專利名稱：一種產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酶工程菌株。
背景技術(shù)：
甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳 甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖，并且具有降低人體膽固醇水平、減
輕便泌、降低血糖、增加腸內(nèi)有益菌和減少有害菌的生理功能；所以被廣泛的 應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)藥、飼料、造紙、洗滌、石油壓裂液破膠和紡織等領(lǐng)域， 具有廣泛的應(yīng)用空間。采用微生物發(fā)酵是目前獲得甘露聚糖酶最為理想的途 徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于微生物發(fā)酵的產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株。 產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株地衣芽孢桿菌HDDMM02(Bacillus licheniformis HDDMM02)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCC No: M 208081;地衣芽孢桿 菌HDDMM02為革蘭氏陽性菌，菌株個(gè)體呈直桿狀，長(zhǎng)為1.2 3.0 mum，寬為 0.8 1.0 mum，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端；地衣芽孢桿菌HDDMM02菌落呈 圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，無光澤表面有皺褶，不透明，挑起呈粘水狀。 本發(fā)明地衣芽孢桿菌HDDMM02每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)一個(gè)芽孢，芽孢呈橢圓或 卵圓。本發(fā)明地衣芽孢桿菌HDDMM02D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為陽 性、乳糖發(fā)酵為陽性、棉子糖發(fā)酵為陽性、海藻糖發(fā)酵為陽性、葡萄糖發(fā)酵為 陽性、甘露醇發(fā)酵為陽性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陽性、 甲基紅試驗(yàn)為陰性、V-P試驗(yàn)為陽性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性、亞硝酸鹽還原 試驗(yàn)為陽性、淀粉水解試驗(yàn)為陽性、丙二酸試驗(yàn)為陽性、明膠液化試驗(yàn)為陽性、 生長(zhǎng)溫度55℃試驗(yàn)為陰性、質(zhì)量濃度2%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃 度3%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃度7%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、 質(zhì)量濃度10%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性。
采用現(xiàn)有地衣芽孢桿菌液體培養(yǎng)基及發(fā)酵條件都可以對(duì)本發(fā)明地衣芽孢
桿菌HDDMM02進(jìn)行發(fā)酵。采用"地衣芽孢桿菌TS-01液體培養(yǎng)的研究"中 使用的液體培養(yǎng)基及發(fā)酵條件發(fā)酵本發(fā)明地衣芽孢桿菌HDDMM02，發(fā)酵液 中地衣芽孢桿菌HDDMM02菌數(shù)濃度為lxl07~lxl08cfu/mL時(shí)發(fā)酵液中甘露 聚糖酶的酶活力達(dá)300000IU/mL以上。
本發(fā)明產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株HDDMM02 (Sacz7/w //c/^"i/^/m:s HDDMM02)為地衣芽孢桿菌(Bacz7/"s //c^em/omn》屬于芽孢桿菌屬 (&d//w)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日， 保藏號(hào)為CCTCCNo: M 208081。


圖1是具體實(shí)施方式
一地衣芽孢桿菌HDDMM02菌株形態(tài)圖(100倍放 大圖)，圖2是具體實(shí)施方式
一地衣芽孢桿菌HDDMM02及其相近菌株的16S iDNA基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株地衣芽孢桿菌 HDDMM02 (5acz7/wW/c/^"z/or;m;sHDDMM02)屬于芽孢桿菌屬(Ba"7/"s)， 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為 CCTCCNo: M 208081;地衣芽孢桿菌HDDMM02為革蘭氏陽性菌，菌株個(gè) 體呈直桿狀，長(zhǎng)為1.2~3.0pm，寬為0.8 1.0^im，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓 端；地衣芽孢桿菌HDDMM02菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，無光 澤表面有皺褶，不透明，挑起呈粘水狀。
本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)一個(gè)芽孢，芽孢呈橢 圓或卵圓。本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02菌株形態(tài)如圖l所示。
本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02 D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為 陽性、乳糖發(fā)酵為陽性、棉子糖發(fā)酵為陽性、海藻糖發(fā)酵為陽性、葡萄糖發(fā)酵 為陽性、甘露醇發(fā)酵為陽性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陽 性、甲基紅試驗(yàn)為陰性、V-P試驗(yàn)為陽性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性、淀粉水解試驗(yàn)為陽性、丙二酸試驗(yàn)為陽性、明膠液化試驗(yàn)為
陽性、生長(zhǎng)溫度55。C試驗(yàn)為陰性、質(zhì)量濃度2n/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、 質(zhì)量濃度3%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃度7%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為 陽性、質(zhì)量濃度10。/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性。
本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02是采用3，5-二硝基水楊酸比色法 (DNS法)從大麻漚麻液中分離篩選得到的。
用弓|物 Al ( 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和 A2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌 HDDMM02進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下地衣芽孢桿菌 HDDMM02DNA模板10&、濃度為2.5 mmol/L的堿基名稱(dNTP) 4^L、 1(^緩沖液(1^徑2+ Free) 5^iL、濃度為25 mmol/L的MgCl2 4)iL、濃度為10 pmol/L 的引物5pL、酶活為5 U/pL的Taq酶(DNA聚合酶)0.2^L、并以去離子水補(bǔ) 足至50nL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94"預(yù)變性5min， 94"C變性30s、 57。C退火30s、 72""C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)，最后72"延伸7min。
本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02的16S rDNA序列Genbank比對(duì)結(jié) 果如表1所示(表1中列舉了相似性最高的菌種)。 表l
NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中最相似菌種(登錄號(hào)) The strains which have the highest identity from NCBI (Accession)相似性 Similarity
5ac!7/us v函柳池(AB021198)99%
5rev/6a"er/鵬Aa/oto/erara(AJ620368)99%
p /m7uy(AM062682)99%
份ev沾a"e"'鵬Aa/o/o/enms(AM747812)99%
5ac"/Ms /wo_/avensis(AY436360)99%
5adZZus fcAe z/o/vm's(AY971527)99%
Saa"us/i.c/ie"(/bwn's(DQ167473)99%
99%
99%
5ac!7/us &/iem/o/vwis(EF656455)99%
5ac說iis幼6ri/is(EU047884)99%
由本實(shí)施方式地衣芽孢桿菌HDDMM02及其相近菌株的16S rDNA基因
序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。
本實(shí)施方式利用BLASTN程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) — 一對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，從數(shù)據(jù)庫(kù)中得到相關(guān)種屬16S rDNA序列信息; 再通過DNAMAN (Version 5.1)軟件對(duì)目的序列和Genbank中近緣菌種的序 列進(jìn)行缺省參數(shù)的對(duì)位排列(alignment);然后用該軟件中的鄰位加入法 (neighbor-joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以上方法都進(jìn)行了 1000次的自展 (bootstraping)，證實(shí)了本實(shí)施方式所建進(jìn)化樹的真實(shí)性。
具體實(shí)施方式
二:本實(shí)施方式采用"地衣芽孢桿菌TS-01液體培養(yǎng)的研究" (地衣芽孢桿菌TS-Ol液體培養(yǎng)的研究谷春濤、彭愛銘、薩仁娜、佟建明， 《飼料廣角》2003年07期)中使用的液體培養(yǎng)基及發(fā)酵條件發(fā)酵具體實(shí)施方 式一中的地衣芽孢桿菌HDDMM02。
本實(shí)施方式發(fā)酵液(液體培養(yǎng)基)中地衣芽孢桿菌HDDMM02菌數(shù)濃度 為lxl07~lxl08cfii/mL時(shí)經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中甘露聚糖酶的酶活力為 320000IU/mL。
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株，其特征在于產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株地衣芽孢桿菌HDDMM02(Bacillus licheniformis HDDMM02)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCC NoM 208081；地衣芽孢桿菌HDDMM02為革蘭氏陽性菌，菌株個(gè)體呈直桿狀，長(zhǎng)為1.2～3.0μm，寬為0.8～1.0μm，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端；地衣芽孢桿菌HDDMM02菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，無光澤表面有皺褶，不透明，挑起呈粘水狀。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株，其特征在于地 衣芽孢桿菌HDDMM02每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)一個(gè)芽孢，芽孢呈橢圓或卵圓。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株，其特征在于地 衣芽孢桿菌HDDMM02D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為陽性、乳糖發(fā)酵為 陽性、棉子糖發(fā)酵為陽性、海藻糖發(fā)酵為陽性、葡萄糖發(fā)酵為陽性、甘露醇發(fā) 酵為陽性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陽性、甲基紅試驗(yàn)為 陰性、V-P試驗(yàn)為陽性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性、 淀粉水解試驗(yàn)為陽性、丙二酸試驗(yàn)為陽性、明膠液化試驗(yàn)為陽性、生長(zhǎng)溫度 55'C試驗(yàn)為陰性、質(zhì)量濃度2%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃度3%的 NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃度7。/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性、質(zhì)量濃度 10%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽性。
全文摘要
一種產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株，它涉及一種產(chǎn)酶工程菌株。本發(fā)明提供了一種用于微生物發(fā)酵的產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株。產(chǎn)甘露聚糖酶的工程菌株地衣芽孢桿菌HDDMM02屬于芽孢桿菌屬，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NoM 208081地衣芽孢桿菌HDDMM02為革蘭氏陽性菌，菌株個(gè)體呈直桿狀，長(zhǎng)為1.2～3.0μm，寬為0.8～1.0μm，具圓端；地衣芽孢桿菌HDDMM02菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，無光澤表面有皺褶，不透明，挑起呈粘水狀。采用現(xiàn)有地衣芽孢桿菌液體培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中地衣芽孢桿菌HDDMM02菌數(shù)濃度為1×10⁷～1×10⁸cfu/mL時(shí)發(fā)酵液中甘露聚糖酶的酶活力達(dá)300000IU/mL以上。
文檔編號(hào)C12N9/42GK101386824SQ20081013684
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日
發(fā)明者凌宏志, 接偉光, 江云飛, 王貴賓, 葛菁萍, 蔡柏巖 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)