專利名稱：BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白工程領(lǐng)域，具體涉及一種BmNPV—家蠶幼蟲(chóng) 多基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
因?yàn)榫哂袑?duì)人及哺乳動(dòng)物安全、超強(qiáng)的多角體啟動(dòng)子(polh)驅(qū)動(dòng)外源基因 在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)方便、病毒操作簡(jiǎn)單、克隆外源片段能 力大(30-50kb)、表達(dá)產(chǎn)物具有正確后加工等特點(diǎn)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BES， Baculovirus Expresson System)已經(jīng)成為表達(dá)真核生物基因的優(yōu)秀表達(dá)系統(tǒng)之 -。目前，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的來(lái)源遍及病毒、細(xì)菌、真菌、 動(dòng)物和植物等各種生物，其應(yīng)用范圍涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 之間相互作用方面的基礎(chǔ)研究和疫苗生產(chǎn)、疾病診斷以及病毒殺蟲(chóng)劑的改良 等。目前主要使用兩種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)， 一種為商業(yè)化的AcNPV-sf9或者 AcNPV-High5系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用重組AcNPV在離體培養(yǎng)細(xì)胞sf9或者High5 中進(jìn)行外源基因表達(dá)。另外一種就是BmNPV (家蠶核型多角體病毒)-家蠶 幼蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用重組BmNPV在家蠶活體內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)。家蠶飼養(yǎng) 在我國(guó)具有悠久的歷史，其培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單，成本較低，其成本為細(xì)胞培養(yǎng)的 1/10，而蛋白表達(dá)量則為培養(yǎng)細(xì)胞的IO倍左右，因此BmNPV —家蠶幼蟲(chóng)表 達(dá)系統(tǒng)在經(jīng)濟(jì)高效大量表達(dá)外源蛋白方面具有極為誘人的前景和優(yōu)勢(shì)。
但是BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)也有其缺點(diǎn)由于轉(zhuǎn)移載體大小局限性， 一個(gè)供體質(zhì)粒最多只能攜帶4個(gè)外源基因表達(dá)盒，對(duì)于使用BmNPV-家蠶幼 蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因有很大的局限性。以生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLPs) 為例，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)2個(gè)以上的病毒結(jié)構(gòu)蛋白獲得VLPs —般有兩種 策略其一是構(gòu)建數(shù)個(gè)不同的重組桿狀病毒，每個(gè)桿狀病毒表達(dá)一個(gè)結(jié)構(gòu)基因， 再使用幾種重組桿狀病毒同時(shí)感染細(xì)胞，讓同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)幾個(gè)結(jié)構(gòu)蛋 白，再自我組裝成VLPs。另外一種方法就是通過(guò)攜帶多個(gè)啟動(dòng)子的供體質(zhì)粒， 同時(shí)將多個(gè)目的基因克隆到NPV基因組中，只需要一種重組桿狀病毒感染昆
蟲(chóng)細(xì)胞即可表達(dá)幾個(gè)目的蛋白，然后再組裝成VLPs.早期多以前一種方式為 主，該方法操作比較繁瑣，需要構(gòu)建幾個(gè)重組桿狀病毒，在感染過(guò)程中因難以
保證多個(gè)桿狀病毒同時(shí)進(jìn)入每一個(gè)細(xì)胞，可能會(huì)造成VLPs組裝量較少。隨著 構(gòu)建重組桿狀病毒技術(shù)的發(fā)展，尤其同時(shí)克隆多個(gè)(2 4)表達(dá)盒技術(shù)的出現(xiàn)， 目前多使用后一種技術(shù)獲得VLPs，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單，VLPs產(chǎn)出量較高，但 由于BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)在多基因表達(dá)方面的局限性，限制了使用其 生產(chǎn)VLPs的廣泛利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種BmNPV —家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方 法，可引入多個(gè)基因到BmBacmid中，在家蠶細(xì)胞或幼蟲(chóng)中實(shí)現(xiàn)高效經(jīng)濟(jì)表 達(dá)多個(gè)基因或者蛋白復(fù)合物，特別是為BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)生產(chǎn)病毒樣顆粒 (VLPs)提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明BmNPV —家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建方法按下述步驟實(shí)現(xiàn) (1)將阿拉伯糖啟動(dòng)子(pBAD)控制的I-Scel表達(dá)盒重組到DH10B的 基因組中獲得新的受體菌I-Scel DH10B; (2)結(jié)合轉(zhuǎn)移用供體質(zhì)粒的構(gòu)建； (3) Cre/loxp重組位點(diǎn)取代BmBacmid基因組中的v-caA和基因，2個(gè) I-Scel位點(diǎn)取代BmBacmid中的/ 70基因獲得受體I-scelBmMultibac; (4)利 用cre-loxp重組、Tn7重組和結(jié)合轉(zhuǎn)移三種方法引入外源基因；(5)常規(guī)方法 制備重組BacmidDNA并轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞或者注射家蠶幼蟲(chóng)。
本發(fā)明的理論依據(jù)細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)移能夠方便地實(shí)現(xiàn)DNA在細(xì)菌間的傳 遞，轉(zhuǎn)移載體進(jìn)入受體細(xì)菌后可以通過(guò)誘導(dǎo)受體細(xì)菌表達(dá)歸位酶將載體線性 化，同時(shí)表達(dá)重組酶將目的片段重組到合適的受體中，從而獲得重組桿狀病毒。 Cre/loxp和Tn7特異性重組作為兩種不同的重組方式，在各自輔助酶的幫助下 實(shí)現(xiàn)同源重組，獲得重組桿狀病毒。這三種獲得重組桿狀病毒的方式不同，三 者之間沒(méi)有相互影響，結(jié)合使用可以實(shí)現(xiàn)BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)的多基因表達(dá)。
有益效果
本發(fā)明同時(shí)利用cre-loxp重組位點(diǎn)、Tn7重組位點(diǎn)和結(jié)合轉(zhuǎn)移三種方法引 入外源基因可以實(shí)現(xiàn)BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)的多基因表達(dá)。本發(fā)明獲得BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)，不但可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因多拷貝數(shù)的表達(dá)，還可以同
時(shí)表達(dá)多達(dá)12個(gè)外源基因，為研究多亞基蛋白、蛋白與蛋白之間相互作用以 及制備病毒樣顆粒奠定基礎(chǔ)。


圖1是供體質(zhì)粒pHTdual示意圖。該質(zhì)粒含有順式激活元件oriT負(fù)責(zé)質(zhì)
粒pHTdual的轉(zhuǎn)移，PplO和Ppolh兩個(gè)桿狀病毒強(qiáng)啟動(dòng)子，能同時(shí)驅(qū)動(dòng)2個(gè)
目的基因表達(dá)。
圖2是三種方式構(gòu)建多基因表達(dá)重組桿狀病毒流程圖。
圖3是利用可變模塊將4一6個(gè)基因同時(shí)克隆到轉(zhuǎn)移載體示意圖。
圖4是攜帶雙熒光報(bào)告基因重組桿狀病毒在BmN細(xì)胞中的表達(dá)，其中(A)
是使用488nm激光觀察感染72小時(shí)后的BmN細(xì)胞，(B)是同一視野下512nm
激光觀察感染72小時(shí)后的BmN細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍，下列實(shí)施例中未注明具 體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版
社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；孫明主編，高等教育出版社，2006， 基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚倫廣編著)；黎路林編著，華中師范 大學(xué)出版社，1996，桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，或按照制造廠商的操作指南所建 議的方法進(jìn)行。
實(shí)施例1:構(gòu)建桿狀病毒-家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)的方法 (1)供體質(zhì)粒的構(gòu)建
如圖1所示，順式激活元件oriT來(lái)原于F因子，負(fù)責(zé)供體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。 具體構(gòu)建過(guò)程如下Zeocin抗性基因(Em7-ZeoR)經(jīng)PCR擴(kuò)增而來(lái)，其兩 段分別加上了 2個(gè)同源臂序列(HL和HR)， 2個(gè)I-Scel位點(diǎn)，以及BstBI，SacI， pmeI,AvrII等酶切位點(diǎn)。其上下游引物分別為ZeoR-F: 5'-TTCGAATAGGG
CATTTGAGGATGCAGCACGTGTTGACAA-3，； ZeoR隱R : 5，-GAGCTCTAGG
TTTCATTATGTTTAAACCCTAGGAGGTCGACCCCCCTC-3，。 PCR產(chǎn)物首先 克隆T載體獲得重組pSimple-Em7zeo，然后Ncol /Sail雙酶切去掉Zeocin編 碼區(qū)，保留Em7啟動(dòng)子?；厥蘸蟮妮d體和來(lái)源于相同酶切pCohygro產(chǎn)物 hygromycin編碼區(qū)相連，獲得Em7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hygromycin表達(dá)盒。雙酶切 后，該Em7-Hygromycin片段與經(jīng)同樣雙酶切pMAGICI的R6kori+oriT產(chǎn)物進(jìn) 行連接，獲得中間過(guò)渡載體pHTdual-prel。 pmel/Avrll雙酶切pFBDM獲得含 p10和polh啟動(dòng)子片段，將該片段與pmel/Avrll酶切的pHTdual-prel相連， 獲得結(jié)合轉(zhuǎn)移載體pHTdual。
(2) 受體菌I-ScelDH10B構(gòu)建
首先將可誘導(dǎo)阿拉伯糖啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的I-Scel表達(dá)盒引進(jìn)DH10B基因組 中。質(zhì)粒pML104含有由半乳糖啟動(dòng)子(Plac)控制的重組酶基因red和gam ， 經(jīng)CaCl2轉(zhuǎn)化進(jìn)DH10B。將DH10B/pmll04于3(TC培養(yǎng)至OD6o。約為0.2，加 入IPTG (0.4 mM)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，以誘導(dǎo)重組酶RED和GAM表達(dá)。質(zhì)粒 pML294含有插入umuC基因HindIII位點(diǎn)的I-scel表達(dá)盒和帶FRT側(cè)翼序列的 卡鈉霉素抗性基因(ParaBAD-I-Scel-FRT-npt-FRT: umuC)， EcoRI/Kpnl雙酶 切切下該片段，再電轉(zhuǎn)化進(jìn)IPTG誘導(dǎo)過(guò)的DH10B/pML104感受態(tài)細(xì)胞，卡 那霉素抗性篩選出陽(yáng)性菌落。在重組酶作用下，ParaBAD-I-Scel-FRT-npt-FRT 片段被同源重組進(jìn)DH10B基因組的umuC位相。接著將pcp20轉(zhuǎn)化進(jìn)陽(yáng)性菌 落，于3(TC培養(yǎng)2小時(shí)。由于溫度敏感型質(zhì)粒pcp20能夠表達(dá)FLP位點(diǎn)特異 性重組酶，其表達(dá)的Flp重組酶能夠切除掉DH10B基因組中的npt表達(dá)盒 (knR)，獲得無(wú)卡那霉素抗性菌落，最后通過(guò)42'C培養(yǎng)去掉pcp20，獲得能夠 表達(dá)I-SceI的目的菌株I-SceIDHlOB。 —
(3) 受體BmBacmid的改造 、
原始BmBacmid只有Tn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，缺乏其他二種引入外源基因的方式， 因此必須對(duì)BmBacmid進(jìn)行改造。首先使用同源重組方式在BmBacmid的 v-cath和chitin位相引入Cre/LoxP位點(diǎn)。以pVgRxR為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 出含F(xiàn)RT序列的Zeocin表達(dá)盒，引物分別為
tgcagcacgtgttgac和FRTZeodown:aGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAG
GAACTTCGATATCgaggtcgacccccctc (大寫(xiě)字母為FRT序歹lj) ， PCR產(chǎn)物克隆 到pMD18T載體，獲得重組載體pMD18T-FRT-Zeocin- FRT。然后以BamHI /Sphl切下FRT-Zeocin-FRT片段，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平后，克隆到同樣平末 端化的pUCDM的pmel/BamHI位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pUCDM- FRT-zeocin-FRT 。接著將該載體以SacII/BstBI切下含Cre/LoxP位點(diǎn)的片段 FRT-zeocin-FRT-loxP備用。設(shè)計(jì)引物以BmBacmid為模板，擴(kuò)增出v-cath和 chitin 基因.引物分另U為CHTINup: AGTATACGCG TTGAGC AAGTCGCCGTTATCGG禾Q CATHdown: AGTATACCCTGAAAAATCCGT CCTCTCCCC (下劃線為BstZ171位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物克隆到pMD18TSimple，獲 得pMD18TS—VC，用SacII/BstBI切開(kāi)載體，和原來(lái)的FRT-zeocin-FRT-loxP 相連，獲得重組載體pMD18TS-VC/loxp-frt-zeocin。用BstZ171切下片段，電 轉(zhuǎn)化進(jìn)行DH10BmBacmid/pML104中，獲得zeocin陽(yáng)性菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證后 轉(zhuǎn)化進(jìn)pcp20去掉zeocin抗性基因，獲得引進(jìn)loxP位點(diǎn)的BmMultibac。
由于供體質(zhì)粒pHTdual中已經(jīng)含有p10啟動(dòng)子，為了避免在構(gòu)建重組 BmBacmid時(shí)出現(xiàn)意外重組，BmBacmid中自身存在的p10啟動(dòng)子必須去掉， 同時(shí)在BmBacmid中引入2個(gè)I-Scel位點(diǎn)。以pFBDM為模板，PCR擴(kuò)增出 抗性基因GmR ，設(shè)計(jì)引物在其兩側(cè)分別引入50 nt同源重組臂和18bp的I-Secl 位點(diǎn)。上下游的引物序列分別為Gm-F: 5，-TACGCATCACTTACAACAG
T ATTAATATTCCGGAGT-3，(斜體表示50nt同源左臂，下劃線為I-Scel) ; Gm-R
A GGGATAACAGGGTAATGGCGTTGTGACAATTTAC-3，(斜體表示50nt同 源右臂)。PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化進(jìn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的DH10B/BmMultibac/pML104中， 在重組酶的作用下，Gm表達(dá)盒及2個(gè)I-Scel位點(diǎn)經(jīng)同源重組取代BmMultibac 的p10及p74基因。Gm抗性和藍(lán)白斑篩選獲得的藍(lán)色菌落經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證后 獲得陽(yáng)性菌落命名為I-sceIBmMultibac。提取I-scel BmMultibac DNA電轉(zhuǎn)化 進(jìn)入受體菌I-Scel DH10B，獲得I-Scel DH10B/I-sceIBmMultibac。 (4)外源基因的引入
如圖2所示，首先利用結(jié)合轉(zhuǎn)移方法獲得重組桿狀病毒將目的基因克隆
到供體載體pHTdual并轉(zhuǎn)化進(jìn)BUN20，供體菌BUN20/pHTdual于含50嗎ml" 的Hygromycin和12.5pgmr1四環(huán)素的LS (低鹽)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。受體菌I-Secl DH10B/ I-scel BmMultibac/ pML104于含50pg ml"壯觀霉素，50pg ml"卡那 霉素的LS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)夜后離心收集細(xì)菌，然后用含0.4mM IPTG 的LS培養(yǎng)基分別以1:100和1:200的比例稀釋供體和受體菌，于30°C培養(yǎng) 2h至OD600約為0.2。按l: 1比例混合供體和受體菌。先37。C靜置培養(yǎng)混 合菌2小時(shí)，再150rpm搖床培養(yǎng)2小時(shí)，最后將菌液稀釋1000倍，涂布于含 50嗎ml—1的卡那霉素，50嗎mr1的hyg匪ycin的LS平板上，置42°C培養(yǎng) 過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆37'C振蕩培養(yǎng)獲得重組BmBacmid。利用cre-loxp位點(diǎn)特 異性重組引入外源基因如圖3所示，由于供體質(zhì)粒pUCDM可以克隆多達(dá)4 個(gè)基因，通過(guò)這種方式可以將另外4個(gè)基因引入前述所構(gòu)建的重組BmBacmid 之中。首先使用常規(guī)方法將目的基因克隆到供體pUCDM中，獲得攜帶多個(gè)目 的基因的重組供體。將能表達(dá)ere-loxp重組酶的質(zhì)粒pBADHisCre轉(zhuǎn)化進(jìn)受體 菌I-SceIDH10B/I-sceI BmMultibac中，加阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶產(chǎn)生，然后將 重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌I-Scel DH10B/I-scel BmMultibac中，經(jīng)過(guò)抗性篩選獲 得重組菌落。接著利用Tn7轉(zhuǎn)座方式引入外源基因由于供體質(zhì)粒pFBDM可 以克隆多達(dá)4個(gè)基因，通過(guò)這種方式可以將另外4個(gè)基因引入前述所構(gòu)建的重 組BmBacmid之中，具體操作方法見(jiàn)Bac-to-Bac使用手冊(cè)。這樣即可以在同 一 BmBacmid中引入多達(dá)12個(gè)外源基因。 (5)重組桿狀病毒的產(chǎn)生
按照常規(guī)堿裂解方法從大腸桿菌中制備重組BmBacmid DNA，然后使用 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)BmN細(xì)胞，或者直接注射家蠶幼 蟲(chóng)，5 7天后即可以收獲重組病毒粒子和進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化分析。
實(shí)施例2:攜帶雙熒光報(bào)告基因重組病毒的構(gòu)建及其表達(dá)
(1)重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)實(shí)施例l中(1)步驟制作方法獲得供體載體pHTdual， pDsRed2-l經(jīng) BamHI/Notl酶切，回收紅色熒光蛋白基因DsRed片段，克隆到載體pHTdual， 得到重組質(zhì)粒pHTdual-DsRed。 pIRES-gQ)經(jīng)Smal/Xho1酶切，回收綠色熒光
蛋白基因gfp片段，克隆到載體pUCDM得到重組質(zhì)粒pUCDM-gfp。
(2)受體菌受體菌I-SceI DH10B的構(gòu)建；(3)受體BmBacmid的改造；
(4)獲得重組BmBacmid; (5)重組病毒產(chǎn)生的方法分別按照實(shí)施例1中的(2)、
(3)、 (4)、 (5)步驟制作。
(6)重組病毒在細(xì)胞中的表達(dá)
如圖4(A)、 (B)所示，Bacmid-Red-gfp分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染方 法參考Lipofectamine2000產(chǎn)品說(shuō)明。轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞72h后，在熒光顯微鏡下 進(jìn)行熒光觀察。488nm觀察綠色熒光，512nm觀察紅色熒光。Bacmid-Red-gfp 轉(zhuǎn)染的BmN細(xì)胞在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)射出綠色熒光和紅色熒光，或者單個(gè)細(xì) 胞完全不發(fā)光，表明利用本系統(tǒng)構(gòu)建的重組BmBacmid DNA仍然保持著對(duì) BmN細(xì)胞的感染性，多基因表達(dá)系統(tǒng)BmMultiBac可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。
權(quán)利要求
1.一種BmNPV—家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建方法，其特征在于該構(gòu)建方法按下列步驟順序完成(1)將阿拉伯糖啟動(dòng)子(pBAD)控制的I-SceI表達(dá)盒重組到E.coli DH10B的基因組中獲得新的受體菌I-SceI DH10B；(2)結(jié)合轉(zhuǎn)移用供體質(zhì)粒的構(gòu)建；(3)cre/loxp重組位點(diǎn)取代BmBacmid基因組中的v-cath和chitin基因，2個(gè)I-SceI位點(diǎn)取代BmBacmid中的p10基因獲得受體I-sceI BmMultibac；(4)利用cre-loxp重組、Tn7重組和結(jié)合轉(zhuǎn)移三種方法引入外源基因；(5)常規(guī)方法制備重組Bacmid DNA并轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞或者注射家蠶幼蟲(chóng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建方法，按下列步驟順序完成(1)將阿拉伯糖啟動(dòng)子(pBAD)控制的I-SceI表達(dá)盒重組到E.coli DH10B的基因組中獲得新的受體菌I-SceI DH10B；(2)結(jié)合轉(zhuǎn)移用供體質(zhì)粒的構(gòu)建；(3)cre/loxp重組位點(diǎn)取代BmBacmid基因組中的v-cath和chitin基因，2個(gè)I-SceI位點(diǎn)取代BmBacmid中的p70基因獲得受體I-sceI BmMultibac；(4)利用cre-loxp重組、Tn7重組和結(jié)合轉(zhuǎn)移三種方法引入外源基因；(5)常規(guī)方法制備重組Bacmid DNA并轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞或者注射家蠶幼蟲(chóng)。本發(fā)明獲得BmNPV-家蠶幼蟲(chóng)多基因表達(dá)系統(tǒng)，為研究多亞基蛋白、蛋白與蛋白之間相互作用以及制備病毒樣顆粒奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101372697SQ20081014064
公開(kāi)日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者飛 劉, 劉宗才, 姚倫廣, 孫京臣, 張二輝, 闞云超 申請(qǐng)人:南陽(yáng)師范學(xué)院