專利名稱：一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的 方法。
背景技術(shù)：
近年來，以肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝或肝細(xì)胞移植成為目前肝衰竭 治療基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)；肝細(xì)胞是生物型人工肝的生物部分，起 著核心作用；由于原代人肝細(xì)胞因其同源性和良好細(xì)胞代謝等功能，可視為 生物型人工肝最理想的細(xì)胞材料；但是，由于肝臟來源的短缺、肝細(xì)胞無法 長期培養(yǎng)和體外增殖等問題是困擾人肝細(xì)胞作為生物型人工肝的細(xì)胞源的最 大障礙。
由于豬肝細(xì)胞與人肝細(xì)胞具有類似的大小、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，其代謝 功能和免疫功能與人肝細(xì)胞相比具有較高的相似性；因而，目前生物型人工 肝的基礎(chǔ)和臨床研究(文獻(xiàn):QianY， Lanjuan L， Jianrong H， et al. Study of severe hepatitis treated with a hybrid artificial liver support system. Int J Artif Organs, 2003; 26(6) :507-513)以及肝細(xì)胞移植(文 獻(xiàn)NagataH， Nishitai R， ShirotaC, et al. Prolonged survival of porcine h印atocytes in cynomolgus monkeys. Gastroenterology, 2007; 132(1) :321-329)也使用原代豬肝細(xì)胞作為肝細(xì)胞源，結(jié)果均顯示豬肝細(xì) 胞能夠明顯延長肝衰竭病人或動(dòng)物的生存時(shí)間和臨床癥狀等。
通過細(xì)胞永生化的技術(shù)，能夠獲得無限傳代、并具有原代肝細(xì)胞功能的 肝細(xì)胞系；已有研究報(bào)道將SV40大T抗原基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入到原 代豬肝細(xì)胞，建立了永生化豬肝細(xì)胞系(文獻(xiàn)潘小平，杜維波，郝邵瑞， 等。永生化豬肝細(xì)胞的建立及其鑒定。中華傳染病雜志，2008， 26 (7): 406-409);該永生化豬肝細(xì)胞系具有分泌白蛋白等原代豬肝細(xì)胞生物學(xué)特性 和功能，而且增殖能力強(qiáng)、無致瘤性，克服了原代豬肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)功
能維持時(shí)間短、培養(yǎng)條件要求高、難以傳代等缺點(diǎn)；
但是，要想真正實(shí)現(xiàn)永生化豬肝細(xì)胞來代替原代豬肝細(xì)胞在生物型人工 肝或肝細(xì)胞移植等方面的應(yīng)用，獲得足夠數(shù)量并具有高度活性和良好功能的 永生化豬肝細(xì)胞、以及解決異種肝細(xì)胞的免疫排斥問題是生物型人工肝或肝 細(xì)胞移植獲得成功的關(guān)鍵；因此，要想解決上述兩個(gè)問題，必須建立一種永 生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法。
細(xì)胞微囊化技術(shù)就是將細(xì)胞采用無毒性的高分子材料包裹，形成直徑為 數(shù)十微米甚至數(shù)百微米的微囊。微囊內(nèi)的細(xì)胞生存所需要的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、 代謝產(chǎn)物及其分泌的生物活性物質(zhì)能夠透過半透膜進(jìn)入微囊內(nèi)，而宿主免疫 細(xì)胞、免疫球蛋白、補(bǔ)體等則不能通過半透膜進(jìn)入微囊內(nèi)；總之，細(xì)胞微囊 化技術(shù)具有利于細(xì)胞大量生長的三維空間和具有避免細(xì)胞移植中的免疫排斥 反應(yīng)等作用；在細(xì)胞治療的基礎(chǔ)研究及臨床疾病的替代治療領(lǐng)域中，細(xì)胞微 囊技術(shù)均顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值(文獻(xiàn)0riveG， Herndndez賜，Gasc6n AR， et al. Cell encapsulation: promise and progress. Nat Med. 2003; 9(1):104-107; Dove A. Cell-based therapies go live. Nat Biotechnol. 2002:20(4) :339-343)。同樣，微囊化原代肝細(xì)胞在人工肝或肝細(xì)胞移植治療 肝衰竭動(dòng)物等方面也同樣取得了較大的進(jìn)步(文獻(xiàn)l: AokiT， JinZ， Nishino N， et al. Intmsplenic transplantation of encapsulated hepatocytes decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepatectomy in rats. Transplantation. 2005; 79(7):783-790;2:Dixit V， Gitnick G. The bioartificial liver: state-of-the-art. Eur J Surg Suppl. 1998 ;( 582) :71-76)。這樣，總結(jié) 已有的研究經(jīng)驗(yàn)，利用微囊化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，我們就可以實(shí)現(xiàn)永生化豬肝細(xì)胞 的高活性的大規(guī)模培養(yǎng)，微囊化后永生化豬肝細(xì)胞具有避免免疫排斥反應(yīng)的 作用。
與傳統(tǒng)靜止單層培養(yǎng)相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)能夠有效增加細(xì)胞培養(yǎng)的面積、 促進(jìn)細(xì)胞與氣體的交換次數(shù)，有利于細(xì)胞生長和收集，能大大提高細(xì)胞培養(yǎng) 的產(chǎn)量，是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥業(yè)小試、中試及批量生產(chǎn)的理想設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種永生化豬肝細(xì)胞大
規(guī)模培養(yǎng)的方法，包括以下步驟
(1) 將收集的永生化豬肝細(xì)胞接種至含有10%胎牛血清的180-250ml DMEM的Bellco轉(zhuǎn)瓶中，置于37。C、 5% C02的3L三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為1轉(zhuǎn)/分；待細(xì)胞長滿匯合后，永生化豬肝細(xì)胞經(jīng)過消化、收集、 離心、棄上清后，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞活率；用1.5-2. 0%濃度的海藻酸 鈉溶液調(diào)整永生化豬肝細(xì)胞的濃度為1-2.5X106個(gè)/mL，冰浴中備用；
(2) 在無菌環(huán)境下進(jìn)行，用步驟(1)中調(diào)整濃度后得到的永生化豬肝 細(xì)胞，采用一步法海藻酸-殼聚糖制備永生化豬肝細(xì)胞微囊；將永生化豬肝細(xì) 胞微囊轉(zhuǎn)移至Bellco轉(zhuǎn)瓶中，并加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液 180-250 ml，置于37。C、 5% C02的3L三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 l轉(zhuǎn)/分；每間隔2-4天，用100-200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾培養(yǎng)中的微囊細(xì)胞， 更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；直至培養(yǎng)14天后，收集微囊化永生化豬肝細(xì)胞。
步驟(1)中所述的收集的永生化豬肝細(xì)胞，是指在含有10%胎牛血清的 DMEM的兩個(gè)75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別接種1-5.0乂106個(gè)永生化豬肝細(xì)胞，置 于37'C、 5%<:02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿匯合后，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞， 將消化后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按l: 2傳代培養(yǎng)，經(jīng)過3-5天后；共收集4 瓶75ci^培養(yǎng)瓶中的永生化豬肝細(xì)胞。
步驟(1)中的消化、收集、離心、棄上清，制成細(xì)胞懸液，是指待細(xì)胞 長滿匯合后，PBS洗滌3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞至部 分脫落，總需3-5分鐘；然后加入70-100 ml含有10%胎牛血清的DMEM終止 消化，并經(jīng)過細(xì)胞收集、轉(zhuǎn)速為1000 rpm/min的離心5分鐘、棄上清后，將 永生化豬肝細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液。
步驟(2)中更換培養(yǎng)基，是指更換含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液 180-250 ml。
本發(fā)明還提供樂以上任一所述制備的一種微囊化永生化豬肝細(xì)胞。 本發(fā)明提供的微囊化永生化豬肝細(xì)胞，可作為肝細(xì)胞源應(yīng)用于生物型人 工肝或肝細(xì)胞移植。
本發(fā)明的具有以下有益效果本發(fā)明利用細(xì)胞微囊化技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)的各自優(yōu)點(diǎn)，將兩者相結(jié)合的方法來實(shí)現(xiàn)永生化豬肝細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)； 經(jīng)過微囊化技術(shù)和轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模培養(yǎng)后，能夠獲得足夠數(shù)量的微囊化永生化豬 肝細(xì)胞，每個(gè)Bellco轉(zhuǎn)瓶的永生化豬肝細(xì)胞經(jīng)微囊化轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后可達(dá)到2. 7 X 109-7. 5X 109個(gè)；所獲得的大量微囊化永生化豬肝細(xì)胞仍具有原代肝細(xì)胞的 生物學(xué)特性和功能，例如白蛋白合成、安定代謝、以及尿素合成等功能，該 微囊化永生化豬肝細(xì)胞可望用于生物型人工肝、異種肝細(xì)胞移植等方面的應(yīng) 用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方法對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
永生化豬肝細(xì)胞的獲得如文獻(xiàn)所述(文獻(xiàn)潘小平，杜維波，郝邵瑞，
等。永生化豬肝細(xì)胞的建立及其鑒定。中華傳染病雜志，2008， 26 (7): 406-409)。
一、 永生化豬肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率分析 在含有10%胎牛血清的DMEM的兩個(gè)75 cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別接種1-5.0
X 106個(gè)永生化豬肝細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中含有10-15ml的DMEM，然后置于37°C 、5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿匯合后，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將消化后的細(xì) 胞制成細(xì)胞懸液，按l: 2傳代培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天后；共收集4瓶75cm2 培養(yǎng)瓶中的永生化豬肝細(xì)胞，并將其接種至含有10%胎牛血清的DMEM (溶液 量為180-250ml)的Bellco轉(zhuǎn)瓶(美國Bellco公司)中，置于37°C、 5%C02 的新型3L三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)(美國Bellco公司)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速1轉(zhuǎn)/ 分鐘)。待細(xì)胞長滿匯合后，PBS洗滌3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn) 瓶中細(xì)胞至部分脫落，總需3-5分鐘；然后加入70-100 ml含有10%胎牛血清 的DMEM終止消化，并經(jīng)過細(xì)胞收集、離心5分鐘(轉(zhuǎn)速為1000 rpm/min)、 棄上清后，將永生化豬肝細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液，并經(jīng)臺盼藍(lán)(Sigma公司) 染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量和活率， 一個(gè)長滿永生化豬肝細(xì)胞的Bellco大轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞 總數(shù)可達(dá)1.5-2, 5X1()8個(gè)；用1.5-2.0%海藻酸鈉(美國Sigma公司)溶液調(diào) 整永生化豬肝細(xì)胞的濃度為1-2.5X107mL，冰浴中備用。以永生化豬肝細(xì)胞 的活率大于95%以上，作為細(xì)胞活率的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并方可進(jìn)一步試驗(yàn)。
二、 微囊化永生化豬肝細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
采用一步法海藻酸-殼聚糖(AC法)制備微囊化永生化豬肝細(xì)胞，整個(gè)過 程在百級實(shí)驗(yàn)室(無菌環(huán)境)進(jìn)行。其步驟包括
1、將經(jīng)高壓滅菌后的微囊發(fā)生器(瑞士， Nisco公司)按廠家要求說明
連接微囊發(fā)生器的各個(gè)部件，使儀器處于正?？纱脿顟B(tài)。
2、 調(diào)節(jié)微囊發(fā)生器參數(shù)，將上述步驟一所得的永生化豬肝細(xì)胞(永生化 豬肝的濃度為1-2.5X106個(gè)/mL)的海藻酸鈉溶液形成大小一致的小液滴，微 囊直徑控制在200-300um之間。
3、 將上述步驟2所得的海藻酸鈉溶液滴入到含有0. lmol/L CaCL2、 13 mmol/L HEPES (中文名4-羥乙基哌嗪乙磺酸)的0. 5%殼聚糖(濟(jì)南海得貝 海洋生物工程有限公司)溶液中，邊滴邊攪拌，并持續(xù)30分鐘。
4、 蔣步驟3后的微囊化永生化豬肝細(xì)胞再經(jīng)無血清的DMEM洗滌3-5遍。
5、 將步驟4后的微囊化永生化豬肝細(xì)胞移入Bellco轉(zhuǎn)瓶中，加入含有 10。/。胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液180-250 ml，置于37。C、 5%0)2的新型3乙三 層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速l轉(zhuǎn)/分鐘)。
6、 每間隔2-4天，用100-200目細(xì)胞篩網(wǎng)(瑞士Nisco公司)過濾培養(yǎng) 的微囊細(xì)胞，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)基含有10%胎牛血清的DMEM高 糖培養(yǎng)液180-250 ml);直至培養(yǎng)14天后，收集微囊化永生化豬肝細(xì)胞，此 時(shí)細(xì)胞增殖的倍數(shù)為18至30倍，即每個(gè)Bellco轉(zhuǎn)瓶的永生化豬肝細(xì)胞經(jīng)過 微囊化轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后可達(dá)到2. 7 X 109-7. 5 X 109。
7、 如果需要進(jìn)一步增加收獲的細(xì)胞數(shù)量，可以按照此方法擴(kuò)大Bellco 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的瓶數(shù)即可達(dá)到。
三、微囊化永生化豬肝細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量，以及功能分析
1) 、倒置相差顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察 永生化豬肝細(xì)胞在微囊內(nèi)的生長狀態(tài)是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)1天后，微囊內(nèi)永生
化豬肝細(xì)胞呈圓形， 一般單個(gè)、均勻分布；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)至7天后，囊內(nèi)細(xì)胞開
始聚集，出現(xiàn)大小不一的團(tuán)塊，細(xì)胞聚集體的個(gè)數(shù)達(dá)到6-10個(gè)；隨著培養(yǎng)時(shí)
間的延長，團(tuán)塊逐漸變大，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)至14天后，細(xì)胞聚集體的個(gè)數(shù)達(dá)到10-17 個(gè)。
2) 、微囊化永生化豬肝細(xì)胞的計(jì)數(shù)
將在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中微囊化永生化豬肝細(xì)胞，于一定時(shí)間培養(yǎng)后，取出部分 微囊，并機(jī)械破碎微囊，經(jīng)離心后獲得微囊內(nèi)的細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后顯微
鏡下觀察并計(jì)數(shù)，結(jié)果為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)1天后每個(gè)微囊內(nèi)細(xì)胞數(shù)為10-19個(gè)；
培養(yǎng)7天后每個(gè)微囊內(nèi)細(xì)胞數(shù)為63-136個(gè)；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)至14天后，細(xì)胞增殖 至生長平臺期，每個(gè)微囊內(nèi)細(xì)胞為198-385個(gè)。然而，微囊內(nèi)永生化豬肝細(xì)
3)、微囊化永生化豬肝細(xì)胞功能檢測
(1) 白蛋白含量采用美國Bethyl公司的酶連免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 試劑測定培養(yǎng)上清的豬白蛋白含量。按試劑盒說明書來操作(并參考文獻(xiàn) Dawei Yang， Toshie Koyama， Ai 0kamura, et al. Materials Science and Engineering: C. 2004; 24(3) :323-327)，其簡要步驟如下以抗豬白蛋白 抗體(美國Bethyl公司)(10ug/ml， 100ul/孔)4。C過夜包被96微孔板；經(jīng) 洗滌3遍后，每孔加入200ul封閉液37。C孵育30分鐘；經(jīng)洗滌3遍，每孔加 入100ul豬白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(美國Bethyl公司產(chǎn)品)(6. 25-400ng/ml)和微囊 化永生化豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，37'C水浴孵育1小時(shí)；洗滌5遍，然后加入辣 根過氧化物酶標(biāo)記抗豬白蛋白抗體(美國Bethyl公司)，37t:水浴孵育1小 時(shí)；洗滌5遍，每孔加入底物液(試劑盒自帶)100ul， 37。C水浴孵育10分 鐘；硫酸終止，450nm酶標(biāo)儀(美國伯樂BIO-RAD公司)讀取OD值。結(jié)果顯 示微囊化永生化豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清的豬白蛋白含量，隨著轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的天數(shù) 的增加，其白蛋白含量顯著地增加，并于微囊化永生化豬肝細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后 14天，上清的白蛋白含量達(dá)到高峰。
(2) 肝細(xì)胞的尿素合成功能采用美國Sigma-Aldrich公司試劑盒檢測 微囊化永生化豬肝細(xì)胞的尿素合成功能，按照試劑盒說明書來操作(參考文 獻(xiàn)Yin C， Mien Chia S， Hoon Quek C， et al. Microcapsules with improved mechanical stability for h印atocyte culture. Biomaterials, 2003; 24: 1771-1780)。結(jié)果顯示微囊內(nèi)永生化豬肝細(xì)胞顯示出良好的尿素合成功能， 隨著轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的天數(shù)的增加，其尿素氮含量顯著地增加，并于微囊化永生化 豬肝細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后14天，細(xì)胞上清的尿素氮含量達(dá)到高峰。
(3) 微囊化永生化豬肝細(xì)胞安定代謝功能檢測 微囊化永生化豬肝細(xì)胞安定代謝功能檢測如文獻(xiàn)所述(文獻(xiàn)王寧。
H印G2-GS-3A4細(xì)胞應(yīng)用于人工生物肝臟以增強(qiáng)安定與氨的代謝。中國醫(yī)科大 學(xué)，2004中國優(yōu)秀博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫)。每間隔48小時(shí)后，分別收集 經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后的微囊化永生化豬肝細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3-5遍，加 入含有50ug/L安定的無血清畫EM高糖培養(yǎng)液，37。C轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2小時(shí)后，取 上清用HPLC法測定安定濃度。結(jié)果顯示微囊化永生化豬肝細(xì)胞安定代謝功 能從2天起，安定轉(zhuǎn)化功能逐步增強(qiáng)，至12天達(dá)到高峰；然后，至14天時(shí)
安定轉(zhuǎn)化功能保持穩(wěn)定。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能 從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征依次包括以下步驟(1)將收集的永生化豬肝細(xì)胞接種至含有10％胎牛血清的180-250mlDMEM的Bellco轉(zhuǎn)瓶中，置于37℃、5％CO2的3L三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為1轉(zhuǎn)/分；待細(xì)胞長滿匯合后，永生化豬肝細(xì)胞經(jīng)過消化、收集、離心、棄上清后，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞活率；用1.5-2.0％濃度的海藻酸鈉溶液調(diào)整永生化豬肝細(xì)胞的濃度為1-2.5×106個(gè)/mL，冰浴中備用；(2)在無菌環(huán)境下進(jìn)行，用步驟(1)中調(diào)整濃度后得到的永生化豬肝細(xì)胞，采用一步法海藻酸-殼聚糖制備永生化豬肝細(xì)胞微囊；將永生化豬肝細(xì)胞微囊轉(zhuǎn)移至Bellco轉(zhuǎn)瓶中，并加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液180-250ml，置于37℃、5％CO2的3L三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為1轉(zhuǎn)/分；每間隔2-4天，用100-200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾培養(yǎng)中的微囊細(xì)胞，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；直至培養(yǎng)14天后，收集微囊化永生化豬肝細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在 于步驟(1)中所述的收集的永生化豬肝細(xì)胞，是指在含有10%胎牛血清的DMEM 的兩個(gè)75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別接種卜5.0X106個(gè)永生化豬肝細(xì)胞，置于37'C、 5°/￡02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿匯合后，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將消化后的 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按l: 2傳代培養(yǎng)，經(jīng)過3-5天后；共收集4瓶75cm2培養(yǎng)瓶 中的永生化豬肝細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在 于步驟(1)中的消化、收集、離心、棄上清，制成細(xì)胞懸液，是指待細(xì)胞長滿 匯合后，PBS洗滌3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞至部分脫落， 總需3-5分鐘；然后加入70-100ml含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，并經(jīng)過 細(xì)胞收集、轉(zhuǎn)速為1000rpm/min的離心5分鐘、棄上清后，將永生化豬肝細(xì)胞沉 淀制成細(xì)胞懸液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在 于步驟(2)中更換培養(yǎng)基，是指更換含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液180-250 ml。
5、 權(quán)利要求1至4中任一所述制備的一種微囊化永生化豬肝細(xì)胞。
6、 權(quán)利要求5所述的微囊化永生化豬肝細(xì)胞，可作為肝細(xì)胞源應(yīng)用于生物型人工肝或肝細(xì)胞移植。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種永生化豬肝細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，包括將收集的永生化豬肝細(xì)胞接種至轉(zhuǎn)瓶中，經(jīng)三層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，用1.5-2.0％濃度的海藻酸鈉溶液調(diào)整永生化豬肝細(xì)胞的濃度為1-2.5×10⁶個(gè)/mL；再調(diào)整濃度后得到的永生化豬肝細(xì)胞，采用一步法海藻酸-殼聚糖制備永生化豬肝細(xì)胞微囊；本發(fā)明還公開了一種微囊化永生化豬肝細(xì)胞。本發(fā)明提供的微囊化永生化豬肝細(xì)胞，可作為肝細(xì)胞源應(yīng)用于生物型人工肝或肝細(xì)胞移植，本發(fā)明制備出的抗HCMV gBn1抗體，其優(yōu)點(diǎn)為特異性強(qiáng)、靈敏度高。
文檔編號C12N5/06GK101392235SQ20081012199
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者呂國良, 喻成波, 李蘭娟, 杜維波, 潘小平, 章益民, 虞曉鵬 申請人:浙江大學(xué)