專利名稱：一種雙水相水解體系制備低聚木糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低聚木糖的制備方法，具體涉及一種將木聚糖酶水解的過程與雙水 相分離體系集成制備低聚木糖的方法。
技術(shù)背景天然纖維素資源是地球上最豐富的可再生有機物質(zhì)，在世界通過植物光合作用產(chǎn)生 的生物量高達1000億噸，其中只有11%用作農(nóng)作物產(chǎn)品、飼料、造紙及建筑材料等， 89%的天然纖維素資源則被自然界中的各種微生物降解，最終轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。雖 然這是自然界中重要的碳循環(huán)，但從原子經(jīng)濟角度來說，無疑是巨大的資源浪費。半纖 維素作為天然纖維素資源的重要組成部分之一，是除纖維素以外最為豐富、最廉價的可 再生資源。利用天然木質(zhì)纖維素為原材料，制備功能性低聚木糖產(chǎn)品具有廣闊的市場前 景和商業(yè)價值。低聚糖，又稱寡糖，是由2~10個單糖分子通過糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈的糖 類物質(zhì)，其分子量約為300~2000道爾頓。低聚木糖是由2~10個木糖分子通過p-l， 4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，又稱木寡糖。低聚木糖是功能性低聚糖家族中的一個重要成 員，其甜度低于蔗糖和葡萄糖，約為蔗糖的40%，與麥芽糖的甜度相當(dāng)。低聚木糖具有顯著的雙歧桿菌增殖能力，可使雙歧桿菌等有益菌群快速增殖，從而 抑制腸道內(nèi)有害菌群的生長；難于被消化吸收，不能被唾液、胰液、小腸絨毛腺均質(zhì)液 等分解；降低血清膽固醇和中性脂肪、防止老化和骨質(zhì)疏松癥，具有抗齲齒、防止便秘 的效果，有利于口腔健康、清除腸道內(nèi)毒素的特點；具有獨特的酸與熱穩(wěn)定性和難發(fā)酵 等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品等諸多領(lǐng)域。木聚糖是半纖維素的主要成分，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，是自然界中 最主要的可再生資源之一。木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由P-l,4-糖苷鍵相連的(3-D-吡喃型木糖殘基聚合而成，側(cè)鏈上連有多種不同大小短取代基。玉米芯、甘蔗渣、棉子 殼以及稻麥等的秸稈中富含木聚糖，例如玉米芯中含有高達40%的木聚糖，且這些原料 價廉易得，是制備低聚木糖的理想對象。雙水相生物催化技術(shù)的基本原理是利用兩種不同高聚物的水溶液或一種高聚物與 一種無機鹽的水溶液，由于其濃度的不同，而形成互相不溶的兩水相體系，調(diào)整其濃度 可將反應(yīng)物和生物催化劑分配于不同的水相中，有效地實現(xiàn)生化反應(yīng)與產(chǎn)物的反應(yīng)分離 耦合。當(dāng)生物大分子(如生物活性的酶分子)進入雙水相體系后，由于生物大分子的表面性質(zhì)、電荷作用和不同分子間作用力，以及不同環(huán)境因素的影響，使其在兩相間的分配 濃度不同，表現(xiàn)較大或較小的分配系數(shù)。在生物催化過程中，雙水相體系可以將反應(yīng)物、 產(chǎn)物以及酶分配于不同的水相中，最大限度地回收酶活力，同時提高催化反應(yīng)的效率， 簡化操作過程，能耗低，處理量大，降低投資和費用，更重要的是易于過程放大，特別 適合于工業(yè)化生物催化過程。低聚木糖的制備方法有酸水解法、蒸汽爆破法、酶水解法和微波降解法，酸水解 法、蒸汽爆破法與微波降解法等物理、化學(xué)方法，由于降解速度難以控制，精制過程繁 瑣，效率低等特點，不適合于低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn)。而酶水解法具有高效、條件溫和、 環(huán)境友好等優(yōu)點，已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖的主要制備方法。目前，國內(nèi)外主要采 用黑曲霉、里氏木霉、鏈霉菌等天然產(chǎn)木聚糖酶的菌種，進行酶水解制備低聚木糖，其 生物加工過程包括木聚糖的提取、木聚糖酶的制備、酶解木聚糖以及產(chǎn)品的精制等工藝。 雖然酶水解法具有明顯優(yōu)點，但也存在著木聚糖酶回收利用率低、工藝步驟較多以及生 物加工過程不易放大等問題。因此，提高木聚糖酶的回收利用率、降低低聚木糖的生產(chǎn) 成本以及簡化其規(guī)模放大過程就顯得尤為重要。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙水相生物催化體系制備低聚木糖的 生產(chǎn)方法，以提高木聚糖酶的回收利用率、降低低聚木糖的生產(chǎn)成本以及簡化其規(guī)模放 大過程。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下 一種雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，包括如下步驟(1) 在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸銨體系的雙水相系統(tǒng)，或聚乙二醇和葡聚糖 體系的雙水相系統(tǒng)；(2) 加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，使雙水相體系中木聚糖濃度達l~50g/L，木聚 糖酶的加入量為5 50IU/g木聚糖，在pH4.0 8.0， 30 60°C，攪拌轉(zhuǎn)速100 30"0 r/min下，酶水解反棄2 12小時；(3) 將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入分配槽，靜置成相后，下相經(jīng)截留分子量為1000 20000的超濾 膜分離，再經(jīng)截留^"子量為150 500的納濾膜分離得低聚木糖；回收下相經(jīng)超濾后的 截留物，與上相合并，轉(zhuǎn)入水解槽；(4) 對于原始聚乙二醇和硫酸銨體系的雙水相系統(tǒng)，在水解槽中，再加入硫酸銨， 形成雙水相體系，返回步驟(2);對于原始聚乙二醇和葡聚糖體系的雙水相系統(tǒng)，直接返 回步驟(2)。其中，雙水相系統(tǒng)中，聚乙二醇的成相濃度范圍重量百分比為1~50%，硫酸銨的成相濃度范圍重量百分比為5~50%，葡聚糖的成相濃度范圍重量百分比為5~50%。上述聚乙二醇的分子量范圍為1000~6000，葡聚糖的分子量范圍為10000~50000。 步驟(2)中，所述的粗木聚糖溶液采用如下方法制備將木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)經(jīng)干燥、粉碎后，在20 40'C下，邊加入堿溶液邊攪拌；然 后，在70 10(TC下蒸煮1 5小時；過濾除固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用強酸中和 至pH4.0~8.0;中和的蒸煮液采用超濾技術(shù)脫鹽，得到濃縮的粗木聚糖液。其中，所述 的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為玉米芯、秸桿、甘蔗渣、樺木或楊木；所述的堿溶液可以為 l~6mol/L的NaOH;所述的強酸為可以為l~6mol/L鹽酸。步驟(2)中，所述的木聚糖酶采用如下方法制備本發(fā)明所采用的木聚糖酶來源于重組畢赤酵母菌NL-OU，其制備方法為重組畢 赤酵母菌NL-OU經(jīng)平板活化后，接種單菌落于搖瓶培養(yǎng)基中，在20~40 °C 、 100~200 r/min 搖瓶培養(yǎng)12~72小時，至OD6oo達至lJ 2~10，得到種子液。將此種子液以5%~20%(v/v) 接種至滅菌的甘油培養(yǎng)基中，在20~40 °C， 400~800 r/min條件下，發(fā)酵培養(yǎng)約12-48 小時至溶解氧上升大于50%。向罐中流加甘油溶液，流速15~35 mL/(L七)持續(xù)10~28小 時，然后停止流加1 3小時，pH值控制在4.0 8.0左右，溫度維持2(K40'C。然后向罐 中流加甲醇，流速l 10mL/(L七)持續(xù)24 72小時，溫度維持204(TC，最后離心收集得 到木聚糖酶粗酶液。搖瓶培養(yǎng)基組成葡萄糖0.5% 5% (w/v)，蛋白胨1% 5% (w/v)， 酵母膏0.5% 5% (w/v)。 30% 70% (w/v)甘油培養(yǎng)基組成甘油30% 70% (w/v)， CaSCV2H20 0.1% 5%(w/v)， MgS04'7H20 0.5% 10%(w/v)， K2S04 0.5% 10%(w/v)， KOH 0.1% 5% (w/v)，氨水調(diào)pH值為4.0 8.0。雙水相體系的建立方法如下在室溫條件下，取一定量ly。 50。/。(w/w)濃度的聚乙二醇于lOmL刻度離心管中， 向刻度離心管中滴加5。/。 50。/。(w/w)濃度的硫酸銨或葡聚糖等溶液，在混合器上混勻， 至出現(xiàn)混濁，記下此時加入溶液的質(zhì)量。接著再逐滴加入去離子水，至混濁剛好消失時， 記下加入去離子水的質(zhì)量。算出聚乙二醇和硫酸銨或葡聚糖的百分含量，即為臨界點含 量。重復(fù)以上操作找出不同聚乙二醇濃度時的臨界點。繪制出聚乙二醇/硫酸銨體系或聚 乙二醇/葡聚糖體系的雙水相相圖。本發(fā)明雙水相水解制備低聚木糖的反應(yīng)器如圖1所示，該反應(yīng)器裝置及其工作原理 為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明將木聚糖酶水解制備低聚木糖的過程與雙水相體系合理地集成，不但提高了 木聚糖酶的回收利用率，而且簡化制備低聚木糖的工藝路線，降低了生產(chǎn)成本，為低聚 木糖的生產(chǎn)及規(guī)?；苽涮峁┝诵滤悸泛托鹿に嚒１景l(fā)明與文獻報道的低聚木糖制備或生產(chǎn)工藝相比，具有如下優(yōu)點1. 木聚糖酶利用率高。同時，由于聚乙二醇的存在，穩(wěn)定和提高了木聚糖酶的酶活力。2. 簡化酶水解過程，操作快速、方便。3. 雙水相成相迅速，易于規(guī)模放大。4. 以玉米芯、秸桿、甘蔗渣、樺木和楊木等農(nóng)林廢棄物為原料，降低了生產(chǎn)成本。


圖1是本發(fā)明的雙水相水解反應(yīng)器的示意圖。其中，1為水解槽，2為分配槽，3 為超濾膜組件。
具體實施例方式以下結(jié)合應(yīng)用實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施實例是為說明而非限制本發(fā) 明。本領(lǐng)域中任何普通技術(shù)人員能夠理解這些實施實例不以任何方式限制本發(fā)明，可做 適當(dāng)?shù)男薷亩贿`背本發(fā)明的實質(zhì)和偏離本發(fā)明的范圍。 實施例1:木聚糖酶的制備本發(fā)明所采用的木聚糖酶來源于重組畢赤酵母菌NL-OU (歐陽嘉，王向明，張清, 嚴(yán)明，許琳.里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在畢赤酵母中的分泌表達.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2007， 27 (5): 83-88)。其制備方法為重組畢赤酵母菌NL-OU經(jīng)平板活化后，接種單 菌落于50mL搖瓶培養(yǎng)基中，在30。C、 150 r/min搖瓶培養(yǎng)48小時，至00600達到2-6, 得到種子液。將此種子液以10。/。(v/v)接種至滅菌的甘油培養(yǎng)基中，在28°C， 600 r/min 條件下，發(fā)酵培養(yǎng)約20小時至溶解氧上升大于50%。向罐中流加甘油溶液，流速20 mL/(I/h)持續(xù)12小時，然后停止流加3小時，pH值控制在5.0左右，溫度維持28'C。 然后向罐中流加甲醇，流速3 mL/(L七)持續(xù)30小時，溫度維持28'C，最后離心收集得 到木聚糖酶粗酶液。搖瓶培養(yǎng)基組成葡萄糖1% (w/v)，蛋白胨1% (w/v)，酵母膏0.5% (w/v)。50。/。(w/v)甘油溶液組成甘油50%(w/v)， CaS04'2H20 0.1%(w/v)，MgSO4'7H2O 1% (w/v)， K2S041.5% (w/v)， KOHO.3% (w/v)，氨水調(diào)pH值為5.0。 實施例2:木聚糖的制備將玉米芯經(jīng)干燥、粉碎、過篩后得到lcm左右顆粒的原料。在25'C條件下，加入 氫氧化鈉和去離子水，邊加邊攪拌。然后，在9(TC條件下蒸煮3小時。過濾除固形物， 收集蒸煮液。蒸煮液采用強酸中和至pH5.0。中和的蒸煮液采用截留分子量為6000的超 濾膜除鹽，去除90%以上的無機鹽和低分子化合物，得到濃縮的粗木聚糖液。 實施例3:雙水相酶水解制備低聚木糖在雙水相水解反應(yīng)器的水解槽中，加入濃縮的粗木聚糖溶液200mL (木聚糖濃度為20g/L)，加入150g聚乙二醇2000和100g硫酸銨，補充去離子水至總體系重量為1000g。 聚乙二醇/硫酸銨體系中，聚乙二醇2000濃度為15%(w/w)，硫酸銨濃度為10%(w/w)。 經(jīng)過機械攪拌(150r/min)混勻后，加入200IU木聚糖酶粗酶液進行酶水解。在pH5.0， 溫度為50'C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下，酶水解反應(yīng)4小時。然后，將酶水解液轉(zhuǎn) 到雙水相水解反應(yīng)器的分配槽中，靜置60分鐘即可完成成相。下相水溶液相采用截留 分子量為2000的超濾膜分離出低聚木糖。同時，回收水相中殘留的木聚糖和聚乙二醇 2000，將回收的木聚糖和聚乙二醇2000與上相聚乙二醇2000相均泵入水解槽中，再加 入粗木聚糖溶液和硫酸銨，進行新一輪水解制備低聚木糖過程。對于超濾透過的低聚木 糖溶液中含有無機鹽成份，采用截留分子量為150的納濾膜除去95%無機鹽，濃縮低聚 木糖溶液。實施例4:雙水相酶水解制備低聚木糖在雙水相水解反應(yīng)器的水解槽中，加入濃縮的粗木聚糖溶液200mL (木聚糖濃度為 5g/L)，加入150g的聚乙二醇4000和110g硫酸銨，補充去離子水至總體系童量為1000g。 聚乙二醇順?biāo)徜@體系中，聚乙二醇4000濃度為15%(w/w)，硫酸銨濃度為ll%(w/w)。 經(jīng)過機械攪拌(150r/min)混勻后，加入20IU木聚糖酶粗酶液進行酶水解。在pH 5.0， 溫度為50'C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下，酶水解反應(yīng)4小時。然后，將酶水解液轉(zhuǎn) 到雙水相水解反應(yīng)器的分配槽中，靜置60分鐘即完成成相。下相水溶液相采用截留分 子量為2000的超濾膜分離出低聚木糖。同時，回收水相中殘留的木聚糖和聚乙二醇 4000，將回收的木聚糖和聚乙二醇4000與上相聚乙二醇4000相均泵入水解槽中，再加 入粗木聚糖溶液和硫酸銨，進行新一輪水解制備低聚木糖過程。對于超濾透過的低聚木 糖溶液中含有無機鹽成份，采用截留分子量為150的納濾膜除去95%無機鹽，同時得到 濃縮的低聚木糖溶液。 實施例5:雙水相酶水解制備低聚木糖在雙水相水解反應(yīng)器的水解槽中，加入濃縮的粗木聚糖溶液200mL (木聚糖濃度為 200g/L),加入120g的聚乙二醇2000和150g葡聚糖50000，補充去離子水至總體系重 量為1000g。聚乙二醇/葡聚糖體系中聚乙二醇2000濃度為12%(w/w)，葡聚糖濃度為 15%(W/w)。經(jīng)過機械攪拌(150r/min)混勻后，加入400IU木聚糖酶粗酶液進行酶水解。 在pH5.0，溫度為50'C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下，酶水解反應(yīng)4小時。然后，將 酶水解液轉(zhuǎn)到雙水相水解反應(yīng)器的分配槽中，靜置120分鐘即完成成相。下相葡聚糖相 采用截留分子量為2000的超濾膜分離出低聚木糖。同時，回收水相中殘留的木聚糖、 聚乙二醇2000和葡聚糖50000，將回收的木聚糖、聚乙二醇2000和葡聚糖50000與上 相聚乙二醇2000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液，進行新一輪水解制備低聚木糖過程。對于超濾透過的低聚木糖溶液，采用截留分子量為150的納濾膜濃縮，得低 聚木糖溶液。實施例6:雙水相酶水解制備低聚木糖在雙水相水解反應(yīng)器的水解槽中，加入濃縮的粗木聚糖溶液200mL (木聚糖濃度為 100g/L)，加入60g的聚乙二醇4000和180g葡聚糖20000，補充去離子水至總體系重量 為1000g。聚乙二醇/葡聚糖體系中，聚乙二醇4000濃度為6%(w/w)，葡聚糖20000濃 度為18%(w/w)。經(jīng)過機械攪拌(150r/min)混勻后，加入1000IU木聚糖酶粗酶液進行 酶水解。在pH5.0，溫度為50'C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下，酶水解反應(yīng)4小時。 然后，將酶水解液轉(zhuǎn)到雙水相水解反應(yīng)器的分配槽中，靜置120分鐘即可完成成相。下 相葡聚糖相采用截留分子量為2000的超濾膜分離出低聚木糖。同時，回收水相中殘留 的木聚糖、聚乙二醇4000和葡聚糖20000，將回收的木聚糖、聚乙二醇4000和葡聚糖 20000與上相聚乙二醇4000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液，進行新一輪水解 制備低聚木糖過程。對于超濾透過的低聚木糖溶液，采用截留分子量為150的納濾膜濃 縮，得低聚木糖溶液。
權(quán)利要求
1、一種雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸銨體系的雙水相系統(tǒng)，或聚乙二醇和葡聚糖體系的雙水相系統(tǒng)；(2)加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，使雙水相體系中木聚糖濃度達1～50g/L，木聚糖酶的加入量為5～50IU/g木聚糖，在pH4.0～8.0，30～60℃，攪拌轉(zhuǎn)速100～300r/min下，酶水解反應(yīng)2～12小時；(3)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入分配槽，靜置成相后，下相經(jīng)截留分子量為1000～20000的超濾膜分離，再經(jīng)截留分子量為150～500的納濾膜分離得低聚木糖；回收下相經(jīng)超濾后的截留物，與上相合并，轉(zhuǎn)入水解槽；(4)對于原始聚乙二醇和硫酸銨體系的雙水相系統(tǒng)，在水解槽中，再加入硫酸銨，形成雙水相體系，返回步驟(2)；對于原始聚乙二醇和葡聚糖體系的雙水相系統(tǒng)，直接返回步驟(2)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于形成 的雙水相體系中，聚乙二醇的成相濃度范圍重量百分比為1~50%，硫酸銨的成相濃度范 圍重量百分比為5~50%，葡聚糖的成相濃度范圍重量百分比為5~50%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于 聚乙二醇的分子量范圍為1000~6000。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于 葡聚糖的分子量范圍為10000~50000。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于步驟 (2)中所述的粗木聚糖溶液采用如下方法制備將木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)經(jīng)干燥、粉碎后， 在20 40'C下，邊加入堿溶液邊攪拌；然后，在70 100'C下蒸煮1 5小時；過濾除 固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用強酸中和至pH4.0 8.0;中和的蒸煮液采用超濾技術(shù) 脫鹽，得到濃縮的粗木聚糖液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，其特征在于所述 的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為玉米芯、秸桿、甘蔗渣、樺木或楊木。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙水相水解體系制備低聚木糖的方法，包括如下步驟1.在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸銨體系，或聚乙二醇和葡聚糖體系的雙水相系統(tǒng)；2.加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，進行酶水解反應(yīng)；3.將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入分配槽，靜置成相后，下相經(jīng)超濾膜分離，再經(jīng)納濾膜分離得低聚木糖；回收下相經(jīng)超濾后的截留物，與上相合并，轉(zhuǎn)入水解槽；4.對于原始聚乙二醇和硫酸銨體系的雙水相系統(tǒng)，在水解槽中，再加入硫酸銨，形成雙水相體系，返回步驟2；對于原始聚乙二醇和葡聚糖體系的雙水相系統(tǒng)，直接返回步驟2。本發(fā)明技術(shù)利用雙水相體系，回收利用木聚糖酶，提高了木聚糖酶的利用率，易于規(guī)模放大，操作簡便，生產(chǎn)成本低。
文檔編號C12P19/04GK101294175SQ20081012269
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者余世袁, 強 勇, 宋向陽, 勇 徐, 鑫 李, 歐陽嘉, 牧 陳 申請人:南京林業(yè)大學(xué)