專利名稱：乙肝病毒全基因組多聚酶嵌合體及其組建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬病毒基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種乙肝病毒全基因組多 聚酶嵌合體及其組建方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科，具有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)及生 物學(xué)特性。該病毒的基因組是雙鏈環(huán)狀DM,但卻有一段單鏈區(qū)。 HBV的基因組約為3200鹼基對(duì)(bp)長，但其正鏈和負(fù)鏈的長短不同。 負(fù)鏈具有固定的長度，即約3200bp。 HBV的基因組有4個(gè)編碼區(qū)， 包膜基因(S/pre-S)，核心基因(C/pre-C)，多聚酶基因(P)及X基 因。P基因最長，覆蓋約80%的基因組并與其他的編碼區(qū)重疊。雖 然與其他的編碼區(qū)有重疊，但P基因有自己的讀碼框架。乙型肝炎病 毒引起疾病的臨床表現(xiàn)多種多樣，可為無癥狀攜帶者、急性肝炎、慢 性肝炎、重癥肝炎，并可發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前對(duì)HBV引起疾病 的多樣化認(rèn)為既與機(jī)體的免疫應(yīng)答相關(guān)，也可能與病毒的基因組結(jié)構(gòu) 與功能相關(guān)。病毒的復(fù)制是最關(guān)鍵的因素之一，因?yàn)槿绮《就Ｖ箯?fù)制 則疾病的發(fā)展可受到控制。Summers等(Cell 1982; 29: 403-415)首先在鴨乙肝病毒中證明 病毒的復(fù)制需經(jīng)過RM復(fù)制中間體環(huán)節(jié)。以后在人乙肝病毒也證實(shí)了 這一獨(dú)特的復(fù)制方式。因此學(xué)者們認(rèn)為HBV的復(fù)制周期與逆轉(zhuǎn)錄RNA 病毒很相似，有些區(qū)是高度保守區(qū)，并與逆轉(zhuǎn)錄病毒的依賴RM的 RM多聚酶、依賴DM的DNA多聚酶及RNaseH相似(Tohetal, Nature 1983; 305: 827)。通過與人類免疫缺陷病毒(HIV)及其他病毒的逆轉(zhuǎn) 錄酶比較，目前認(rèn)為乙肝病毒的多聚酶可分為4個(gè)區(qū)自5，-末端 開始，依次為末端蛋白區(qū)(TP)—連接臂區(qū)(spacer)-逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA多聚酶區(qū)區(qū)(RT/DNAP) - RNA酶H區(qū)(RNAseH) (Bar tenschlager and Schaller， 1988;EMBO J 7:4185; Radziwill et al. 1990; J Virol 64:613)。其中3個(gè)具有功能，認(rèn)為連接臂區(qū)無重要功能。有關(guān)多聚 酶功能的變異，最受關(guān)注的是與耐抗HBV藥物拉米夫定的氨基酸變 異，即位于P基因中間部位逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的第551-554位YMDD(氨 基酸Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid, 酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸)變?yōu)閅VDD的變異。最近出現(xiàn) 的對(duì)另一種藥物(famciclovir )耐藥的變異位于P區(qū)TP及RT區(qū)。 對(duì)于HBV多聚酶的功能區(qū)，目前均已報(bào)道的與人類免疫缺陷病毒(HIV)的RT相應(yīng)對(duì)比而分為A (421-436) ，B(506-528)，C(546-556)， D(576-5890， E區(qū)(592-60)。上述的YMDD耐藥性變異已確定在多聚 酶基因的C區(qū)。有關(guān)HBV聚合酶基因變異與毒株復(fù)制功能相關(guān)的研究，首先 Blum等報(bào)道自一例乙型肝炎患者肝組織中獲得復(fù)制缺陷的HBV株， 經(jīng)克隆不同片段再拼接后獲得全分析基因組(HBV 5-15株，已在 GenBank注冊(cè))。進(jìn)一步用點(diǎn)突變及截短基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)因該毒株在P 基因的TP區(qū)第2798位核苷酸由C (胞嘧啶)突變?yōu)锳(腺嘌呤)導(dǎo) 致氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楦彼岷?，病毒可失去?fù)制能力。據(jù)此，他們 以這一核苷酸及相應(yīng)氨基酸的改變?yōu)閷?duì)象，設(shè)計(jì)了與TP區(qū)中第2598 -2998核苷酸互補(bǔ)的寡聚核苷酸作為可發(fā)展為抑制乙肝病毒復(fù)制的 一種方法(Blum et al， Virology 1984;139:87-96; Blum et al， Hepatology 1991; 14: 56-63; USA patent 5， 610, 050， 1997 )。 隨 后不同學(xué)者分別在不同乙肝的患者或發(fā)生肝癌的患者中用基因組，基 因片段測序或點(diǎn)突變技術(shù)研究了乙肝病毒基因組的不同部位發(fā)生突 變及與復(fù)制特性的改變，但均未能發(fā)現(xiàn)P基因中其他有意義與復(fù)制特 性相關(guān)的改變。迄今，對(duì)HBVRT功能區(qū)的推導(dǎo)或設(shè)計(jì)針對(duì)HBVRT的藥物，均以 HIV的RT作為標(biāo)準(zhǔn)；各種病毒的類似酶除有共性外，還可具有獨(dú)特 的功能區(qū)。因此尋找HBV的多聚酶中新的功能區(qū)具有特殊的醫(yī)藥價(jià) 值。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是用置換病毒多聚酶(P)基因及其片段組建重組嵌合 體，另一目的是尋找多聚酶中的新功能區(qū)，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是設(shè) 計(jì)相應(yīng)抑制乙肝病毒復(fù)制的藥物或診斷制品。。本發(fā)明釆用了自不同患者血或組織標(biāo)本中 一 步擴(kuò)增天然存在的HBV毒株全基因組，以全基因組為對(duì)象，對(duì)具有不同復(fù)制特性的毒株,根據(jù)其p基因序列，設(shè)計(jì)引物，旨在既能獲得p基因，又能分別獲得P基因的TP， spacer, RT及RNAse片段，用基因置換方法，組建新 的帶有多聚酶嵌合體的病毒基因組，可將不同片段置換，供作復(fù)制功 能檢測的技術(shù)。這一新技術(shù)超越了已有的以HIVP功能區(qū)為標(biāo)準(zhǔn)的限 制，也不同于僅用HBV P區(qū)或僅以截短的HBV基因?yàn)檠芯考夹g(shù)的報(bào) 道。用本發(fā)明的技術(shù)可尋找P基因編碼產(chǎn)物新的功能區(qū)，本發(fā)明所用的自乙肝患者血清或組織中用一步PCR法擴(kuò)增與克 隆HBV全基因組的技術(shù)是Gunther等于1995年已報(bào)道的方法(J Virol 1995， 69:5437)。其步驟為用位于病毒基因組黏性末端區(qū)設(shè)計(jì) 的引物，從乙肝患者的血清或組織中用PCR擴(kuò)增HBV毒株全基因組 后，克隆入質(zhì)粒載體，組成帶有HBV全基因組的重組質(zhì)粒。用Sapl 內(nèi)切酶消化，自重組質(zhì)粒中獲取完整而不帶有外源DM的全基因組 HBV DM,作基因組序列測定。用5-10 jug HBV基因組DNA在生長于 60mm直徑平皿中的肝癌細(xì)胞系按照文獻(xiàn)報(bào)道，用磷酸鈣沉淀共轉(zhuǎn)染 法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用SEAP (secreted alkaline phosphatase)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn) 染，作為轉(zhuǎn)染效果的內(nèi)對(duì)照。經(jīng)一定時(shí)間孵育后(一般為5天)，根據(jù) Gunther的方法，去除可能存在殘余的轉(zhuǎn)染所用的DNA，分別用酚-氯仿方法提取細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中的DM及細(xì)胞外存在的病毒顆粒的 DNA，分別作凝膠電泳，Southern印跡后，與標(biāo)記的HBV探針作分子 雜交及放射自顯影術(shù)。通過分析雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，可確定高復(fù)制型病 毒株及低復(fù)制型病毒株。有關(guān)中國乙肝患者中的高低復(fù)制株研究已作 報(bào)道(病毒學(xué)報(bào)2000， 16: 116)。在釆用上述技術(shù)獲得一定資料后，分析核苷酸的序列差別，通過 對(duì)比分析初步判斷病毒基因組中復(fù)制功能相關(guān)區(qū)。根據(jù)毒株的核苷酸序列差別，選擇可作比較分析病毒株的對(duì)象。 在HBV患者的全基因組分析中取2例分別為高復(fù)制型(#56)及低復(fù)制型(#2-18)的毒株。兩株毒株作全基因組測序，基因組均為3221bp， 為adw2血清型，兩株間序列僅有42個(gè)核苷酸序列不同，已在GenBank 注冊(cè)(No.AF 100308, AF100309)。由于考慮到以此兩株毒株可較 容易作復(fù)制功能區(qū)的分析，對(duì)全基因組推導(dǎo)了氨基酸改變。選擇多聚 酶(P)基因?yàn)閷?duì)象，根據(jù)序列分別設(shè)計(jì)具有酶切位點(diǎn)或可供作融合PCR 的不同PCR引物。用酶切、PCR及融合PCR法，獲得全P(聚合酶)基 因，以及P基因中的TP(末端蛋白)，SP ( Spacer,連接臂)，RT(逆 轉(zhuǎn)錄酶)，和RNase H (RNA酶H) 4個(gè)片段，供進(jìn)一步組建多聚酶嵌合體 用。在兩株HBV株基因組間進(jìn)行聚合酶基因或其片段間的互換。將自 一株病毒基因組克隆(A)(如#56)用PCR分別擴(kuò)增出的P基因，TP、 SP、 RT及RNaseH片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化及連接酶作用后，分 別置換另一株病毒基因組克隆(B)(如#2-18)的相應(yīng)片段，獲得 了人工組建多種新的多聚合酶嵌合體基因組克隆。分別命名如A株全 P基因被B株的全P基因置換的嵌合體(A-B-P); A株P(guān)基因中的TP 段被B株的TP置換的嵌合體(A-B-TP ); A株中SP段被B株SP段 置換的嵌合體(A-B-SP); A株中RT段被B株中RT段置換的嵌合體 (A-B-RT); A株中RNaseH被B株置換(A-B-RNase H)的嵌合體。對(duì) 獲得人工組建的含有不同多聚酶嵌合體的HBV全基因，作核苷酸序列 測定證實(shí)無誤后，自各嵌合體基因組克隆根據(jù)上述方法提取HBV DM 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。經(jīng)一定孵育時(shí)間后，提取細(xì)胞內(nèi)外的DNA,經(jīng)電泳 及Southern印跡后，與HBV DNA探針作分子雜交，根據(jù)雜交信號(hào)， 判斷各多聚酶嵌合體復(fù)制活性的高低。通過對(duì)比，在構(gòu)建的多聚酶嵌 合體中確定與復(fù)制增強(qiáng)相關(guān)新功能區(qū)的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列。 這些序列可作為設(shè)計(jì)抗乙肝病毒作用的靶序列。對(duì)#56及#2-18 株間作P基因及其各片段置換，組建的嵌合體基因組轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示 #56株中P基因轉(zhuǎn)入#2-18，可使#2-18復(fù)制性增強(qiáng)。分別對(duì)P 基因的各片段置換，顯示當(dāng)#56株的RT區(qū)轉(zhuǎn)入#2-18后可使#2 -18獲得高復(fù)制活性，而其他P基因的片段無如此強(qiáng)復(fù)制性。#56 株的RT片段與# 2 - 18株的RT片段核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列 只有3個(gè)氨基酸差異。位于617 (蛋氨酸—亮氨酸M —L)， 652 (絲氨酸—脯氨酸，S —P) ，682 ( Va丄—亮氨酸V —L)。這3個(gè)氨基酸均位 于公認(rèn)的RT的A， B， C, D, E，功能區(qū)以外，在上述區(qū)的3'端，顯 示是一個(gè)新的與復(fù)制增強(qiáng)相關(guān)的新位點(diǎn)，可作為設(shè)計(jì)抑制HBV復(fù)制藥 物或判斷HBV高、低復(fù)制型的靶。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)為(l)根據(jù)不同HBV毒株的核苷酸序列，設(shè)計(jì) 引物及應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將P基因及其各片段從全基因組中切 割。(2)根據(jù)所得的P基因或其片段，在自然存在的不同毒株全基 因組間進(jìn)行多聚酶及各其片段進(jìn)行置換。(3)用各種新組成的P基因 嵌合體基因組轉(zhuǎn)染肝源細(xì)胞，對(duì)比復(fù)制特性，尋找到新的P基因編碼 的功能區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為(l).用我國乙肝患者來源的HBV全基因組為研 究對(duì)象，更有代表性，由此發(fā)展的治療或診斷制品更有針對(duì)我國HBV 患者的特性。(2)以患者標(biāo)本一次直接擴(kuò)增的HBV基因組作多聚酶基 因的結(jié)構(gòu)與功能分析，可避免因分次擴(kuò)增基因片段、克隆、再拼接所獲得的多聚酶基因發(fā)生人為造成的可能突變，將更真實(shí)地反映P基因 的狀況。(3).在全基因組水平進(jìn)行P基因結(jié)構(gòu)與功能分析，可同時(shí)檢 測因P基因序列改變所構(gòu)成對(duì)其重疊的其他基因的影響。(4).應(yīng)用自 然存在的HBV毒株比全人工組建的克隆更有現(xiàn)實(shí)意義。(5).用重組P基因嵌合體及P基因各片段組建的嵌合體分析，可同時(shí)針對(duì)各P基因片段測定復(fù)制功能改變，供設(shè)計(jì)藥物及診斷制品應(yīng)用。


圖l為設(shè)計(jì)酶切及PCR擴(kuò)增不同基因片段的方案 圖2為置換P基因及置換TP基因片段的方案 圖3為置換P基因中RT與Rnase H的方案 圖4為置換后重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HBV DNA雜交的結(jié)果 其中，1:2-18; 2: 56; 3: 2-18P; 4: 2-18SP; 5: 2-18TP6:2-18RNaseH; 7: 2-18RT。 M:分子量標(biāo)準(zhǔn)圖5為P基因SP片段的示意圖，顯示X， Y, Z (617， 652, 682 氨基酸)位置具體實(shí)施方式
實(shí)施例1由于各HBV毒株的基因組序列并不相同，只能選擇序列相近或酶 切位點(diǎn)適合，或通過PCR擴(kuò)增后可進(jìn)行融合PCR的毒株進(jìn)行P基因及 其片段的置換。以下對(duì)自高復(fù)制型毒株向低復(fù)制型毒株作P基因及其 片段置換設(shè)計(jì)的步驟及結(jié)果舉例。選擇兩株來自中國乙肝患者血清的HBV高(#56)、低(#2-18)復(fù)制 型毒株基因組獲取P基因的SP片段，用# 56的SP置換# 2 - 18的SP。 對(duì)兩株分別來自兩名慢性乙肝患者均為B基因型，adw2血清型的的 HBV毒株進(jìn)行全基因組克隆，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染H印G2肝癌細(xì)胞株證實(shí)分別 為高復(fù)制型#56和低復(fù)制型#2-18 。經(jīng)全基因測核苷酸序列， 發(fā)現(xiàn)有42個(gè)核苷酸序列的差異分布在病毒基因組的多個(gè)基因片段。根據(jù)序列分析，以多聚酶基因?yàn)閷?duì)象，以兩種內(nèi)切酶酶切其中的SP 片段并將弁56的SP片段置換并克隆入弁2-18，組建嵌合體。首先，將重組質(zhì)粒p2-18 (含低復(fù)制株#2-18的pUC19重組載體) 以BstEII及Spel雙酶切，回收4. 8Kb大片段(去除2-18的SP ), 其次，p56 (含高復(fù)制株#56的pUC19重組載體)以相同雙酶切，回 收含#56 SP約1. 1Kb片段。用已知技術(shù)，用連接酶連接上述兩回收 片段，轉(zhuǎn)化DHsa細(xì)菌并進(jìn)行篩選。含#56的SP片段的#2-18嵌合 體通過酶切及序列測定加以證實(shí)(簡稱2-18SP)。設(shè)計(jì)方案參見圖1。實(shí)施例2設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增多聚酶基因中的TP片段，并將#56的TP片段置 換并克隆入# 2 - 18，組建嵌合體。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物為P1、 P2、 P5、 P6。其中，Pl為pUC通用逆 引物，P2、 P5、 P6為HBV特異性引物。引物序列如下 Pl: 5， AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3， P2:5， AGACCACCAAATGCCCCTATC 3， ( 2299-2319nt) P5:5， GATAGGGGCATTTGGTGGTCT 3， ( 2299-2319nt) P6:5， CTGAGTTGGCTTTGAATGCAGG 3， ( 2948-2971nt )嵌合體構(gòu)建策略Pl、 P5以？2-18(含低復(fù)制株#2-18的pUC19重組載體)為模板， 擴(kuò)增約580bp片段，P2、 P6以p56 (含高復(fù)制株#56的pUC19重組載 體)為模板，擴(kuò)增約580bp片段。兩擴(kuò)增片段通過互補(bǔ)的P2、 P5序 列進(jìn)行緩慢退火，并以P1、P6為引物進(jìn)行融合PCR。這樣獲得的1. 2Kb 融合片段為#2-18來源的TP外側(cè)非聚合酶基因片段和并56來源的TP 片段嵌合體。
以EcoRI和BstEII雙酶切1. 2Kb融合片段，回收1. OKb大片段。 p2-18以相同雙酶切并回收4.9Kb大片段。連接上述兩回收片段，轉(zhuǎn) 化DHsa細(xì)菌并進(jìn)行篩選。從而可獲得含#56的TP片段的并2-18嵌 合體。通過酶切及序列測定加以證實(shí)(簡稱12-18TP)。方案參見圖2。
實(shí)施例3
組建用#56全多聚酶(P)基因置換弁2-18全多聚酶(P)基因 的嵌合體基因組
在上述2-18TP基礎(chǔ)上，將#56的聚合酶全基因置換并克隆入# 2-18，組建嵌合體。
質(zhì)粒p2-18TP以BstEII及RsrII雙酶切，回收4. OKb大片段， 該片段已去除2-18的Spacer、 RT、 RNaseH，只含2 - 18的TP 。 p56 以相同雙酶切，回收約2. OKb的片段，只含"6Spacer、 RT、 RNaseH 而不含56 dlTP。連接上述兩回收片段，轉(zhuǎn)化DHsa細(xì)菌并進(jìn)行篩選。 對(duì)含#56的多聚酶全基因的#2-18嵌合體通過酶切及序列測定加 以證實(shí)(簡稱2-18P)
實(shí)施例4
設(shè)計(jì)擴(kuò)增多聚酶基因中的RT片段，并將#56的RT片段置換并 克隆入#2-18，組建嵌合體。
本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物為P3、 P4、 P7、 P8，引物及序列、位置如
下
<formula>formula see original document page 9</formula>P8: 5， GTTCACGGTGGTCTCCAT 3， ( 1610-1627nt) 嵌合體構(gòu)建策略
P3、 P7以p56為模板，擴(kuò)增約700bp片段(含井56RT片段)。P4、 P8以p2-18為模板，擴(kuò)增約490bp片段(含#2-18RNaseH片段)。兩 擴(kuò)增片段通過互補(bǔ)的P4、 P7序列進(jìn)行緩慢退火，并以P3、 P8為引物 進(jìn)行融合PCR。由此獲得的1.2Kb融合片段為#2-18來源的RNaseH 及#56來源的RT片段的嵌合體。
以Spel和RsrII雙酶切1. 2Kb融合片段，回收0. 89 Kb大片段， P^18以相同雙酶切，回收約5.0Kb大片段，連接上述兩回收片段， 轉(zhuǎn)化DHsa細(xì)菌并進(jìn)行篩選。對(duì)含# 56的RT片段的# 2 - 18嵌合體通 過酶切及序列測定加以證實(shí)(簡稱2-18RT)。
實(shí)施例5
設(shè)計(jì)擴(kuò)增多聚酶基因中的RNase H片段，并將#56的RNaseH片 段置換并克隆入2-18，組建嵌合體。 本實(shí)驗(yàn)所用引物同上。 7
P3、 P7以為p2-18模板，用PCR擴(kuò)增約700bp片段(含#2-18RT 片段)。P4、P8以p56為模板，用PCR擴(kuò)增約490bp片段(含并56RNaseH 片段)。兩擴(kuò)增片段通過互補(bǔ)的P4、 P7序列進(jìn)行緩慢退火，并以P3、 P8為引物進(jìn)行融合PCR。這樣獲得的1.2Kb融合片段為f2-18來源的 RT及f56來源的RNaseH片段的嵌合體。
以Spel和RsrII雙酶切1. 2Kb融合片段，回收0. 89 Kb大片段， p2-18以相同雙酶切，回收約5. OKb大片段，連接上述兩回收片段， 轉(zhuǎn)化DHsa細(xì)菌并進(jìn)行篩選。獲得含#56的RNaseH片段的#2- 18嵌 合體通過酶切及序列測定加以證實(shí)(簡稱2-18RNaseH)。參見圖3。
實(shí)施例6
將個(gè)重組各嵌合體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，分析各嵌合體的復(fù)制特性。 1、用Qiagen試劑盒(maxipr印)大量抽提含各嵌合體的重組質(zhì)粒 載體，以Sapl酶切釋放游離的各嵌合體HBV DNA基因組。具體的量 是按1網(wǎng)DNA/1U,以50U Sapl酶切獲取約30|iig HBV DNA。酶切產(chǎn)
10物以等體積苯酚/氯仿及氯仿各抽提一次，乙醇沉淀備用。
2、 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞(該細(xì)胞可自ATCC獲得)釆用磷酸4丐共沉淀 法，將酶切后的各嵌合體HBV DNA與作為內(nèi)參照的SEAP質(zhì)粒(ref) 共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞(15(ig嵌合體HBV ,+10pg Seap DNA /lx106 細(xì)胞/平皿)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收取上清及細(xì)胞。
3、 細(xì)胞內(nèi)HBV核心顆粒DNA的獲取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入600|il裂 解緩沖液(10mM Tris， pH 7.9， lmM EDTA, 50mM NaCl， 1% NP40， 8 %蔗糖)，以加樣器頭反復(fù)吹打細(xì)胞，12000rpm離心2分鐘，取上清。 加入6 |il 6mM醋酸鎂，12|il 5mg/ml DNaseI, 3 pl 20mg/ml RNase， 37°C 30分鐘后12000rpm離心1分鐘，保留上清。往上清中加入16pl EDTA, 130nl 35% PEG 8000/1. 75M NaCl，冰洛1小時(shí)。9000rpm離心 5分鐘，棄上清，沉淀重懸于100iul懸浮液中(10mMTris, pH7. 9， 6mM MgOAc, 0. lpg/iul DNaseI)， 37°C 10分鐘后再加入300^1 SDS/蛋白 酶K緩沖液(25mMTris， pH 7. 4， 10mMEDTA， lOOmMNaCl， 0. 5% SDS， lmg/ml蛋白酶K)， 37°C消化過夜，等體積的酚/氯仿、氯仿各抽提 一次，乙醇沉淀。
4、 Southern-blot:首先檢測轉(zhuǎn)染上清SEAP的表達(dá)量，據(jù)此調(diào) 整各嵌合體HBV DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后胞內(nèi)HBV核心顆粒DNA的上樣量， 使它們保持相同比例。以標(biāo)準(zhǔn)的adrHBV為模板，以隨即引物法制備 探針。對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行密度掃描，根據(jù)掃描灰度的強(qiáng)弱來判斷病毒復(fù) 制的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示，與#2-18相比，經(jīng)用#56的P置換組建的嵌 合體的復(fù)制性增強(qiáng)，對(duì)各P基因片段置換重組體分析2-18RT (#2-18 P基因的RT區(qū)段被#56的相應(yīng)區(qū)段取代所組成的嵌合體)的復(fù)制功 能顯著增強(qiáng)。參見圖4。
實(shí)施例7
結(jié)合核苷酸序列分析嵌合體中與高復(fù)制相關(guān)的核苷酸序列及推 導(dǎo)的氨基酸序列(釆用Vector NTI Suite AlignX分析軟件) 基因組序列確認(rèn)2-18RT與#2-18只有三個(gè)氨基酸的差別，它們分別 位于P基因的617、 652、 682位氨基酸(都位于RT區(qū))。#2-18與 2-18RT比較，所改變的氨基酸為(617M —L,652 S —P， 682 V —L)。RT區(qū)氨基酸的三維結(jié)構(gòu)分析顯示，617、 652、 682位氨基酸位于RT區(qū) 羧基端與雙鏈DNA結(jié)合的功能性區(qū)域內(nèi)。圖5中的X, Y， Z，分別 代表SP片段中的617， 652， 682位氨基酸。 實(shí)驗(yàn)實(shí)例結(jié)果總結(jié)
用本發(fā)明所描述的技術(shù)，對(duì)兩例分別為高復(fù)制型及低復(fù)制型乙肝 患者的血清HBV毒株的全基因組克隆進(jìn)行了多聚酶基因，及其片段 (TP, Spacer, RT， RNaseH)的置換。結(jié)果確定在高復(fù)制株的RT區(qū) 的第601 - 691氨基酸中有高復(fù)制性的功能區(qū)，并確定了其核苷酸與 氨基酸序列。這一功能區(qū)不同與已知的其他功能區(qū)。以此新功能區(qū)為 靶，可設(shè)計(jì)新的抗HBV藥物與診斷制品。
權(quán)利要求
1、 一種乙肝病毒全基因組多聚酶嵌合體基因組的構(gòu)建方法，其 特征在于，用乙肝病毒株的全基因組，通過設(shè)計(jì)引物或內(nèi)切酶消化，置換其多聚酶基因中的逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA多聚酶基因片段，構(gòu)建重組嵌 合體基因組。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒全基因組多聚酶嵌合體基因 組的構(gòu)建方法，其特征在于其中的置換技術(shù)為在乙肝病毒毒株間的P 基因或其基因片段間的分段置換。
3、 、 一種乙肝病毒多聚酶嵌合體基因，其特征在于與原始基因相 比，該基因編碼的氨基酸序列中第617, 652, 682位發(fā)生了變化。
4、 一種增強(qiáng)GenBank注冊(cè)號(hào)為AF100308的低復(fù)制型乙肝病毒基 因組的復(fù)制活性的方法，其特征在于，將所述低復(fù)制型乙肝病毒基因 組中的逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA多聚酶基因片段中的3個(gè)氨基酸分別進(jìn)行如下 置換第617位氨基酸由蛋氨酸變?yōu)榱涟彼幔?52位氨基酸由絲氨 酸變?yōu)楦彼?，以及?82位氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼帷?br> 5、 乙肝病毒全基因組多聚酶基因中的逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA多聚酶基 因片段在制備用于改變所述乙肝病毒基因組復(fù)制活性的試劑中的 用途。
6、 乙肝病毒全基因組多聚酶基因中的逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA多聚酶基 因片段中的第601-691位氨基酸在制備用于改變所述乙肝病毒基因 組復(fù)制活性的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明為在乙肝病毒株的全基因組中用置換病毒多聚酶(P)基因及其片段組建重組嵌合體，并用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分析其復(fù)制功能。本發(fā)明根據(jù)毒株編碼多聚酶的核苷酸序列設(shè)計(jì)不同引物，結(jié)合內(nèi)切酶消化及聚合酶鏈反應(yīng)，對(duì)不同乙型肝炎病毒毒株基因組間的多聚酶基因及其中的各基因片段進(jìn)行置換，對(duì)新組成的多聚酶嵌合體基因組作復(fù)制功能分析。本發(fā)明可用于尋找多聚酶中的新功能區(qū)及設(shè)計(jì)相應(yīng)抑制乙肝病毒復(fù)制的藥物或診斷制品。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101311265SQ200810128488
公開日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2001年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月15日
發(fā)明者旭 林, 袁正宏, 聞?dòng)衩?申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)