專利名稱：：使用蠶培養(yǎng)擬青霉的菌種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使用蠶作為宿主來培養(yǎng)擬青霉(中文名為冬蟲夏草)。更具體地講，本發(fā)明涉及一種包括向蠶的幼蟲接種擬青霉以及從中誘導(dǎo)擬青霉的子實體的步驟的擬青霉的培養(yǎng)。冬蟲夏草是一種在昆蟲的幼蟲和蛹上寄生的活的真菌。有些冬蟲夏草已用于醫(yī)療目的并且分布在許多國家，例如中國、尼泊爾、日本、南美、韓國等。冬蟲夏草的一種典型的感染途徑為傳染感染，其中的分生孢子分散開來并粘附到宿主昆蟲的表皮上。粘附的分生孢子在適宜的溫度和濕度條件下萌發(fā)并且滲透入昆蟲體內(nèi)。然后，生長于昆蟲身體內(nèi)部的菌絲在該昆蟲的表皮上誘導(dǎo)出子實體。于是被感染的昆蟲死亡。上述冬蟲夏草的子實體由柄以及位于其末端的果實部分組成，其大小為1.5～10厘米。而且根據(jù)物種的不同，冬蟲夏草呈絲狀、棒狀或圓柱狀并具有如白色、黑色、紅色、褐色等多種顏色。冬蟲夏草已知為一種具有抗多種疾病的藥效學(xué)效果的藥用真菌。例如，在中國已把它作為一種用于永葆青春的神秘藥物。此外還報道了冬蟲夏草可以保護肺部并且能夠提高腎臟的功能。而且中國古藥典證類本草(Jungrubonso)聲稱在抗不同的疾病方面加蛹昆草(Yongchuso)和亞香棒蛹(Ahyangbongchuso)這樣的不同的物種是有效的。在日本，本草書(Bonsosu)(1801)也指出冬蟲夏草在抵抗肺部疾病和胸膜炎方面可以作為一種靈驗的藥物而銷售。近來，為了評價在這些古藥典中所示的冬蟲夏草的藥效學(xué)效果，人們已經(jīng)進行了許多研究。結(jié)果，報道了冬蟲夏草的提取物含有能夠增強免疫系統(tǒng)并因而可以促進細(xì)胞和體液的免疫力并提高對多種腫瘤和病毒的抵抗力的物質(zhì)。在瑞士進行的臨床試驗報道了一個病例，其中通過把冬蟲夏草的提取物向一個對藥物有癮的病人給藥兩周，可以保護該病人免受藥物的誘惑和副作用。而且，該病人最終恢復(fù)正常狀態(tài)。也已知冬蟲夏草具有減輕疲勞和壓力的功效。由于冬蟲夏草所具有的多種功效，為了把其提取物加入藥物組合物或者飲料中現(xiàn)已進行并且正在進行有關(guān)冬蟲夏草的許多研究。盡管在全世界分布有300種或者更多種的冬蟲夏草，但是和其它的真菌或者藥用植物相比由于其尺寸小，分布密度低，所以在獲得用于確定其藥理學(xué)效果和臨床試驗的完全所需的數(shù)量是困難的。此外，由于冬蟲夏草的效果隨物種變化很大，所以這一困難是如此巨大甚至?xí)?。在這種條件下，本發(fā)明的關(guān)鍵在于培養(yǎng)冬蟲夏草。首先，研究人員已經(jīng)從關(guān)于生長在大自然中的冬蟲夏草的物種、其宿主、感染途徑和誘導(dǎo)子實體的條件的研究中獲得了信息。然后，他們制定了一套適宜的宿主昆蟲和培養(yǎng)條件。在這些信息的基礎(chǔ)上，研究人員可以確定冬蟲夏草物種的特征。由于同一研究結(jié)果，本發(fā)明也得以完成。首先由于已經(jīng)很好地建立了蠶的飼養(yǎng)方法，所以本發(fā)明的發(fā)明人選擇蠶作為培養(yǎng)中的宿主昆蟲。而且，由于蠶本身也已用作一種藥用材料，所以人們認(rèn)為蠶作為一種宿主昆蟲更為優(yōu)選。隨后他們進行了實驗以便于找到能夠使用蠶作為宿主昆蟲的冬蟲夏草菌株。結(jié)果是他們發(fā)現(xiàn)擬青霉可以使用蠶作為宿主。因此，本發(fā)明的一個目的為提供一種擬青霉的培養(yǎng)。上述以及其它的目的可以通過培養(yǎng)得以實現(xiàn)，其中的培養(yǎng)包括以下步驟(a)在26～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下，將擬青霉孢子的稀釋物接種到蠶的第4齡～第5齡幼蟲中；以及(b)通過維持上述幼蟲處于15～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下來誘導(dǎo)擬青霉的子實體。從以下詳細(xì)的描述中，本發(fā)明的上述以及其它的目的和特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。圖1為表示寄生在鱗翅目的蛹上的野生Paecilomycesjaponica的照片。圖2為表示根據(jù)本發(fā)明進行人工培養(yǎng)的Paecilomycesjaponica的照片。圖3為表示寄生在鱗翅目的蛹上的野生擬青霉J300(Paecilomycessp.J300)的照片。圖4為表示根據(jù)本發(fā)明進行人工培養(yǎng)的擬青霉J300的照片。圖5為表示寄生在鱗翅目的蛹上的野生粉質(zhì)擬青霉(Paecilomycesfarinosa)的照片。圖6為表示根據(jù)本發(fā)明進行人工培養(yǎng)的粉質(zhì)擬青霉的照片。根據(jù)本發(fā)明，擬青霉的培養(yǎng)包括以下步驟(a)在26～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下，將擬青霉孢子的稀釋物接種到蠶的第4齡～第5齡幼蟲中；以及(b)通過維持上述幼蟲處于15～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下來誘導(dǎo)擬青霉的子實體。在下文中將更為詳細(xì)地描述本發(fā)明的培養(yǎng)。本發(fā)明的特征在于選擇蠶作為該培養(yǎng)中的宿主昆蟲。在對不同的野生冬蟲夏草進行研究以判斷該野生的冬蟲夏草是否能感染作為宿主昆蟲的蠶的基礎(chǔ)上已經(jīng)完成了本發(fā)明。在表1中顯示出結(jié)果。</tables>如表1所示，冬蟲夏草隨著其菌種的不同而具有不同的宿主昆蟲。因此，本發(fā)明的特征在于提供擬青霉作為能夠使用蠶作宿主昆蟲的冬蟲夏草。在本發(fā)明中使用的擬青霉可以包括Paecilomycesjaponica、擬青霉J300和粉質(zhì)擬青霉，但并不局限于此。根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)在韓國的小山丘中采集到的野生型Paecilomycesjaponica(圖1)的孢子便可以提供大量的Paecilomycesjaponica。也就是說，把野生型的Paecilomycesjaponica的孢子接種到PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基或未凈化的(uncleaned)大米培養(yǎng)基上并且在20～25℃的溫度下溫育30～40天以誘導(dǎo)菌絲。從這種誘導(dǎo)出的菌絲中獲得用于人工培養(yǎng)的親代菌株。從通過噴灑把親代菌株的孢子接種到蠶的表皮上而感染的蛹中得到黃色的子實體。如此得到的Paecilomycesjaponica已于1996年11月29日保藏在韓國漢城的韓國微生物保藏中心(KoreanCultureCollectionofMicro-organisms)(KoreanFoundationofCultureCollection)中并收到人藏登記號為“KFCC-10939”。在1997年11月27日，將該保藏物轉(zhuǎn)化成按照布達佩斯條約的保藏物并收到保藏登記號為“KCCM-10117”。Paecilomycesjaponica(KCCM-10117)是一種屬于絲狀真菌中的不完全真菌的典型菌株并且具有許多不同昆蟲的宿主。它主要寄生在鱗翅目的幼蟲和蛹上并生成一種象樹一樣具有1～10個分枝的黃色的子實體。子實體的大小為1.7～4.5厘米，并且白色粉末狀的分生孢子數(shù)不勝數(shù)地存在于果實部分(圖2)。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)在韓國的小山丘中采集到的野生型擬青霉J300(圖3)的孢子便可以提供大量的擬青霉J300。也就是說，把野生型的擬青霉J300的孢子接種到PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基或未凈化的大米培養(yǎng)基上并且在20～25℃的溫度下溫育30～40天以誘導(dǎo)菌絲。從這種誘導(dǎo)出的菌絲中獲得用于人工培養(yǎng)的親代菌株。從通過噴灑把親代菌株的孢子接種到蠶的表皮上而感染的蛹中得到子實體。該子實體由淡褐色的柄和白色的頭部組成，其大小為2.0～3.0厘米。而且位于該子實體頭部的子囊果是裸果。如此得到的擬青霉J300已于1996年11月29日保藏在韓國漢城的韓國微生物保藏中心(KoreanCultureCollectionofMicro-organisms)(KoreanFoundationofCultureCollection)中并收到入藏登記號為“KFCC-10938”。在1997年11月27日，將該保藏物轉(zhuǎn)化成按照布達佩斯條約的保藏物并收到登記號為“KCCM-10116”。擬青霉J300(KCCM-10116)是一種屬于絲狀真菌中的不完全真菌的典型菌株并且具有許多不同昆蟲的宿主。它主要寄生在鱗翅目的蛹上。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)在韓國的小山丘中采集到的野生型粉質(zhì)擬青霉(圖5)的孢子便可以提供大量的粉質(zhì)擬青霉。也就是說，把野生型的粉質(zhì)擬青霉的孢子接種到PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基或未凈化的大米培養(yǎng)基上并且在20～25℃的溫度下溫育30～40天以誘導(dǎo)菌絲。從這種誘導(dǎo)出的菌絲中獲得用于人工培養(yǎng)的親代菌株。從通過噴灑把親代菌株的孢子接種到蠶的表皮上而感染的蛹中得到白色棒狀的子實體。遵照布達佩斯條約，將如此得到的粉質(zhì)擬青霉于1997年11月27日保藏在韓國漢城的韓國微生物(KoreanCultureCollectionofMicro-organisms)(KoreanFoundationofCutureCollection)中并收到入藏登記號為“KCCM-10115”。粉質(zhì)擬青霉(KCCM-10115)是一種屬于絲狀真菌中的不完全真菌的典型菌株并且具有許多不同昆蟲的宿主。它主要寄生在鱗翅目的幼蟲和蛹上并生成一種白色的棒狀子實體。子實體的大小為1.0～2.0厘米，并且白色粉末狀的分生孢子數(shù)不勝數(shù)地存在于果實部分(圖6)。擬青霉可以使用蠶作為宿主昆蟲進行人工培養(yǎng)。因此，通過以下的描述將更為詳盡地解釋擬青霉的培養(yǎng)。首先通過噴灑擬青霉孢子的稀釋物，將擬青霉接種到蠶的表皮上。該稀釋物是通過在來凈化的大米培養(yǎng)基上溫育擬青霉的孢子，然后用水稀釋至濃度為107～108個孢子/毫升來制備的。然后在26～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下、具體大約為90％的濕度下，向蠶的第4齡～第5齡幼蟲的表皮中接種15～24小時。接種后，在諸如根據(jù)常規(guī)方法的溫度和濕度的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)被感染的蠶，例如每天向蠶中加入桑樹葉2～4次。15天后將被感染的蠶轉(zhuǎn)移到內(nèi)部充滿了白色菌絲的變硬的蛹中。為了誘導(dǎo)子實體，在15～30℃的溫度以及大約90％或者更高的濕度下、具體大約90％的濕度下維持這種變硬的蛹。1～5天后，淺白色的菌絲出現(xiàn)在蛹的表皮上。并且再過1～5天后開始誘導(dǎo)出子實體。再經(jīng)30～40天后便得到了平均大小為2.0～3.0厘米的子實體。通過以下的實施例將更為詳盡地解釋本發(fā)明。以下的實施例僅僅是解釋性的并且應(yīng)當(dāng)了解到本發(fā)明并不限于這些實施例。<實施例1>為了確定在人工培養(yǎng)中的接種條件，在諸如濃度、濕度、溫度以及蠶的年齡等不同條件下研究了感染率。結(jié)果示于表2中。接種條件如表2所示，當(dāng)在29～30℃、95％的濕度下通過噴灑108個孢子/毫升的稀釋物來把Paecilomycesjaponica(KCCM-10117)、擬青霉J300(KCCM-10116)或者粉質(zhì)擬青霉(KCCM-10115)的孢子接種到蠶的第五齡幼蟲上時，表明其感染率較高。<實施例2>為了確定用于誘導(dǎo)擬青霉的子實體的條件，在如溫度和濕度的不同條件下測量子實體的誘導(dǎo)率及大小。結(jié)果示于表3中。如表3所示，當(dāng)在29～30℃、95％的濕度下維持用擬青霉感染的蛹時，從該蛹中可以誘導(dǎo)該子實體。更具體地講，對Paecilomycesjaponica(KCCM-10117)而言在20～26℃、對擬青霉J300(KCCM-10116而言在18～24℃，以及對粉質(zhì)擬青霉(KCCM-10115)而言在15～24℃下，子實體的誘導(dǎo)率最高。被感染的蛹維持的時間越長，獲得的子實體的大小就越大。但是，由于通過蛹的營養(yǎng)物的損失子實體的重量會減小并且通過過度的生長其新鮮度會下降，所以優(yōu)選在維持子實體20～40天后收獲該子實體。與野生的擬青霉相比，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)人工培養(yǎng)的擬青霉可以誘導(dǎo)許多子實體。因此，擬青霉的大規(guī)模生產(chǎn)是可能的。再者，由于擬青霉具有多種藥效學(xué)效果，所以可以期望根據(jù)本發(fā)明的擬青霉的大批量供應(yīng)對促進人類的健康以及增強體質(zhì)會作出貢獻。權(quán)利要求1.一種擬青霉的培養(yǎng)，該培養(yǎng)包括以下步驟(a)在26～30℃的溫度以及約為90％或者更高的濕度下，將擬青霉孢子的稀釋物接種到蠶的第4齡-第5齡幼蟲中；以及(b)通過維持上述幼蟲處于15～30℃的溫度以及約為90％或者更高的濕度下來誘導(dǎo)擬青霉的子實體。2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)，其中所說的稀釋物是通過用水將擬青霉的孢子稀釋到濃度為107～108個孢子/毫升來制備的。3.權(quán)利要求1的培養(yǎng)，其中所說的擬青霉為Paecilomycesjaponica(KCCM-10117)，并且其中所說的步驟(a)是針對蠶的第五齡幼蟲使用一種含有大約108個孢子/毫升的稀釋物來進行的，所說的步驟(b)是在20～26℃的溫度以及大約95％的濕度下進行的。4.權(quán)利要求1的培養(yǎng)，其中所說的擬青霉為擬青霉J300(KCCM-10116)，并且其中所說的步驟(a)是針對蠶的第五齡幼蟲使用一種含有大約108個孢子/毫升的稀釋物來進行的，所說的步驟(b)是在18～24℃的溫度以及大約95％的濕度下進行的。5.權(quán)利要求1的培養(yǎng)，其中所說的擬青霉為粉質(zhì)擬青霉(KCCM-10115)，并且其中所說的步驟(a)是針對蠶的第五齡幼蟲使用一種含有大約108個孢子/毫升的稀釋物來進行的，所說的步驟(b)是在15～24℃的溫度以及大約95％的濕度下進行的。全文摘要本文公開了一種具有如抗腫瘤和增強免疫力等多種效果但卻因為相對有限的供應(yīng)而不能為人類廣泛使用的擬青霉的培養(yǎng)。擬青霉的人工培養(yǎng)包括以下步驟:(a)在26～30℃的溫度以及大約90%或者更高的濕度下,將用水稀釋至濃度為10文檔編號C12N1/14GK1184154SQ9712031公開日1998年6月10日申請日期1997年12月4日優(yōu)先權(quán)日1996年12月5日發(fā)明者趙世衍,池相德,林秀浩申請人:大韓民國農(nóng)村振興廳