專利名稱：熒光光素酶氧化還原酶體外發(fā)光體系的建立的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光條件的確定，特別是涉及一種存在于海洋發(fā)光細菌胞內(nèi)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶在細胞外的發(fā)光表達。
背景技術(shù)：
據(jù)本發(fā)明人通過査閱資料、文獻檢索所知，發(fā)光細菌是指在正常的生理條件下，在細菌生長過程中伴隨有可見熒光發(fā)射的一類細菌，這種可見熒光波長在450-490nm之間，在黑暗處肉眼可見。
發(fā)光細菌的發(fā)光機理的研究表明，不同種類的發(fā)光細菌的發(fā)光機理是相同的，屬酶促氧化反應。是由分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶(LE)催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸(FMNH2)及八碳以上的長鏈脂肪醛(RCHO)氧化為FMN及長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發(fā)光強度在波長為450 490nm的藍綠光。
熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶共同存在下的酶促氧化反應的原理如下
FMN:NADH氧化還原酶對FMN有特異性，在NADH存在的條件下，將FMN還原為FMNH2，為發(fā)光酶促反應提供底物。熒光光素酶催化FMNH2和RCHO發(fā)生氧化還原反應，同時發(fā)出藍綠色熒光。目前國內(nèi)尚未有熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系的建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光的體系，實現(xiàn)熒光光素酶在活體細胞外的表達，并實現(xiàn)其催化發(fā)光的酶活性。
本發(fā)明通過提取發(fā)光細菌胞內(nèi)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑，通過優(yōu)化各種底物對酶促反應的影響，建立最佳的熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系。其特征是
(1) 最佳底物配比十二烷醛100nL (27mM)、 FMN-Na53nL (10mM)和NADH 200nL (0.14mM)，體系pH7.0。
(2) 發(fā)光檢測在微弱發(fā)光儀中進行，檢測條件是設置波長474nm， lmL酶液中，快速加入各底物，立刻進行定時跟蹤測定，連續(xù)測定間隔時間為ls。
本發(fā)明實現(xiàn)了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶在活體細胞外的表達，構(gòu)建了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系。該體系發(fā)光性能穩(wěn)定，發(fā)光強度高，底物配比簡便可行，并可實
現(xiàn)定量檢測。


附圖熒光光素酶單酶體外發(fā)光體系和熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體外發(fā)光體系發(fā)光性
能的比較。
具體實施方式
實施例1
將性狀良好的發(fā)光細菌種子液按接種量5%接種到300mL富集液體培養(yǎng)基中，25°C 150r/min條件卩恒溫培養(yǎng)。收集細胞懸浮液20mL， 4。C低溫離心(5000rpm， 5min)，棄上清，加入一定量PBS (5mL)，磁力振蕩器混勻，冰上超聲破碎，每個樣本超聲時間15秒，間隔30秒，粉碎15次，功率300W。提取獲得熒光光素酶粗酶液。
實施例2
lmL粗酶液中， 一次性快速加入底物12烷醛100nL (27mM)、 FMN-Na53pL (10mM)、 NADH 100nL(0.14mM)，進行發(fā)光檢測。
3發(fā)光檢測在微弱發(fā)光儀中進行，檢測條件是設置波長474nm，加入溶液或試劑后，立刻進行定時跟蹤測定，連續(xù)測定間隔時間為ls。當胞內(nèi)提取的熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑加入酶反應底物時，熒光光素酶催化底物發(fā)光。
實施例3
各取lmL粗酶液，分別對熒光光素酶單酶體外發(fā)光體系和熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體外發(fā)光體系的發(fā)光性能進行比較。
(1) 熒光光素酶單酶體外發(fā)光體系
lmL粗酶液中，分別加入不同濃度的底物十二垸醛100nL(27mM)、FMN-Na53nL(10mM)和Na2S204100nL (34mM)，體系pH 7.0。發(fā)光檢測在微弱發(fā)光儀中進行，檢測條件是設置波長474nm，迅速加入各反應底物，立刻定時跟蹤測定，連續(xù)測定間隔時間為ls。
(2) 熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體外發(fā)光體系,見實施例2
比較單、雙酶的發(fā)光強度和穩(wěn)定性，結(jié)果如圖所示，熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體系比熒光光素酶單酶體系發(fā)光更穩(wěn)定，高強度發(fā)光可持續(xù)的時間較長，發(fā)光減弱的程度要緩。且重復行好，更易操作。
權(quán)利要求
1 一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系的建立，其特征是(1)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶采用發(fā)光細菌胞內(nèi)提取的粗酶液(2)采用的最佳底物為十二烷醛、FMN-Na和NADH(3)體系pH7. 0
2.本發(fā)明中利用超聲破碎的方法提取熒光光素酶粗酶液。
3. 使用與權(quán)利要求1中類似性質(zhì)的酶促發(fā)光底物
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光條件的確定，特別是涉及一種存在于海洋發(fā)光細菌胞內(nèi)熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶在細胞外的發(fā)光表達。本發(fā)明的目的是建立一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光的體系，實現(xiàn)熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶在活體細胞外的表達，并實現(xiàn)其催化發(fā)光的酶活性。本發(fā)明通過提取發(fā)光細菌胞內(nèi)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑，通過優(yōu)化各種底物對酶促反應的影響，建立最佳的熒光光素酶體外發(fā)光體系。該體系發(fā)光性能穩(wěn)定，發(fā)光強度高，底物配比簡便可行，并可實現(xiàn)定量檢測。
文檔編號C12Q1/26GK101497918SQ20081014009
公開日2009年8月5日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者朱蘭蘭, 洪 林, 王靜雪 申請人:中國海洋大學