專利名稱：用蠶表達人β干擾素制備藥物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組生產人β干擾素的方法，更具體地講，本發(fā)明涉及含有人β干擾素基因的重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲和蛹生產人β干擾素的方法，本發(fā)明還涉及用表達人β干擾素的家蠶制備藥物的方法。
本發(fā)明提供了含有人β干擾素基因的大腸桿菌質粒pUC-β，以中國人成纖維細胞總RNA為模板，通過RT-PCR技術擴增IFNβ基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1980，VOL77，4003)，在5’端引進BamHI酶切位點，在3’端引入PstI位點，PCR產物經Klenow酶補平克隆進入經Hind II酶切的pUC19位點，構建質粒pUC-β(

圖1)，經測序證明其核苷酸序列完全正確。
本發(fā)明還提供了含人β干擾素基因的桿狀病毒轉移質粒pBacIFN-β。將含有人β干擾素基因片段的質粒pUC-β經BamHI和PstI雙酶切后與經BamHI和PstI雙酶切的轉移載體pBacPAK-8(CLONTECH公司)連接，獲得的重組轉移載體質粒pBacIFN-β(圖2)。
本發(fā)明還提供了含人β干擾素基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacIFNβ。將重組轉移載體pBacIFN-β DNA與已線性化的病毒BmBacPAK6(經AocI酶切線性化)DNA由脂質體介導共轉染家蠶培養(yǎng)細胞，二者在細胞內可發(fā)生同源重組。待共轉染5～7天后出現(xiàn)明顯的病毒感染癥狀后，取上清進行噬斑篩選。再通過3輪的噬斑和DNA雜交斑篩選可獲得純化的重組病毒BmBacIFNβ(圖3)。該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為CGMCC NO0591。
本發(fā)明還提供了人β干擾素基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達產物。將重組桿狀病毒BmBacIFNβ感染BmN細胞進行病毒擴增，然后將擴增后的重組桿狀病毒BmBacIFNβ注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內，分別取24、48、72、96和120小時的家蠶淋巴血。經5000rpm 5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，取20ul進行12％的SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍R250染色，結果見圖4。
本發(fā)明還對含人β干擾素基因的表達產物進行了純化。用3萬頭五齡起蠶，每頭人工接種重組病毒使之發(fā)病，5天后收集蠶血清共2000ml，每瓶500ml貯存于-202。蠶血清先經5000rpm離心1小時，取上清在25000rpm離心30分鐘，經硫酸銨沉淀后上Sephadex G100柱分離，每次收集樣品均經ELISA測活，篩選活性峰，再經過HPLC陽離子交換柱，每次收集樣品均經ELISA測活，收集活性峰，經SDS-PAGE檢測純度為95％。
本發(fā)明還對人β干擾素基因的表達產物進行了生物活性的鑒定。用BmBacIFNβ感染家蠶培養(yǎng)細胞，于感染后不同時間微量細胞病變抑制染色法測培養(yǎng)上清中的IFNβ活性，在感染的第4天達到3.0×104IU/ml。用BmBacIFNβ穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時間收集蠶血淋巴，高速離心后測血淋巴中的IFNβ的活性，在感染的120小時血淋巴中的IFNβ活性達到5.2×105IU/ml，在感染120小時蛹血淋巴的IFNβ活性達到8.0×104IU/ml。
本發(fā)明還對用表達人β干擾素的家蠶幼蟲和蛹體制備的口服藥物進行了動物試驗。在家蠶幼蟲和蛹體表達人β干擾素，經過過濾(100KD超濾)，30000rmp離心后經冷凍干燥后，以家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。利用鴨乙型肝炎病毒試驗模型試驗動物為1日齡北京雛鴨，病毒為鴨乙型肝炎病毒陽性鴨血清。1日齡北京雛鴨(購自浙江省醫(yī)學院動物中心)取血留樣，靜脈感染病毒后第7天取血留樣，以200IU/kg、100IU/kg、50IU/kg3個劑量給藥10天，該病毒對照組，給生理鹽水。停藥后3天，取鴨血分離血清，收各組鴨感染前后和停藥后3天血清標準，測定DHBV DNA量，DHBsAg和DHBeAg的含量。結果表明，200IU/kg劑量的三個參數(shù)抑制率分別為78.8％、75.4％和71％.100IU/kg劑量三個參數(shù)抑制率分別為73％、65％、54％，50IU/kg劑量組三個參數(shù)抑制率分別為52％、38％和27％，表明家蠶表達的β干擾素口服藥物對乙型肝炎病毒具有顯著的抑制作用。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下與原核表達IFNβ在臨床應用中有種種不足(例如容易引起中和性抗體生成等)相比，在家蠶幼蟲和蠶蛹中的IFNβ具有更高的臨床應用價值；家蠶是可以無菌大規(guī)模飼養(yǎng)經濟昆蟲，可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)；蠶體中有多種天然蛋白質保護劑，對表達產物有保護作用，使基因表達產物十分穩(wěn)定；家蠶生產的蛋白可以制備成口服藥物，為患者解除了注射的痛苦和被感染的威脅。
實施例2、人β干擾素基因的家蠶桿狀病毒轉移質粒將含有人β干擾素基因片段的質粒pUC-β經BamHI和PstI雙酶切后與經BamHI和PstI雙酶切的轉移載體pBacPAK8(CLONTECH公司)連接，獲得的重組轉移載體質粒pBacIFN-β(圖2)。經酶切分析鑒定基因正確。實施例3、人β干擾素基因的重組桿狀病毒的獲得取5ul含人β干擾素基因的昆蟲桿狀病毒轉移質粒pBacIFN-β和6ul經AocI酶切線性化的修飾病毒BmBacPAK6(申請人自行構建)，加入100ul無血清的TC-100培養(yǎng)基混均。取6ul Dosper(寶靈曼公司)加入100ul無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBCOBRL公司)混均。將事先培養(yǎng)在35mm平皿中的Bm N細胞(浙江大學生物化學研究所保存株)用無血清的TC-100培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入pBacIFN-β轉移質粒和Dosper混合物，27℃培養(yǎng)4-5天，收取上清進行第一輪噬斑篩選。取5ul上清感染35mm平皿中的Bm N細胞，1小時后棄去上清加入等量混合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點瓊脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染Bm N細胞3-4天，保存上清，細胞用NaOH裂解用于Southern blot斑點雜交，以β干擾素基因作模板用隨機引物探針標記試劑盒(寶靈曼公司)標記探針，雜交方法按照《分子克隆》(科學出版社，1995)所述進行。取陽性克隆的上清進行第二輪噬斑篩選(見圖3)。取陽性克隆的上清感染家蠶細胞擴增。即可得到大量的含人β干擾素基因的重組桿狀病毒。該病毒能感染家蠶細胞，在顯微鏡下細胞呈發(fā)病狀，可用Southern blot斑點雜交檢定，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為CGMCC NO0591。實施例4、人β干擾素基因在家蠶幼蟲和蛹中的表達取擴增的含人β干擾素基因的重組桿狀病毒注射到五齡家蠶(Bombyx mori)幼蟲中，每頭注射2ul左右(滴度為1×107/ml)，分別取24、48、72、96和120小時表達的家蠶淋巴血。高速離心后的上清用PBS pH7.4稀釋10倍后，加入等體積的2×蛋白質上樣緩沖液(100Mm Tris.HCl，4％ SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，取20ul進行SDS-PAGE分析。結果表明，重組病毒已不再表達β-半乳糖苷酶，原病毒BmBacPAK多角體蛋白啟動子控制下的這個基因已被IFNβ基因取代(圖4)，表達出人β干擾素，大小與天然人β干擾素一致。實施例5、蠶表達的人β干擾素的生物活性測定測活方法采用微量細胞病變抑制染色法。在96孔板各孔種入3×104個人羊膜WISH細胞(中國生物制品檢定所)，37℃，5％CO2培養(yǎng)3～12個小時使貼壁長成單層細胞；干擾素樣品用維持培養(yǎng)基(DMNM，2％FBS，均為GIBCOBRL公司產品)梯度稀釋，倍比稀釋制備12個稀釋度；WISH細胞96孔板棄上清，加入各個稀釋度的干擾素樣品和對照樣品(寶靈曼公司)，重復3～4孔，同時設不加IFNβ和VSV(水泡性口炎病毒，購自中國生物制品檢定所)的正常WISH細胞對照和不加IFNβ只加VSV的病毒對照各兩孔；37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時；96孔板去上清，用PBS洗1～3次，加入稀釋的VSV懸液(50～100TCID50)，正常WISH細胞對照不加VSV，繼續(xù)37℃/5％CO2培養(yǎng)24～48小時；當VSV對照出現(xiàn)75～100％病變而正常WISH對照生長正常時讀結果，用染色法；去96孔板各孔上清，用PBS洗1～2次，每孔加入50μl 0.005％(W/V)的中性紅溶液，37℃，5％CO2孵育3小時染色；去掉各孔染色液，用PBS洗3次，去掉浮色；各孔加入50μl脫色液，室溫作用10分鐘；干擾素效價計算，采用直接插入法計算，干擾素濃度的對數(shù)和吸光度值(OD)間的劑量反應曲線一般呈“S”形，干擾素保護終點的OD(ODt)介于細胞對照(ODC)和病毒對照OD(ODr)之間，則ODt=ODc+ODv2]]>將在ODt上位的OD值記為ODh，其下位孔記為ODL，上位孔的稀釋記為Dh，干擾素效價記為IFNu，則計算公式如下log2IFNu=ODh-ODtODh-ODL+log21Dh]]>
干擾素單位的校正干擾素對照品的單位為A1；同一塊96孔板上干擾素對照品測出的單位為A2；干擾素樣品的校正單位X2；則樣品干擾素的校正單位X1為X＝A1X2/A2用BmBacIFNβ感染家蠶培養(yǎng)細胞，于感染后不同時間測培養(yǎng)上清中的IFN活性，在感染的第4天達到3.0×104IU/ml。用BmBacIFNβ穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時間收集蠶血淋巴，高速離心后測血淋巴中的IFN的活性，在感染的120小時血淋巴中的IFNβ活性達到5.2×105IU/ml，在感染120小時蛹血淋巴的IFNβ活性達到8.0×104IU/ml。實施例6、用表達人β干擾素的家蠶幼蟲和蛹體制備的口服藥物的動物試驗。在家蠶幼蟲和蛹體(申請人自行飼養(yǎng))表達人β干擾素，經過過濾(100KD超濾)，30000rmp離心后經冷凍干燥后，以家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。利用鴨乙型肝炎病毒試驗模型試驗動物為1日齡北京雛鴨，病毒為鴨乙型肝炎病毒陽性鴨血清。1日齡北京雛鴨(購自浙江省醫(yī)學院動物中心)取血留樣，靜脈感染病毒后第7天取血留樣，用上述方法制成的口服藥物以200IU/kg、100IU/kg、50IU/kg3個劑量給藥10天，該病毒對照組，給生理鹽水。停藥后3天，取鴨血分離血清，收各組鴨感染前后和停藥后3天血清標準，測定DHBV DNA量，DHBsAg和DHBeAg的含量。結果表明，200IU/kg劑量的三個參數(shù)抑制率分別為78.8％、75.4％和71％.100IU/kg劑量三個參數(shù)抑制率分別為73％、65％、54％，50IU/kg劑量組三個參數(shù)抑制率分別為52％、38％和27％，表明家蠶表達的β干擾素口服藥物對乙型肝炎病毒具有顯著的抑制作用。
權利要求
1.一種用蠶表達人β干擾素制備藥物的方法其中所述的人的干擾素β通過用含有人干擾素β基因的重組家蠶桿狀病毒(Bombyx mori Nuclearpolyhedrosis Virus)感染家蠶幼蟲或蛹表達產生，所述的含有人干擾素β基因的重組家蠶桿狀病毒為BmBacIFNβ，它以保藏編號CGMCC NO0591藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法其中還包括分離，純化家蠶表達的人干擾素β的步驟。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法其中還包括冷凍干燥家蠶表達的人干擾素β的步驟。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法其中還包括以家蠶為填充劑配制口服藥物的步驟。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法其中還包括將表達人β干擾素的家蠶和蛹經冷凍干燥后制成口服藥物的步驟。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法其中BmBacINFβ是用圖2所示的質粒pBacINF-β和經AocI酶線性化的病毒BmBacPAK 6共轉染BmN細胞獲得的。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的人β干擾素基因的桿狀病毒轉移質粒pBacIFN-β的構建是通過RT-PCR方法合成的人β干擾素基因片段，克隆進入經Hind II酶切的pUC19位點，將人β干擾素基因片段克隆進入轉移載體pBacPAK-8中，獲得的重組轉移載體質粒pBacIFN-β。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中重組轉移載體pBacIFN-β DNA與已線性化的病毒BmBacPAK6 DNA由脂質體介導共轉染家蠶培養(yǎng)細胞，再通過3輪的噬斑和Southern雜交斑篩選獲得純化的重組病毒BmBacIFNβ。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的人β干擾素基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達產物是通過重組桿狀病毒BmBacIFNβ注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內表達產生。
全文摘要
本發(fā)明涉及用含有人β干擾素基因的重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲和蛹體生產人干擾素β的方法及由此制備的口服藥物。包括通過家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)重組人β干擾素基因，獲得重組病毒，將該重組病毒接種家蠶幼蟲、蛹進行表達，經分離純化，冷凍干燥制成口服藥物，經動物試驗表明該口服藥物對乙型肝炎病毒具有顯著的抑制作用。
文檔編號C12N15/866GK1405309SQ0112412
公開日2003年3月26日 申請日期2001年8月15日 優(yōu)先權日2001年8月15日
發(fā)明者張耀洲, 金勇豐, 吳祥甫 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司