假單胞菌屬菌株及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明特別涉及一種假單胞菌屬菌株5A)SYC01及其篩選方法。【背景技術(shù)】
[0002] 多氯聯(lián)苯（polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是在Fe3+催化劑催化下、以聯(lián)苯為 母體的、人工合成的含氯有機(jī)物，因氯的取代位不同，理論上共有209個(gè)同系物。作為一種 理化性能穩(wěn)定的化工產(chǎn)品，曾在歐洲、亞洲、北美洲等地的多個(gè)工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用， 全球生產(chǎn)總量已超150萬噸，并且許多已曝露于環(huán)境之中。
[0003] 自然環(huán)境中的PCBs，呈現(xiàn)出多個(gè)側(cè)面的特性。首先，由于氯原子的存在，PCBs具有 抗生物降解性，僅在土壤中的半衰期就長達(dá)幾年甚至幾十年。其次，隨著"蒸餾效應(yīng)"、"蛙跳 效應(yīng)"等大氣環(huán)流活動(dòng)，PCBs被從生產(chǎn)使用地遠(yuǎn)距離地輸送到了從南極到北極的全球各地， 例如在中國上海，居民生活區(qū)域的室內(nèi)、室外灰塵和農(nóng)田土壤等樣品中，均已檢出PCBs(1.0 ~1. 97X103ng?g\n.d. ~1. 96X103ng?g1 和n.d. ~261ng?g3，遠(yuǎn)距輸送性使PCBs從 點(diǎn)源性污染轉(zhuǎn)變?yōu)槊嬖葱晕廴?，成為更難解決的環(huán)境問題。再次，PCBs具有在食物鏈中傳 遞、在高級(jí)生物體中富集的特性，在全球各類哺乳動(dòng)物的乳汁中，PCBs的檢出濃度亦達(dá)到了 6. 78 ~360ug^kg1，在高級(jí)生物體中的濃度更是相應(yīng)環(huán)境濃度的幾十萬倍。最后，PCBs還 具有生物毒性，并隨著氯原子數(shù)的增加而增大，微量的PCBs就可能對(duì)生物產(chǎn)生致癌、致畸 和致突變的作用，對(duì)人類的生命活動(dòng)造成重大負(fù)面影響。因此，世界衛(wèi)生組織全球環(huán)境監(jiān)測 系統(tǒng)/食品污染監(jiān)測和評(píng)估計(jì)劃（GEMS/F00D)監(jiān)控的7種PCBs中，有6種為四氯取代或以 上，并將海產(chǎn)品中之這7種PCBs的總和量限定為0? 5mg?kg1 (或0? 5ppm)。
[0004] 為扼制及預(yù)防泄露PCBs對(duì)環(huán)境及生物的危害，消減PCBs在環(huán)境中的總量是從根 源上解決該問題的優(yōu)先策略。土壤中的PCBs占到環(huán)境中總量的93. 1 %，土壤是PCBs的最 終的匯聚之地，因此消減土壤中的、尤其是面源污染的PCBs，成為PCBs總量減量化的關(guān)鍵。
[0005] 最初的、并沿用至今的獲取降解菌的方法，是PCBs污染點(diǎn)樣品中菌株的篩選分離 法。迄今報(bào)道的PCBs降解菌株中，大多以這種主流的方法獲得。然而，這些菌株在實(shí)際污 染土壤中的應(yīng)用結(jié)果卻不甚理想，解效率只是實(shí)驗(yàn)室懸浮細(xì)胞的1/50、實(shí)驗(yàn)室土壤模擬的 1/2。眾多的研究表明，最主要的原因是這些從特殊地點(diǎn)獲得菌株的生存模式特殊，與土著 微生物菌群之間產(chǎn)生了生存競爭，使得實(shí)際土壤中很難保持住PCBs有效降解所需的生物 量，成為了面源污染減量化的障礙。
[0006] 微生物與植物的共生，是一種自然界現(xiàn)象。在植物根際土壤中，共生細(xì)菌因不與其 它微生物菌群生存競爭而能保持較高水平的生物量。從非PCBs污染點(diǎn)的、植物根際土壤中 篩選出降解PCBs的共生菌株，既能解決生物量的問題，也能解決生存競爭的問題。有基于 此，本文從非PCBs污染點(diǎn)的、三葉草的根際微生物中，分離篩選出的一株對(duì)PCBs有降解能 力的細(xì)菌SYC01，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)PCB52 (鄰位氯取代）和PCB77 (對(duì)位氯取代）的四氯聯(lián)苯均有 靜息降解能力，表明SYC01對(duì)不同類型氯取代位的高氯代PCBs均有良好的降解能力，具有 良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一株假單胞菌屬菌株（/kewt/omwassp. )SYC01，該菌 株能降解PCBs。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供該菌株的篩選方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一株假單胞菌菌株，該菌株的保藏號(hào)為CGMCCNo. 10784。
[0010] 一種篩選上述的假單胞菌菌株的方法，其特征在于該方法的具體步驟為： a. 采集三葉草根際土壤，用無菌水打散，形成懸濁液，取該懸濁液于液體合成培養(yǎng)基 LSM中，28 °C、150rpm下培養(yǎng)5~7d，得到菌懸液，取該菌懸液于LSM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)代5次； 所述的三葉草根際土壤與無菌水的質(zhì)量體積比為1g:1〇~12ml;所述的懸濁液與LSM培 養(yǎng)基的體積比為10ml:(100~120)ml;所述的菌懸液與LSM培養(yǎng)基的體積比為10ml: (100 ~120)ml; b. 將步驟a所得菌懸液涂布于固體合成培養(yǎng)基SSM中，30 °C靜置培養(yǎng)4d，獲得單菌 落，挑取單菌落在固體LB培養(yǎng)基SLB上劃線純化3次，獲得純菌種； c. 將步驟b中的純菌種制成菌懸液，并涂布于SSM平板上，28 °C靜置培養(yǎng)，得到假單 胞菌菌株。
[0011] -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的假單胞菌菌株在降解多氯聯(lián)苯中的應(yīng)用。。
[0012] 本發(fā)明的該菌株來源于三葉草根際共生的微生物，能夠降解多氯聯(lián)苯 (polychlorinatedbiphenyls，PCBs)。該發(fā)明的確立，將在與植物共生的條件下消減土壤 中的PCBs、防止PCBs對(duì)環(huán)境及生物的危害的治理工作中，扮演積極角色。
[0013] 牛物材料保藏信息 本發(fā)明的假單胞菌菌株SYC01，已于2015年5月7日保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編：100101。該菌株的保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 10784。該菌株的分類命 名是假單胞菌Pseudomonassp，名稱為SYC01。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明的假單胞菌菌株靜息細(xì)胞催化降解PCB52的動(dòng)力學(xué)曲線。
[0015] 圖2為圖解法表示的本發(fā)明的假單胞菌菌株靜息細(xì)胞催化降解PCB52的動(dòng)力學(xué)雙 倒數(shù)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下述實(shí)驗(yàn)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0017] 實(shí)施例1、培養(yǎng)基的制備 1)合成培養(yǎng)基： A溶液：56. 77g?L1K2HP04, 21. 94g?L1KH2P04,12 . 96g?L1 (NH4)2S04; B溶液：0? 3g?L1CaCl2 ?H20,19. 5g?L1MgS04, 5g?L1MnS04 ?H20,1g?L1 FeS04 ? 7H20 ; C溶液：0. 1g?L1酵母浸膏。
[0018] 液體合成培養(yǎng)基（LSM) :77. 5mLA溶液+ 10mLB溶液+ 910mLC溶液+2g聯(lián) 苯，pH7. 2〇
[0019] 固體合成培養(yǎng)基（SSM) :77. 5mLA溶液+ 10mLB溶液+ 910mLC溶液+ 2g 聯(lián)苯+ 15g瓊脂，pH7. 2。
[0020] 2)LB培養(yǎng)基： 液體LB培養(yǎng)基（LLB) :10g?L1蛋白胨，5g?L1酵母浸膏，10g?LWaCl，pH7. 2。
[0021] 固體LB培養(yǎng)基（SLB) :1000mLLLB+ 15g瓊脂，pH7. 2。
[0022] 實(shí)施例2、菌株的獲得 1) 篩選：采集未被PCBs污染過的三葉草根際土壤1g，用10mL無菌水打散，取1mL 懸濁液于100mLLSM中，28 °C、150rpm下培養(yǎng)5~7d;取1mL菌懸液于新的100mLLSM 中，轉(zhuǎn)代5次； 2) 分離：吸取最后一次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的菌懸液200ML并涂布于SSM中，30 °C靜置培養(yǎng)4d，獲得單菌落； 3) 純化：挑取單菌落在SLB培養(yǎng)基上劃線純化3次，獲得純菌種； 4) 獲得：將3)中的純菌種制成菌懸液，并涂布于SSM平板上。28 °C靜置培養(yǎng)，挑選其 中生長快且好的一株菌株，并命名為SYC01，并接于SLB斜面上保藏。
[0023] 實(shí)施例3、菌株的鑒定 一、 形態(tài)及生理生化特征 將菌株SYC01接種于SSM平板上，28 °C，靜置培養(yǎng)