專利名稱：一種陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非病毒基因載體的制備方法，尤其是制備陽(yáng)離子聚合物修飾的 納米磷酸鈣基因載體。
技術(shù)背景現(xiàn)代基因技術(shù)和人類基因組工程圖譜的完成，為采用基因分子生物學(xué)方法 治療各類疾病，提高人類生命質(zhì)量提供了廣闊的前景。由于裸露的核酸分子難 以在體液中穩(wěn)定存在，在主要器官中只能實(shí)現(xiàn)低層次的表達(dá)，尋求能夠?qū)崿F(xiàn)廣 泛基因表達(dá)的基因載體成為基因治療在大規(guī)模臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵問題。病毒載 體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但潛在的毒性、免疫原性及靶向性等問題限制了 其在臨床治療中的應(yīng)用。開發(fā)具有高效安全和組織特異性的非病毒基因載體具 有非常重要的意義。磷酸鈣是機(jī)體的天然成分，具有良好的組織相容性和吸收性，易被細(xì)胞胞 飲吸收，無毒副作用等特點(diǎn)，因此是一種優(yōu)良的基因載體。目前，磷酸鈣基因載體通常采用共沉淀法制備，這種方法使得DNA大部分被包裹在CaP內(nèi)，能夠 得到比較好的保護(hù)而不被降解。但采用上述共沉淀法制備的磷酸鈣基因載體的 尺寸不穩(wěn)定，接近微米水平，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除出體內(nèi)，使轉(zhuǎn)染率明顯降 低。如何制備納米尺寸的磷酸鈣基因載體成為研究的熱點(diǎn)問題之一。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備 方法，以獲得尺寸穩(wěn)定、高效轉(zhuǎn)染的納米磷酸鈣基因載體。本發(fā)明的制備陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的方法，其步驟如下(1) 配置濃度為3 8 mmol/L的氯化鈣水溶液；(2) 配制濃度為2 5 mmol/L的磷酸鈉水溶液；(3) 將等體積的氯化鈣水溶液和磷酸鈉水溶液鏇渦混合，加入質(zhì)粒DNA 水溶液，使質(zhì)粒DNA濃度達(dá)到50 80 y g/mL，獲得表面DNA穩(wěn)定的磷酸鈣納 米粒子水溶液；(4) 配置濃度為0.1 lmg/mL的陽(yáng)離子聚合物水溶液；(5) 取一定量步驟(4)的溶液加入到步驟(3)的溶液中，使陽(yáng)離子聚合 物分子含有的胺基與DNA分子含有的磷酸基團(tuán)的摩爾比為0.5 3，混合均勻，即可。上述的質(zhì)粒DNA為購(gòu)自clonetech公司的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP。 上述的陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚乙二醇一接枝一聚乙烯亞胺或聚乙二醇一接枝一聚賴氨酸。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，獲得的陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體，可有效誘導(dǎo)DNA分子的締合，具有高效無毒，良好生物相容性，尺寸穩(wěn)定，高效轉(zhuǎn)染的特性，是理想的基因傳輸載體之一。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:分別配置3 mmol/L的CaCb水溶液、2 mmol/L的Na3P04水溶液。將1 mL CaCl2水溶液加入到1 mLNa3P04水溶液中，劇烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其濃度達(dá)到50 u g/mL，混合均勻獲得殼層DNA穩(wěn)定的CaP納米粒子。加入 0.1mg/mL的聚乙烯亞胺(PEI)水溶液70yL,使N/P值達(dá)到0.5，混合，制備 PEI修飾的納米CaP基因載體。采用溴化乙啶排除法評(píng)價(jià)這種雜化CaP基因載 體的DNA締合特性，熒光光譜測(cè)定結(jié)果表明，少量PEI的加入能有效誘導(dǎo)DNA 分子的締合，保護(hù)DNA分子的生物活性，并顯示出良好的轉(zhuǎn)染特性。 實(shí)施例2:分別配置6 mmol/L的CaCl2水溶液、3.5 mmol/L的Na3P04水溶液。將1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，劇烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其濃度達(dá)到75ug/mL，混合均勻獲得殼層DNA穩(wěn)定的CaP納米粒子。加入 0.5mg/mL的聚乙二醇-接枝-聚乙烯亞胺(PEG-PEI)水溶液，使N/P值達(dá)到2， 獲得PEG-PEI修飾的納米CaP基因載體。光散射粒徑分布儀測(cè)定結(jié)果表明經(jīng) PEG-PEI修飾的納米磷酸鈣基因載體在生理鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性，并顯 示出良好的轉(zhuǎn)染特性。 實(shí)施例3:分別配置5 mmol/L的CaCl2水溶液、3 mmol/L的Na3P04水溶液。將1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，劇烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其濃度達(dá)到60 ii g/mL，混合均勻獲得殼層DNA穩(wěn)定的CaP納米粒子。加入 0.3 mg/mL的聚賴氨酸(PLL)水溶液，使N/P值達(dá)到1,獲得PLL修飾的納米 CaP基因載體?！?電位測(cè)定結(jié)果表明PLL的加入能有效誘導(dǎo)DNA分子的締合。分別配置8 mmol/L的CaCl2水溶液、5 mmol/L的Na3P04水溶液。將1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，劇烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其濃度達(dá)到80ug/mL,混合均勻獲得殼層DNA穩(wěn)定的CaP納米粒子。加入 lmg/mL的聚乙二醇-接枝-聚賴氨酸(PEG-PLL)水溶液，使N/P值達(dá)到3，獲 得PEG-PLL修飾的納米CaP基因載體。光散射粒徑分布儀測(cè)定結(jié)果表明經(jīng) PEG-PLL修飾的納米CaP基因載體在生理鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性，并顯示 出良好的轉(zhuǎn)染特性，是一種理想的納米磷酸鈣基因載體。
權(quán)利要求
1.一種陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備方法，其特征在于，它的步驟如下(1)配置濃度為3～8mmol/L的氯化鈣水溶液；(2)配制濃度為2～5mmol/L的磷酸鈉水溶液；(3)將等體積的氯化鈣水溶液和磷酸鈉水溶液漩渦混合，加入質(zhì)粒DNA水溶液，使質(zhì)粒DNA濃度達(dá)到50～80μg/mL，獲得表面DNA穩(wěn)定的磷酸鈣納米粒子水溶液；(4)配置濃度為0.1～1mg/mL的陽(yáng)離子聚合物水溶液；(5)取一定量步驟(4)的溶液加入到步驟(3)的溶液中，使陽(yáng)離子聚合物分子含有的胺基與DNA分子含有的磷酸基團(tuán)的摩爾比為0.5～3，混合均勻，即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備 方法，其特征在于所說的質(zhì)粒DNA為綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備 方法，其特征在于所說的陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚乙二醇一 接枝一聚乙烯亞胺或聚乙二醇一接枝一聚賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體的制備方法，步驟如下分別配置濃度為3～8mmol/l的氯化鈣水溶液和2～5mmol/l的磷酸鈉水溶液；將等體積的氯化鈣水溶液和磷酸鈉水溶液漩渦混合，加入質(zhì)粒DNA水溶液，獲得表面DNA穩(wěn)定的磷酸鈣納米粒子水溶液；配置濃度為0.1～1mg/ml的陽(yáng)離子聚合物水溶液，加入到表面DNA穩(wěn)定的磷酸鈣納米粒子水溶液中，使陽(yáng)離子聚合物分子含有的胺基與DNA分子含有的磷酸基團(tuán)的摩爾比為0.5～3，混合均勻，即可。本發(fā)明通過陽(yáng)離子聚合物修飾的納米磷酸鈣基因載體，可有效誘導(dǎo)DNA分子的締合，具有高效無毒，可生物降解，是理想的基因傳輸載體之一。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101402966SQ200810122110
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日
發(fā)明者徐志學(xué), 沈家驄, 王幽香, 胡巧玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)