而與細(xì)胞系統(tǒng)相比，可在短時(shí)間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。此外，由于體外表達(dá)系統(tǒng)還用來大規(guī)模生產(chǎn)由不被生物體利用的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，因而有望成為有前途的表達(dá)方法。家蠶(Bombyxmori)是一種具有強(qiáng)大泌絲能力的昆蟲。蠶絲蛋白由絲素(fibroin,Fib)禾卩絲膠(sericin，Ser)組成。絲素由重鏈(heavychain,fib-H)、輕鏈(lightchain,fib-L)和FhxPP25(fibrohexamerin)以摩爾比6:6:1組成。形成繭層的絲蛋白主要在家蠶幼蟲5齡中、后期合成。在短短的45天內(nèi)，后部絲腺每個(gè)細(xì)胞合成絲素約300"g，亦即2條后部絲腺(大約1000多個(gè)細(xì)胞)每小時(shí)合成絲素2mg左右，平均每秒鐘合成6X108絲素分子，比肝細(xì)胞合成血清白蛋白快60倍以上。如此高的蛋白合成強(qiáng)度，在其他動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是罕見的。因此，絲蛋白基因啟動(dòng)子是具有較強(qiáng)時(shí)空特異性和強(qiáng)大啟動(dòng)能力的天然啟動(dòng)子。家蠶絲素蛋白輕鏈基因fib-L具有在后部絲腺組織專一性、高效性表達(dá)的特點(diǎn)?？梢岳闷鋯?dòng)子構(gòu)建能夠表達(dá)外源基因的絲腺生物工廠。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的一種利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，在家蠶后部絲腺組織提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；虿逵型庠椿虻膒UC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒或pUC19-FL-PolyA質(zhì)?；虿逵型庠椿虻膒UC19-FL-PolyA質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25。C29X:水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。所述家蠶后部絲腺組織提取液的制備方法包括(1)取四齡或五齡家蠶，將家蠶浸于75%乙醇中麻醉，解剖取出絲腺，置于0.9c/。的生理鹽水或PBS中，取后部絲腺，一80一6CTC保存；(2)取以上保存的后部絲腺，置于勻漿器中，加入生理鹽水或PBS，冰上勻漿；取勻漿液于1.5mlEP管中，2°C6°C，1000014000rpm離心1015min，取上清，重復(fù)三次，取上清，即為家蠶后部絲腺組織提取液。所述pUC19-FL-Po1yA質(zhì)粒的制備方法包括(1)以家蠶基因組DNA為模板，L-l和L-2為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L啟動(dòng)子序列，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后定向克隆至載體pUC19中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL;1l-1:5'-ccggaa/ttccgactcgccaagttacgtc-3';H_ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3'(2)以家蠶基因組DNA為模板，L-3和L-4為引物，PCR擴(kuò)增出fib-LpolyA(1)，經(jīng)SalI和Hindin雙酶切后定向克隆至pUQ9-FL中fib-L啟動(dòng)子下游，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-PolyA;L-3:5'_gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3';1v-4:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3'。所述pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒的制備方法包括(1)以家蠶基因組DNA為模板，L-l和L-2為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L啟動(dòng)子序列，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后定向克隆至載體pUC19中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL;L-l:5'-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3';L-2:5'-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc—3';(2)以家蠶基因組DNA為模板，以L-5和L-6為引物，PCR擴(kuò)增出fib-LpolyA(2);L-5:5'-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3';L-6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';(3)，以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，以L-7和L-8為引物，PCR擴(kuò)增GFP報(bào)告基因序列；L-7:5'-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3';L-8:5'-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3';(4)以fib-LpolyA(2)禾叩FP報(bào)告基因序列為模板，以L-7和L-6為引物，利用重疊PCR的方法擴(kuò)增出帶有fib-LpolyA(2)禾口GFP報(bào)告基因序列的片段，即GFP-PolyA，經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后定向克隆至重組質(zhì)粒pUC19-FL中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-PolyA，L-6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';L-7:5Lccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明是在25X:29'C條件下表達(dá)蛋白，低溫(常規(guī)是在37°C)條件有利于表達(dá)蛋白以溶解狀態(tài)生成，減少包含體的形成，利于蛋白的分離純化。同時(shí)，本發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時(shí)間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。圖1、本發(fā)明的實(shí)施例的重組質(zhì)粒pUC19-FL-PolyA;圖2、本發(fā)明的實(shí)施例的重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-PolyA;圖3、本發(fā)明的實(shí)施例的檢測蛋白表達(dá)的電泳圖中M，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1，0小時(shí)取樣；2，3小時(shí)取樣；3，6小時(shí)取樣；4，12小時(shí)取樣；5，18小時(shí)取樣。具體實(shí)施例方式本發(fā)明選取四齡或五齡時(shí)期的家蠶，解剖獲得家蠶后部絲腺后，置于勻漿器中，加入適量生理鹽水或PBS，冰上勻漿，離心獲得上清液，即為家蠶后部絲腺提取液。將家蠶后部絲腺提取液在25。C29。C水浴中孵育，分0，3h，6h，12h，18h，24h取樣，用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定此系統(tǒng)是否具有合成蛋白的能力。重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pUC19-FL-PolyA以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，L-1和L-2為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L啟動(dòng)子序列(約605bp)，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后定向克隆至載體pUC19(promega公司)中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL。同樣以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，L-3和L-4為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L的polyA加尾信號(約286bp)，經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L啟動(dòng)子下游，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-PolyA(圖1)。2、重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-PolyA以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，以L-5和L-6為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L的polyA加尾信號序列(約286bp)，即fib-LpolyA(2);以質(zhì)粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)為模板，以L-7和L-8為引物，PCR擴(kuò)增GFP報(bào)告基因序列(約720bp)。隨后以fib-LpolyA(2)和GFP報(bào)告基因序列(GenbankM76430和GenbankU55762)為模板，以L-7和L-6為引物，利用重疊PCR的方法擴(kuò)增出帶有fib-LpolyA(2)禾卩GFP報(bào)告基因序列的融合序列GFP-PolyA，GFP-PolyA經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后定向克隆至重組質(zhì)粒pUC19-FL中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-PolyA(圖2)。利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白。反應(yīng)體系在家蠶后部絲腺組織提取液中加入pUC19-FL-PolyA重組質(zhì)?；騪UC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；虿逵型庠椿虻膒UC19-FL-PolyA重組質(zhì)?；騪UC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒，加入蛋白酶抑制劑，25。C29。C水浴，分0，3h，6h，12h，18h,24h取樣。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達(dá)。實(shí)施例一、家蠶絲腺的準(zhǔn)備取四齡或五齡家蠶，將家蠶浸于75%乙醇中麻醉30秒后取出，用大頭針固定家蠶頭部和尾部于臘盤上，腹面朝上，用解剖剪刀將其腹部剪開，把皮膚左右展開，用大頭針固定。用解剖攝鋏住直腸，一面向頭部方向提起，一面剪斷攀著的氣管和肌肉。除掉消化管后，這樣左右兩部的絲腺就露出來了，用鑷子將絲腺取出，置于0.9c/。的生理鹽水或PBS中。隨后用剪刀將前中部絲腺和后部絲腺分開。一7(TC保存?zhèn)溆?。二、家蠶后部絲腺提取液的制備取10條蠶的后部絲腺，置于勻漿器中，加入lml生理鹽水或PBS,冰上勻漿；吸取勻漿液于1.5mlEP管中，4°C，12000rpm離心10min，取上清，重復(fù)三次；吸取上清至新的1.5mlEP管中，用500ul管子分裝，每管50ul，即為家蠶后部絲腺提取液，即用或存放于液氮中。三、家蠶后部絲腺基因組DNA的提取從8條5齡幼蠶中取出后部絲腺，加液氮搗碎，力Q2mL上述所得的家蠶后部絲腺提取液(10mmol/LTris-HC1(pH8,0)，0.1mmol/LEDTA(pH8.0)，1%SDS，500mmol/LNaCl)，混勻后加蛋白酶K(promega)(使終濃度達(dá)250ug/mL),5(TC靜置1224h，加入等體積的酚，緩慢地來回顛倒10min，離心，取上清液，加RNA酶(sigma)，于37。C靜置30min;先后加入等體積的酚氯仿(1:1)和氯仿異戊醇各抽提l次，取上清液加2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，用細(xì)玻璃棒小心纏繞出DNA,70%乙醇洗1次，37。C干燥后，溶于TE緩沖液中。四、重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照GenBank中已公開的家蠶fib-L全序列(Genbank:M76430)，合成克隆啟動(dòng)子序列用的一對引物L(fēng)-1(5'-CCGGAATTCCGACTCGCCAAGTTACGTC-3'，下劃線表示EcoRI位點(diǎn))L-2(5'-GGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGTGGTCTGTTATGTGACC-3含BamHI位點(diǎn))；合成克隆fib-LpolyA加尾信號序列用的兩對PCR引物L(fēng)-3(5'-GCGGTCGACCTGCAGGCATGCCAAATTGTGTTTGCGTTAGG-3'，含SalI位點(diǎn))L-4(5'-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3'，含HindIII位點(diǎn))L-5(5'-GAGCTGTACAAGTAACAAATTGTGTTTGCG-3')L-6(5'-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3'，含HindIII位點(diǎn))。參照質(zhì)粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)序列，合成克隆綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)報(bào)告基因用的一對PCR引物L(fēng)-7(5'-CCGGTCGACCTGCAGGCATGCATGGTGAGCAAGGGC-3'，含SalI位點(diǎn))L-8(5'-CGCAAACACAATTTGTTACTTGTACAGCTC-3')。1、fib-L啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，68。C復(fù)性延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，68。C延伸5min。在一個(gè)無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mmolMgC128(^12.5mmoldNTPs8|ilL-lL-2l^il模板KOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)ljil加無菌雙蒸水至100pl，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段。2、fib-L的polyA加尾信號序列(l)的擴(kuò)增以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94"C預(yù)變性3min，94。C變性30s，68。C復(fù)性延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，68。C延伸5min。在一個(gè)無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mmolMgC128^12.5mmoldNTPs8ji1L-3L-4模板41KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)l卩l(xiāng)加無菌雙蒸水至10(V1，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段，獲得fib-LpolyA(l)。3、fib-L的polyA加尾信號序列(2)的擴(kuò)增以家蠶基因組DNA(GenbankM76430)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，68。C復(fù)性延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，68。C延伸5min。在一個(gè)無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mtno1MgC128|il2.5mmoldNTPs8^1L-5L-6模板KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)l^il加無菌雙蒸水至100^a，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段。該目的片段可作為模板fib-LpolyA(2)用于后續(xù)實(shí)以質(zhì)粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性3min,94。C變性30s，68。C復(fù)性延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，68。C延伸5min。在一個(gè)無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10|il25mmolMgC128(il2.5mmoldNTPs8[dL-7ljilL-8l^il模板1^1KOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)加無菌雙蒸水至10(HU，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段。該目的片段可作為模板GFP用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5、fib-LpolyA(2)和GFP報(bào)告基因序列的融合，構(gòu)建GFP-PolyAPCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，68。C復(fù)性延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，68""C延伸5min。在一個(gè)無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10|il25mmolMgCl28(il2,5,1dNTPs8(ilL-7L-6模板fib-LpolyA(2)1^1模板GFP(獲自前面步驟4)l^ilKOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)lpl加無菌雙蒸水至lOOiil，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段。因?yàn)镚FP報(bào)告基因的下游引物L(fēng)-8設(shè)計(jì)時(shí)加入了fib-L的polyA(2)加尾信號序列5'端的部分序列，所以PCR擴(kuò)增出的GFP報(bào)告基因的3'端序列與fib-L的polyA加尾信號序列5'端序列存在重疊，fib-L的polyA加尾信號序列的下游引物L(fēng)-5設(shè)計(jì)時(shí)加入了GFP報(bào)告基因5'端的部分序列，所以PCR擴(kuò)增出的fib-L的polyA加尾信號序列的3'端序列與GFP報(bào)告基因的5'端序列存在重疊，利用PCR方法就可以擴(kuò)增出fib-L的polyA加尾信號序列和GFP報(bào)告基因的融合序列，構(gòu)建得GFP-PolyA。6、重組質(zhì)粒pUC19-FL的構(gòu)建將步驟l中PCR擴(kuò)增出的fib-L啟動(dòng)子序列片段連接到質(zhì)粒pUC19(TAKARA，寶生物)上。先分別對fib-L啟動(dòng)子序列片段和質(zhì)粒pUC19進(jìn)行^^a、AaMH雙酶切，37'C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。在一個(gè)無菌的0.2ml離心管中，混合下列成分fib-L啟動(dòng)子序列片段2pl質(zhì)粒pUC190.5pl2xRapidLigationbuffer5^1T4DNAligase(購自promage公司)1^1加無菌雙蒸水至1(V1，混勻。25。C反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全正確。7、重組質(zhì)粒pUC19-FL-PolyA的構(gòu)建分別對fib-LpolyA(l)和質(zhì)粒pUC19—FL進(jìn)行6kZI、歷7dll雙酶切，37°C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。將PCR擴(kuò)增出的polyA加尾信號序列連接到質(zhì)粒pUC19-FL上。在一個(gè)無菌的0.2ml離心管中，混合下列成分fib-LpolyA(l)2^1質(zhì)粒pUC19-FL0.5^12xRapidLigationbuffer5jilT4腿ligase(購自promage公司)加無菌雙蒸水至10pl，混勻。25。C反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全正確。8、重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-PolyA的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增出的融合片段GFP-PolyA連接到質(zhì)粒pUC19-FL上。分別對質(zhì)粒pUC19—FL和融合片段GFP-PolyA進(jìn)行6^TI、歷'/7oIII雙酶切，37'C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。在一個(gè)無菌的0.2ml離心管中，混合下列成分融合片段GFP-PolyA2jil質(zhì)粒pUC19-FL0.5^12xRapidLigationbuffer5(ilT4DNAligase(購自promage公司)l^il加無菌雙蒸水至10)al，混勻。25。C反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全正確。9、外源基因插入載體pUC19-FL-Po1yA或pUC19-FL-GFP-Po1yA將目的基因擴(kuò)增出來，同時(shí)在目的基因的兩端加入酶切位點(diǎn)("s/dn、Wsl、^TI三者任選兩個(gè))，再同時(shí)對目的基因和載體(pUC19-FL-PolyA或pUC19-FL-GFP-PolyA)進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，在T4連接酶的作用下即可將目的基因連接到載體中。五、利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法在裝有50ul家蠶后部絲腺組織提取液的離心管中加入約lngpUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒(或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；虿迦胪庠椿虻膒UC19-FL-PolyA重組質(zhì)粒)及蛋白酶抑制劑，25"C—29"C水浴，分0，3h，6h，12h，18h，24h取樣檢測蛋白的表達(dá)。見圖3，3小時(shí)就有蛋白表達(dá)，6小時(shí)最佳，18小時(shí)后蛋白表達(dá)明顯降低，有可能是表達(dá)的蛋白降解。六、表達(dá)產(chǎn)物的檢測電泳法(見《分子克隆》)檢測蛋白的表達(dá)。電泳結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察，在488nm激發(fā)波長下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。如果所用的載體為帶有外源目的基因的pUC19-FL-PolyA重組質(zhì)粒，則采用考染法觀測目的蛋白的表達(dá)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于在家蠶后部絲腺組織提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；騪UC19-FL-PolyA質(zhì)粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述家蠶后部絲腺組織提取液的制備方法包括(1)取四齡或五齡家蠶，將家蠶浸于75%乙醇中麻醉，解剖取出絲腺，置于0.9c/。的生理鹽水或PBS中，取后部絲腺，一80一6CTC保存；(2)取以上保存的后部絲腺，置于勻漿器中，加入生理鹽水或PBS，冰上勻漿；取勻槳液于1.5mlEP管中，2。C6。C，1000014000rpm離心1015min，取上清，重復(fù)三次，取上清，即為家蠶后部絲腺組織提取液。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述pUC19-FL-PolyA質(zhì)粒的制備方法包括(1)以家蠶基因組DNA為模板，L-1和L-2為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L啟動(dòng)子序列，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后定向克隆至載體pUC19中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL;L-1:5'_ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3';L-2:5'_ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3';(2)以家蠶基因組DNA為模板，L-3和L-4為引物，PCR擴(kuò)增出fib-LpolyA(1)，經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L啟動(dòng)子下游，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-Po1yA;5'—gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3';卜4:5'_gccaa_gcttcactgtccaatccaccgtc_3'。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)粒的制備方法包括(1)以家蠶基因組DNA為模板，L-l和L-2為引物，PCR擴(kuò)增出fib-L啟動(dòng)子序列，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后定向克隆至載體pUC19中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL;L—1:5'-ccggaattccgactcgccaagttacgtc—3';H5'-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3';(2)以家蠶基因組DNA為模板，以L-5和L-6為引物，PC財(cái)廣增出fib-LpolyA(2);5'-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3';L—6:5'-gccaagcttxactgtccaatccaccgtx—3';(3)，以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，以L-7和L-8為引物，PCR擴(kuò)增GFP報(bào)告基因序列；7-5'-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3';L—8:5'—cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc—3';(4)以fib-LpolyA(2)和GFP報(bào)告基因序列為模板，以L-7和L-6為引物，利用重疊PCR的方法擴(kuò)增出帶有fib-LpolyA(2)禾BGFP報(bào)告基因序列的片段，即GFP-PolyA，經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后定向克隆至重組質(zhì)粒pUC19-FL中，獲得重組質(zhì)粒pUC19-FL-GFP-Po1yA，L—6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';7:5'—ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用家蠶后部絲腺體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，在家蠶后部絲腺組織提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；虿逵型庠椿虻膒UC19-FL-GFP-PolyA重組質(zhì)?；騪UC19-FL-PolyA質(zhì)?；虿逵型庠椿虻膒UC19-FL-PolyA質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明是在25℃～29℃條件下表達(dá)蛋白，低溫(常規(guī)是在37℃)條件有利于表達(dá)蛋白以溶解狀態(tài)生成，減少包含體的形成，利于蛋白的分離純化。同時(shí)，本發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時(shí)間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。文檔編號C12N15/79GK101358196SQ20081012047公開日2009年2月4日申請日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者呂正兵,夏佳音,張耀洲,清盛,聶作明,健陳,琴陳申請人:浙江理工大學(xué)