專利名稱：：糧食作物深加工制品高通量五重巢式pcr轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是一種用于主要糧食作物深加工產(chǎn)品高通量轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法.(二)技術(shù)背景隨著各國(guó)有關(guān)轉(zhuǎn)基因生物(geneticallymodifiedorganism,GMO)標(biāo)簽法的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確檢測(cè)也顯得日趨重要，很多國(guó)家不但要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測(cè)，還需要對(duì)產(chǎn)品中的GMO含量進(jìn)行定量檢測(cè)，以便標(biāo)識(shí)。歐盟等國(guó)家和地區(qū)先后出臺(tái)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)簽制度，出入境產(chǎn)品必須出具是否含有轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)報(bào)告。近年來(lái)，我國(guó)大量進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆用于加工，由于市場(chǎng)標(biāo)識(shí)不夠,使我國(guó)加工產(chǎn)品出口貿(mào)易遭受損失。為了加強(qiáng)對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售行為，引導(dǎo)和保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，該辦法規(guī)定了在中國(guó)境內(nèi)需要標(biāo)識(shí)的第一批轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5類17種產(chǎn)品。目前國(guó)內(nèi)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)較為混亂，出現(xiàn)了一些技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不一致、法規(guī)滯后、與國(guó)際慣例不接軌等現(xiàn)象，致使某些產(chǎn)品實(shí)行國(guó)際、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)"雙重標(biāo)準(zhǔn)"，沒(méi)有依照中國(guó)有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品的規(guī)定貼上相關(guān)標(biāo)識(shí)，侵害了中國(guó)消費(fèi)者的利益。大豆、玉米和水稻深加工制品己越來(lái)越多，如卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆油、玉米油、玉米蛋白質(zhì)粉、玉米淀粉、麥片等食品，其加工呈現(xiàn)復(fù)雜化和多元化的特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外仍然沒(méi)有適合的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)進(jìn)行檢測(cè)。"樂(lè)之事件"以及"雀巢食品含轉(zhuǎn)基因"事件都表明，我國(guó)在轉(zhuǎn)基因市場(chǎng)的管理上確實(shí)存在漏洞，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)督力度不足，造成了企業(yè)有法律空子可鉆。要完善、健全我國(guó)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理制度，首要問(wèn)題是要解決我國(guó)尚未統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題，同時(shí)要提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的精確度，以保證我國(guó)消費(fèi)者的利益。目前，歐盟率先倡導(dǎo)并實(shí)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)并要求產(chǎn)品成分中轉(zhuǎn)基因含量大于1%時(shí)必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)，因此其檢測(cè)技術(shù)早己經(jīng)成熟，檢測(cè)下限達(dá)0.1%。國(guó)內(nèi)一些機(jī)構(gòu)，尤其進(jìn)出口檢疫局也相繼建立檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)趨于成熟，但還只限于對(duì)轉(zhuǎn)基因原料的檢測(cè)，在深加工產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)的研究上還很不成熟，沒(méi)有統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)所需的DNA提取技術(shù)在國(guó)外尚處于研究階段，并沒(méi)有形成系列化技術(shù)，商品化的提取試劑盒種類單一。由于深加工產(chǎn)品種類繁多，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而深加工品DNA提取技術(shù)應(yīng)該是一系列技術(shù)，提取試劑盒也應(yīng)該是多樣化，不同產(chǎn)品采用不同試劑盒，缺乏針對(duì)不同深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的DNA提取技術(shù)。因此，急需建立了一整套簡(jiǎn)便、精確、快捷、成熟、可信度高的轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工制品檢測(cè)技術(shù)體系，為我國(guó)糧食作物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)平臺(tái)，為GMO標(biāo)簽制度進(jìn)一步發(fā)展提供技術(shù)保證。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種有效地防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而且可以提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)周期，具有高效、快速、低成本、高靈敏度的糧食作物深加工制品高通量五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)方法的檢測(cè)過(guò)程為材料陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標(biāo)準(zhǔn)品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營(yíng)養(yǎng)麥片、玉米泥；試劑WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR緩沖液(含MgCl2)和DLDNA2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(1)DNA提取(1.1)DNA提取將大豆、玉米、水稻標(biāo)準(zhǔn)品粉末及其它待檢樣品根據(jù)Wizard艮MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說(shuō)明分別進(jìn)行DNA提取。(1.2)DNA樣品濃度檢測(cè)DNA濃度通過(guò)核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強(qiáng)度雙重測(cè)定。(2)引物設(shè)計(jì)利用PrimerPremierV5.0軟件進(jìn)行五重巢式PCR的引物設(shè)計(jì)，用OligoV6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物。引物所擴(kuò)增目的片段及擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下表。表1多重巢式PCR所用引物序列及擴(kuò)增片段大小Tab.ListofprimersinmultiplenestedPCR<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR引物AATCTTCTACTGGTACATGGATheprimerofthefirstRbclWFRbclWRCTCATCATCTTTGGTAAAATCARBCL433multipleAGPCRGGACAACAACCCAAACATCACryWFCryWRACTTGGTACAGGTTGCTCAGGCCCTCCrylA(B)322BarWFBarWRGTCTGCACCATCGTCAACCACTCGGCCGTCCAGTCGTABAR201PatWFPatWRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCGCAACCAACCAAGGGTATCPAT160AATCTTCTACTGGTACATGGARbclNFRbclNRCGACCGTACTTGTTCAACTTATRBCL321第一輪多CC重PCR引物CP4NFCP4NRGGCGACGCCTCGCTCACAAGCGTCATGATCGGCTCGATGCP4-EPSPS240TheprimeroftheBarNFBarNRACAAGCACGGTCAACTTCCACTCGGCCGTCCAGTCGTABARH5secondmultipleCryNFCryNRGGACAACAACCCAAACATCAACCrylA(B)152PCRGCACGAACTCGCTGAGCAGPatNFPatNRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCACTCTTGTGGTGTTTGTGGCPAT100(3)五重巢式PCR反應(yīng)體系(3.1)第一輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR緩沖液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，補(bǔ)水至50nL。擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性10min，IO個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO個(gè)循環(huán)(95。C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;60°C，60s;72°C，60s);10個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸lOmin。(3.2)第二輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件取第一輪五重PCR產(chǎn)物lpL作為模板，進(jìn)行五重巢式PCR第二輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系加引物混合液ni0^iL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴(kuò)增條件同第一輪反應(yīng)條件。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)。瓊脂糖膠濃度為3%，膠中溴化乙錠濃度為0.5^g/mL，電泳緩沖液為lxTAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min。(5)結(jié)果判定(5.1)對(duì)照樣品結(jié)果分析陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出RBCL基因片段，空白對(duì)照中沒(méi)有任何擴(kuò)增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測(cè)。(5.2)試樣檢測(cè)結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測(cè)該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分。b)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴(kuò)增，或擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測(cè)出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。本發(fā)明方法的有益效果在于多重巢式PCR是近幾年興起的檢測(cè)技術(shù)，它結(jié)合了巢式PCR的靈敏度高和多重PCR的操作簡(jiǎn)單、特異性高的特點(diǎn)，這兩種方法的結(jié)合不但可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的片段，而且可以使檢測(cè)的下限下降幾個(gè)數(shù)量級(jí)。多重巢式PCR的檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率、減少了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本，并可以有效減少假陽(yáng)性的結(jié)果，因此，可以應(yīng)用于對(duì)大豆、玉米和水稻的轉(zhuǎn)基因深加工食品進(jìn)行DNA檢測(cè)，具有實(shí)際意義。本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度為0.005%，即多重巢式PCR檢測(cè)體系可檢出轉(zhuǎn)CP4基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的量達(dá)0.005%以上的樣品。此檢測(cè)體系靈敏度高于Zimmermann等人用巢式PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測(cè)所得靈敏度(0.01%);而與Forte等靈敏度0.5%)，Germini等(靈敏度0.25%)，Delano等(靈敏度0.1%)應(yīng)用多重PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)相比，本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多重PCR。0.005%的靈敏度已經(jīng)達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平，可以完全滿足大豆、玉米和水稻深加工產(chǎn)品的檢測(cè)需要。另外，本發(fā)明方法對(duì)同一目的基因在不同品種和不同品系中的序列進(jìn)行分析，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，篩選出了可以在不同品種和不同品系中通用的引物進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)通量，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明方法選用了大豆、玉米和水稻中通用的內(nèi)參照基因RBCL基因作為內(nèi)源參照基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，克服現(xiàn)行的"一種植物一種檢測(cè)內(nèi)對(duì)照"的弊病，不但可有效地防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而且還可以提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)周期。綜上所述，本發(fā)明方法具有高效、快速、低成本、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)提供了一個(gè)有效的檢測(cè)方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值。本檢測(cè)方法有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值采用本發(fā)明方法進(jìn)行深加工制品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，通過(guò)2次PCR反應(yīng)即可檢測(cè)出樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米BTll、BT176、Mon810、轉(zhuǎn)BT基因水稻和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆，而用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要8次PCR反應(yīng)才能完成，成本降低4倍。另外，該方法將為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易提供有利的技術(shù)支撐，一方面，可以合理利用目前許多國(guó)家使用的，以轉(zhuǎn)基因安全設(shè)置的貿(mào)易技術(shù)壁壘，保護(hù)我國(guó)的農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)；另一方面，也可以保障我國(guó)的農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易可以根據(jù)不同國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理的要求，為企業(yè)提供準(zhǔn)確有效的檢測(cè)參數(shù)，促進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品和食品的國(guó)際貿(mào)易。為此，可以產(chǎn)生數(shù)億元的經(jīng)濟(jì)效益；此外，該方法還可以直接為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持，可以在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究階段、生產(chǎn)應(yīng)用和監(jiān)測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全研究、生產(chǎn)和商業(yè)化后的監(jiān)測(cè)是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全生產(chǎn)和管理的重要保證，是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物可持續(xù)發(fā)展不可缺少的。該技術(shù)成果對(duì)保證轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售、加工在有序的管理要求下進(jìn)行，其將為人民健康、環(huán)境安全和生物多樣性產(chǎn)生重要的影響。(四)圖1-圖2為待測(cè)樣品多重巢式PCR檢測(cè)示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明1、實(shí)驗(yàn)材料(1)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標(biāo)準(zhǔn)品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營(yíng)養(yǎng)麥片、玉米泥；(2)試劑WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR緩沖液(含MgC12)和DL-2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2、主要儀器設(shè)備高速離心機(jī)(上海安亭，TDL-40B)、PCR儀(德國(guó)Biometra，BiometraTgradient)、核酸電泳儀(杭州大合，GE-IOO)、紫外分光光度儀(美國(guó)BECKMAN，DU640)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP，G8000)。3、樣品檢測(cè)(1)樣品DNA提取將大豆、玉米、水稻標(biāo)準(zhǔn)品粉末及其它待檢樣品根據(jù)WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說(shuō)明分別進(jìn)行DNA提取，通過(guò)核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強(qiáng)度雙重測(cè)定樣品DNA濃度。(2)五重巢式PCR反應(yīng)在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加樣品DNA模板1^L(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR緩沖液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，補(bǔ)水至50pL。擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性10min，IO個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO個(gè)循環(huán)(95°C，30sec;60。C，60s;72。C，60s);IO個(gè)循環(huán)(95。C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取第一輪五重PCR產(chǎn)物lpL作為模板，進(jìn)行五重巢式PCR第二輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系加引物混合液IIl(HiL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴(kuò)增條件同第一輪反應(yīng)條件。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)。瓊脂糖膠濃度為3%，膠中溴化乙錠濃度為0.5pg/mL，電泳緩沖液為lxTAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min。結(jié)果如圖顯示，陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出RBCL基因，陽(yáng)性對(duì)照的CP4-EPSPS基因、RBCL基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。陰性對(duì)照結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果，排除轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果說(shuō)明擴(kuò)增體系正常，可以擴(kuò)增出目的基因；空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶說(shuō)明PCR反應(yīng)體系無(wú)污染。樣品卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴(kuò)增出RBCL基因和CP4-EPSPS基因片段，即以上4種樣品含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因成分；大豆精煉油大豆色拉油和玉米油未檢出任何條帶，即未從這3種樣品中提取出DNA;玉米淀粉和玉米泥擴(kuò)增出RBCL基因、CrylA(B)基因和PAT基因片段，即以上兩種樣品含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉擴(kuò)增出RBCL基因、CrylA(B)基因和BAR基因片段，即含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和BAR基因成分；營(yíng)養(yǎng)麥片擴(kuò)增出RBCL基因和CrylA(B)基因片段，即含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因成分。結(jié)合圖1-圖2，圖1為第一輪擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖，圖2為第二輪擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖，其中A，第一輪PCR擴(kuò)增；B，第二輪PCR擴(kuò)增；M，DL-2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，空白對(duì)照；2，陰性對(duì)照；3，陽(yáng)性對(duì)照；4，卵磷脂；5，大豆蛋白質(zhì)粉；6，巧克力飲品；7，嬰兒米粉;8，大豆精煉油；9，大豆色拉油；10，玉米油；11，玉米淀粉；12，玉米蛋白粉；13，營(yíng)養(yǎng)麥片；14，玉米泥。4、結(jié)果判定(1)對(duì)照樣品結(jié)果分析陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出RBCL基因片段，空白對(duì)照中沒(méi)有任何擴(kuò)增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測(cè)。(2)試樣檢測(cè)結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測(cè)該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分。b)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴(kuò)增，或擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測(cè)出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。權(quán)利要求1.一種糧食作物深加工制品高通量五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)方法為材料陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標(biāo)準(zhǔn)品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營(yíng)養(yǎng)麥片、玉米泥；試劑id="icf0001"file="A2008101374610002C1.tif"wi="13"he="3"top="82"left="42"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒，r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR緩沖液(含MgCl2)和DLDNA2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；(1)DNA提取(1.1)DNA提取將大豆、玉米、水稻標(biāo)準(zhǔn)品粉末及其它待檢樣品根據(jù)id="icf0002"file="A2008101374610002C2.tif"wi="13"he="3"top="113"left="124"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說(shuō)明分別進(jìn)行DNA提取；(1.2)DNA樣品濃度檢測(cè)DNA濃度通過(guò)核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強(qiáng)度雙重測(cè)定；(2)引物設(shè)計(jì)利用PrimerPremierV5.0軟件進(jìn)行五重巢式PCR的引物設(shè)計(jì)，用OligoV6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物，引物所擴(kuò)增目的片段及擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下表表多重巢式PCR所用引物序列及擴(kuò)增片段大小<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>(3)五重巢式PCR反應(yīng)體系(3.1)第一輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR緩沖液，引物混合液I10μL，DNA聚合酶4U，補(bǔ)水至50μL，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10min，10個(gè)循環(huán)(95℃，30sec；65℃，60s；72℃，60s)；10個(gè)循環(huán)(95℃，30sec；62℃，60s；72℃，60s)；10個(gè)循環(huán)(95℃，30sec；60℃，60s；72℃，60s)；10個(gè)循環(huán)(95℃，30sec；58℃，60s；72℃，60s)；最后72℃延伸10min；(3.2)第二輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件取第一輪五重PCR產(chǎn)物1μL作為模板，進(jìn)行五重巢式PCR第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系加引物混合液II10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴(kuò)增條件同第一輪反應(yīng)條件；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)，瓊脂糖膠濃度為3％，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳緩沖液為1×TAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min；(5)結(jié)果判定(5.1)對(duì)照樣品結(jié)果分析陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出RBCL基因片段，空白對(duì)照中沒(méi)有任何擴(kuò)增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測(cè)；(5.2)試樣檢測(cè)結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因均得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測(cè)該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分；b)RBCL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴(kuò)增，或擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測(cè)出CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因成分。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種糧食作物深加工制品五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，其檢測(cè)方法為1.DNA提取和濃度檢測(cè)；2.引物設(shè)計(jì)；3.第一、二輪五重巢式PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件；4.擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)；5.結(jié)果判定。本發(fā)明技術(shù)具有高通量、快捷、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的諸多優(yōu)點(diǎn)，不僅可以用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻的單一深加工制品，還可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻的混合深加工制品。本發(fā)明提高了檢測(cè)效率、減少了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本，并可以有效減少假陽(yáng)性的結(jié)果，因此，可以應(yīng)用于對(duì)主要糧食作物如大豆、玉米和水稻豆油等轉(zhuǎn)基因深加工食品進(jìn)行DNA檢測(cè)，具有實(shí)際意義。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101402996SQ20081013746公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者仇有文,營(yíng)劉,敖金霞,波曲,李慶章,袁肖寒,高學(xué)軍申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)