一種纖維素酶生產菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學領域，具體涉及一種纖維素酶生產菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的多組分酶的總稱，在飼料、酒精、紡織和食品 等領域具有巨大的市場潛力，纖維索酶的來源非常廣泛，昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌、 放線菌和真菌等都能產生纖維素酶。長久以來，人們對真菌產酸性纖維索酶研究得最為深 入和廣泛，但隨著纖維素酶應用領域范圍的擴大，傳統(tǒng)的真菌產酸性纖維素酶并不能夠適 用于所有行業(yè)，而細菌產的中性、堿性纖維素酶卻在紡織、洗滌劑、造紙，處理環(huán)境污染等行 業(yè)日益顯現(xiàn)出它特有的優(yōu)勢。但是目前國內對于中性、堿性纖維素酶的報道仍很少，大多是 由于細菌產生的纖維素酶活力不高所致，篩選出一株高產中性纖維素酶產生苗及確定其培 養(yǎng)方法顯得至關重要。
[0003] 就動物飼料而言，真菌生產的酸性纖維素在上世紀80年代早期就被添加到奶牛， 肉雞，家豬等畜禽類飼料中，并能顯著的提高飼料的利用率及增加畜禽的免疫力。但是酸性 纖維素并不適合水產動物飼料添加及水生環(huán)境污染的處理。水產動物和畜禽差別很大，飼 料酶制劑在水產飼料中的應用與畜禽酶制劑的應用有很大的差別。水產動物適宜的生長溫 度一般較畜禽低，為15_32°C;魚類的消化道pH值與畜禽也不一樣，很多魚沒有胃，腸道的 pH值為6. 8-7. 3,基本為中性，而畜禽的消化道pH多為酸性；養(yǎng)殖水體一般都處于中性環(huán) 境。目前，在現(xiàn)代的水產集約化養(yǎng)殖中廣泛存在大量纖維素成分降解不完全的問題，這些問 題一方面造成了動物飼養(yǎng)成本居高不下，另一方面帶來大量的環(huán)境污染，因此一種適合水 生中性環(huán)境的高效表達中性纖維素酶的菌種和體系對水產行業(yè)擁有巨大的潛在意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 發(fā)明目的：為了解決現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是 提供了一種纖維素酶生產菌。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供了一種纖維素酶。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是提供了 一種纖維素酶的生產方法。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第四個技術問題是提供了上述纖維素酶在制備水產飼料方面 的應用。
[0008] 技術方案：為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種纖維素酶生產菌，其特征在 于，其分類命名為巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium)，該菌株已于2015年5月21號 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2015320,保藏地址：湖北省武漢市 武昌區(qū)武漢大學保藏中心（武漢大學第一附屬小學對面）。該巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)CCTCCM2015320 的簡稱命名為SMY0001。
[0009] 該巨大芽孢桿菌系發(fā)明人從草魚腸道中分離篩選得到的。該菌株具有如下特性： SMY0001菌株既可以在酵母膏、LB合成培養(yǎng)基上生長，其主要代謝產物為纖維素酶。生長 pH值范圍為5. 5-10. 0,生長溫度范圍為25-42°C。SMY0001菌體細胞桿狀，末端方，成短或 長鏈。產芽孢，芽孢橢圓形或柱形，中生或近中生。好氧型，革蘭氏陽性。SMY0001在細菌培 養(yǎng)基平板（牛肉膏59,蛋白胨109,氯化鈉59,瓊脂209,蒸餾水1000ml，調pH7. 8-8.2)上的 菌落特征是：形態(tài)為圓形，表面粗糙不透明，污白色或微黃色，該菌株鑒定為該巨大芽孢桿 菌（Bacillusmegaterium)〇
[0010] -種纖維素酶，所述纖維素酶來源于所述的纖維素酶生產菌。
[0011] -種纖維素酶的生產方法，通過以所述的纖維素酶生產菌經過誘導培養(yǎng)基振蕩培 養(yǎng)高效表達而得到纖維素酶。
[0012] 其中，上述誘導培養(yǎng)基按照質量百分比計算，包括以下組分：羧甲基纖維素鈉 1 %、尿素1 %，無機鹽1. 5%，水96. 5%。
[0013] 其中，上述振蕩培養(yǎng)的溫度為28°C，培養(yǎng)時間4天，振蕩培養(yǎng)的裝置轉速為 120-200r/min。
[0014] 其中，上述無機鹽為氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸 酶中的一種或一種以上。
[0015] 上述的纖維素酶在制備水產飼料方面的應用。
[0016] 有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：
[0017] 1)本發(fā)明提出的方法得到的是在pH中性下適用的纖維素酶，而國內現(xiàn)在一般生 產的都是酸性條件下適用的纖維素酶，中性及堿性纖維素酶在水產養(yǎng)殖應用方面明顯優(yōu)于 酸性纖維素酶；
[0018] 2)使用的菌種為巨大芽孢桿菌，和目前國內一般采用木霉菌作為纖維素酶生產菌 種不同。該方法所使用的巨大芽孢桿菌是一種易于保存、擴增、繁殖快、適合大規(guī)模生產的 菌種，可以縮短生產周期；
[0019]3)該方法所制備的纖維素酶活力高、對pH適用范圍廣穩(wěn)定性好；
[0020] 4)本發(fā)明的巨大芽孢桿菌SMY0001具有很高的產酶能力，可作為飼料添加劑應用 于水產飼料中，能有效提高養(yǎng)殖魚類的生產性能，應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0021] 下面列舉實施例對本發(fā)明進一步說明，但不因此限制本發(fā)明的內容。
[0022] 實施例1巨大芽孢桿菌SMY0001分離篩選及鑒定
[0023] 菌株初篩：采集健康草魚后腸內容物6份，分別稱取0.5g樣品，加入4. 5mL無菌 水，制備成懸液，經80°C水浴處理殺死非芽孢營養(yǎng)體后，涂布于羧甲基纖維素鈉篩選平板 上，37°C培養(yǎng)48小時，獲得18株細菌。
[0024] 實施例2 18株纖維素分解菌的鑒定：
[0025] 將18株纖維素分解菌培養(yǎng)液收集后，提取基因組DNA，作為模板進行PCR，擴增細 菌的16S全長，PCR產物回收克隆后進行測序，采用BLAST(BasicLocalAlignmentSearch Tool)軟件將測序結果在GenBank數(shù)據庫中進行序列相似性搜索，確定菌種信息。結果表 明，18株細菌中有12株為芽孢桿菌。
[0026] 實施例3、篩選酶活最高的菌種SMY0001:
[0027]制備粗酶液：分別將12株芽孢桿菌接種于羧甲基纖維素的培養(yǎng)基（成分為羧甲基 纖維素鈉1%、酵母提取物1%，無機鹽1.5% ,96.5%的水，pH7.0)中，55°C培養(yǎng)7天，將 培養(yǎng)液8000r/min離心20min，獲得粗酶液。
[0028] CMC酶活的測定：底物使用1 %羧甲基纖維素鈉（CMC)，加入適當稀釋倍數(shù)的酶液， 在50°C、80r/min、pH4-10下反應30分鐘，測定酶解產生的葡萄糖量。一個CMC酶活力單位 定義為：標準反應條件下每小時每毫升酶液生成一毫克葡萄糖的酶量，以u/ml表示，從檢 測結果中選取出高效表達纖維素酶的巨大芽孢桿菌菌株SMY0001，該菌株保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，該巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium)保藏編號為CCTCCM2015320。
[0029] 實施例4優(yōu)化誘導條件：
[0030] 不同培養(yǎng)溫度和不同誘導時間下SMY0001產酶活力檢測
[0031] 設置三個溫度梯度，25°C，32°C，40°C，誘導時間為0天，4天，7天，10天，14天，21 天，28天，SMY0001產酶結果如下表：
[0032]
[0033] 可見最適溫度為25 °C。
[0034] 設置誘導溫度為25°C，不同pH條件下，SMY0001產酶活力檢測結果如下表：
[0035]
[0036] 可見最適誘導pH值為7. 0.
[0037]設置誘導溫度為25°C，pH值為7. 0,不同氮源條件下SMY0001產酶活力檢測；
[0038] 配制5種不同氮源的培養(yǎng)基，不同pH值及不同誘導時間下SMY0001的產酶活 性檢測，配置5種不同氮源的培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉0. 8-1 %、氮源0. 8-1 %，無機鹽 1. 5-1. 8%，95-97%的水，所用的氮源分別為尿素、蛋白胨、酵母提取物、NH4CL，NaN02。
[0039] 三個不同pH值分別為：4. 0, 5. 5, 7. 0
[0040] 誘導時間為：4天，7天，10天，14天，21天，28天
[0041] 不同誘導條件下SMY0001產酶結果如下表：
[0042]
[0044] 結果表明在氮源為尿素，誘導溫度為25°C，pH值為7. 0,誘導時間為4天時， SMY0001的纖維素酶活性達到最高。
[0045] 實施例5三角瓶發(fā)酵制備纖維素酶
[0046] 1、斜面培養(yǎng)：在無菌操作條件下，將SMY0001菌株用接種環(huán)（內徑2. 5mm，取量10 微升，下同）挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質量百 分比為：蛋白胨1. 0%，酵母粉1. 0%，氯化鈉0. 5%，磷酸氫二鉀0. 1 %，瓊脂2. 0%，其余為 水。
[0047] 2、振蕩培養(yǎng)：在無菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入5ml的試管中，置搖 床上振蕩培養(yǎng)8-12小時，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉速為150r/min。液體培養(yǎng)基中各成分的質 量百分比為：蛋白胨1.0%，酵母粉1.0%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0. 1%，其余為水。
[0048] 3、然后再在裝液量為100ml的500ml三角瓶中用芽孢桿菌做菌種發(fā)酵生產中性纖 維素酶，接種量為〇. 1 %體積比，發(fā)酵溫度為28°C，搖床轉速為120-200r/min。其中發(fā)酵培 養(yǎng)基中各成分的質量百分比為：羧甲基纖維素鈉1%、酵母提取物1%，無機鹽1. 5%，其 余為水，pH為7. 0。
[0049] 4、酶活力測定：測定結果表明，pH7. 0時，28°C，培養(yǎng)4天后，該纖維素酶活力達到 420. 5u/ml.實驗結果表明，本發(fā)明制備得到的纖維素酶在中性和條件下均有很高活力。
[0050] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種纖維素酶生產菌，其特征在于，其分類命名為巨大芽孢桿菌（ aze^ateri?)，該菌株已于2015年5月21號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC M 2015320。2. -種纖維素酶，其特征在于，所述纖維素酶來源于權利要求1所述的纖維素酶生產 菌。3. 權利要求2所述的一種纖維素酶的生產方法，其特征在于，通過以權利要求1所述的 纖維素酶生產菌經過誘導培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)高效表達而得到纖維素酶。4. 根據權利要求3所述的一種纖維素酶的生產方法，其特征在于，所述誘導培養(yǎng)基按 照質量百分比計算，包括以下組分：羧甲基纖維素鈉1%、尿素1%，無機鹽1.5%，水96. 5%。5. 根據權利要求3所述的一種纖維素酶的生產方法，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的溫 度為28°C，培養(yǎng)時間4天，振蕩培養(yǎng)的裝置轉速為120-200r/min。6. 根據權利要求4所述的一種纖維素酶的生產方法，其特征在于，所述無機鹽為氯化 鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸酶中的一種或一種以上。7. 權利要求2所述的纖維素酶在制備水產飼料方面的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種纖維素酶生產菌，其分類命名為巨大芽孢桿菌（<i>Bacillus？megaterium</i>），該菌株已于2015年5月21號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC？M？2015320。本發(fā)明得到的是在pH中性下高活性的纖維素酶，在水洗酶應用方面明顯優(yōu)于酸性纖維素酶，本發(fā)明的方法采用的羧甲基纖維素鈉作為碳源，其在運輸、投料、消毒等方面都優(yōu)于纖維類原料；以尿素作為可溶性氮源，成本低、制作及使用方便。本發(fā)明的方法所制備的纖維素酶活力高、對pH適用范圍寬穩(wěn)定性好、生產周期短。CCTCCM201532020150520
【IPC分類】C12N1/20, A23K1/18, C12R1/11, A23K1/165, C12N9/42
【公開號】CN105039195
【申請?zhí)枴緾N201510267129
【發(fā)明人】王桂堂, 熊凡, 吳山功, 鄒紅, 李文祥
【申請人】中國科學院水生生物研究所, 武漢水夢源生物科技有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年5月22日