專(zhuān)利名稱(chēng)：捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因的獲得方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)浙江株微粒體氨肽 酶基因的獲得方法及其用途。
背景技術(shù)：
捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(/faemo"c/zwscowtom^)是牛、羊等反芻動(dòng)物的主要寄生性 線(xiàn)蟲(chóng)，引起的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)病每年給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的經(jīng)濟(jì)損 失。藥物防治是控制該病的主要方法，但線(xiàn)蟲(chóng)耐藥性的日益嚴(yán)重以及藥物殘留 的出現(xiàn)制約了己有抗線(xiàn)蟲(chóng)藥物的長(zhǎng)久使用。疫苗研制作為一種新的防治策略已 成為研究的熱點(diǎn)。
微粒體氨肽酶Hll是一種分子量在llOkDa的完整膜糖蛋白復(fù)合物，僅在 寄生階段的小腸微絨毛上表達(dá)。Hll屬于微粒體氨肽酶家族，該復(fù)合物具有氨 基肽酶A和M活性。通過(guò)分子克隆以及序列分析，Hll基因的3個(gè)亞型已經(jīng) 得到鑒定，每個(gè)分子亞型均具有膜內(nèi)在蛋白質(zhì)二型結(jié)構(gòu)，即擁有一個(gè)短的N-末端細(xì)胞質(zhì)尾巴， 一個(gè)跨膜區(qū)以及一個(gè)胞外區(qū)。
Hll具有很高的免疫保護(hù)水平，但由于體外試驗(yàn)還很難模擬//. coMtoWw 的寄生生活階段，不能實(shí)現(xiàn)H CO"toWZ^的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，其天然提取物遠(yuǎn)不能 滿(mǎn)足疫苗生產(chǎn)的需要，使得利用天然抗原提取物進(jìn)行疫苗研制變得舉步維艱。 因而，具有同等免疫活性的重組形式的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是到目前 為止，利用H 疫苗候選抗原的重組形式進(jìn)行的免疫試驗(yàn)均未取得理 想效果。
Hll的重組形式僅能提供很小的免疫保護(hù)。利用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)細(xì) 胞表達(dá)的Hll的可溶性形式H11S免疫山羊，可以獲得高水平的抗體，該抗體 能夠與天然的Hll發(fā)生交叉反應(yīng)，也能夠抑制天然Hll和重組Hll的氨基肽 酶活性，但是卻不能針對(duì)i/. co"tom^的感染提供有效保護(hù)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)， 利用大腸桿菌表達(dá)Hll的活性位點(diǎn)區(qū)域，獲得的重組蛋白以無(wú)活性的包涵體形 式存在，能夠誘導(dǎo)山羊機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力，但由于免疫保護(hù)力太低， 并沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。利用H11活性位點(diǎn)區(qū)域的蛋白免疫后，產(chǎn)生的抗體能夠 與天然H11產(chǎn)生交叉反應(yīng)，抗體水平存在較大的個(gè)體差異，與減卵率具有一定程度的相關(guān)性。然而，該抗體卻不能抑制Hll的氨基肽酶活性。昆蟲(chóng)細(xì)胞與大
腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的(部分)重組蛋白，抗原性質(zhì)與酶活性具有明顯的差異，
這表明抑制氨基肽酶活性并不是Hll提供免疫保護(hù)的機(jī)制。
如何提高Hll重組形式的免疫保護(hù)性成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，掌握Hll 啟動(dòng)子的活性，了解Hll轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上的調(diào)控規(guī)律或許能夠?yàn)槲覀兲?供一定的參考，而國(guó)內(nèi)外目前還未見(jiàn)有關(guān)Hll基因組結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種獲取捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(//. "toWw)微粒體氨肽 酶基因的方法，也即捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(H cowtoWws)浙江株Hll基因cDNA序列
以及相應(yīng)基因組序列的分子生物學(xué)方法，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
(1) //. co"toW^浙江株總RNA的抽提和Hll cDNA序列的克??； 所述的丘浙江株總RNA的抽提和Hll cDNA序列的克隆參照
Sm他(1997)發(fā)表的//. Hl 1基因序列設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)SEQNO 1和
SEQN02)，以//. co"toW^浙江株的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將 PCR產(chǎn)物與PUCm-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè) 序(見(jiàn)SEQN0 3)。
(2) Hll cDNA序列同源性比較及氨基酸序列分析；
Hll cDNA序列同源性比較及氨基酸序列分析利用生物軟件DNAStar對(duì) 獲得的Hll基因進(jìn)行基本的特征分析，并與Smith等克隆的Hll進(jìn)行同源性比 較(見(jiàn)SEQ NO 4)。
(3) Hll基因組序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析；
Hll基因組序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析利用DNAStar軟件分析Hll及其同 源基因 T07F10.1a ( Caewor/zaW似 e/eg<ms ) 、 CBG09515 ( Caeww"/za6顛s ^/ggsae)，根據(jù)T07F10.1a、 CBG09515的內(nèi)含子、外顯子分布特點(diǎn)，參考獲 得的HllcDNA序列，設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)SEQN05和SEQN06)，以//. co加w加 的基因組DNA為模板，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增，獲得H11基因的部分基因組序 列，測(cè)序。按照基因步移的操作原理，參考已經(jīng)獲得的部分基因組序列分別設(shè) 計(jì)同向而且退火溫度較高的特異性引物SP1， SP2， SP3(見(jiàn)SEQN07， SEQNO 8和SEQ NO 9)，與試劑盒提供的兼并引物API進(jìn)行熱不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)，通 過(guò)3次巢式PCR反應(yīng)完成基因序列的一次步移，獲得已知序列的側(cè)翼序列， 測(cè)序。經(jīng)過(guò)5次類(lèi)似的基因步移反應(yīng)，獲得Hll完整的基因組序列和部分5' 側(cè)翼區(qū)序列(SEQNO 10)。利用DNAStar軟件中的MegAlign分析基因組序列中的內(nèi)含子、外顯子組成以及5'側(cè)翼區(qū)序列。
分離獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)浙江株的Hll基因的cDNA序列SEQNO 3全長(zhǎng) 2919 bp，編碼972 AA，表達(dá)蛋白的分子量為110.8 KDa，等電點(diǎn)為6.85，與 Sm池(1997)公布的序歹lJ(GenBankNo.: X94287)比對(duì)分析，同源性為99.2%， 有5個(gè)氨基酸發(fā)生突變。
分離獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)浙江株的Hll基因的基因組序列SEQ NO 10主 要通過(guò)基因步移的方法獲得，全長(zhǎng)14959 bp，包含25個(gè)外顯子，24個(gè)內(nèi)含子 以及長(zhǎng)為1848 bp的5，側(cè)翼序列，外顯子與內(nèi)含子之間通過(guò)典型的GT……AG 連接。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(Hco"toW^)微粒體氨 肽酶基因在利用重組蛋白制備亞單位疫苗中的應(yīng)用。
Hll部分功能域基因的原核表達(dá)參考獲得的HllcDNA序列，設(shè)計(jì)引物 (SEQNOU和SEQN0 12)，擴(kuò)增Hl 1開(kāi)放閱讀框670bp-1710bp的部分基 因序列，命名為hps (mi partial s叫uence)?；蚱闻c表達(dá)載體pET-28b分 別以A^e I、屈o I酶切后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28b-hps，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21中，構(gòu)建重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物 利用SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)。
Hll是if co加or加s的主要保護(hù)性抗原，本發(fā)明提供的Hll cDNA序列為
疫苗免疫研究的開(kāi)展提供了素材；與國(guó)外線(xiàn)蟲(chóng)株mi的比較分析可在一定程度
上為線(xiàn)蟲(chóng)因適應(yīng)不同環(huán)境而產(chǎn)生的地區(qū)差異性和生物多樣性提供證據(jù)；本發(fā)明 還提供了 Hll基因的基因組結(jié)構(gòu)特征，可從轉(zhuǎn)錄水平上分析該基因的生物學(xué)活 性，為獲得具有較高免疫活性的重組蛋白提供背景資料。 本發(fā)明的特點(diǎn)
1. 參考Hll基因的cDNA序列，可以較方便地獲得Hll的基因組序列， 而且獲得的序列完整、準(zhǔn)確；
2. 可以利用Hll的基因組序列分析Hll mRNA的轉(zhuǎn)錄特征，為H. contortus的疫苗研制提供了可靠的背景資料和素材；
3. 大腸桿菌表達(dá)的原核蛋白主要以包涵體的形式存在于基因工程菌中，僅 需簡(jiǎn)單的超聲波破碎等處理方式即可獲得具有較高穩(wěn)定性和生物活性的粗蛋 白。


圖1是本發(fā)明提供的特異性引物設(shè)計(jì)示意圖(以獲取5'序列為例)。圖2是本發(fā)明提供的//. co"toWw浙江株Hll cDNART-PCR擴(kuò)增圖譜。 圖3是本發(fā)明提供的//. co"torto浙江株Hll基因克隆的雙酶切和PCR 鑒定圖譜。
圖4是本發(fā)明提供的i/. co"towws浙江株Hll與Smith (1997)公布的序 列同源性比對(duì)的分析圖譜。
圖5是本發(fā)明提供的分別利用特異性引物HCF-SP1,HCF-SP2，HCF-SP3與 兼并引物API進(jìn)行熱不對(duì)稱(chēng)PCR的擴(kuò)增圖譜。
圖6是本發(fā)明提供的//. cw7toW^浙江株Hll部分功能域基因(hps)的 PCR擴(kuò)增圖譜。
圖7是本發(fā)明提供的//. 浙江株Hll部分功能域基因(hps)重組
表達(dá)載體的雙酶切和PCR鑒定圖譜。
圖8是本發(fā)明提供的H co"tom^浙江株HPS重組蛋白的SDS-PAGE鑒定 圖譜。
圖9是本發(fā)明提供的//. co"tor加浙江株HPS重組蛋白的Western-blot鑒
定圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例1
本實(shí)施例描述了本發(fā)明提供的//. cowtom^浙江株Hll基因cDNA序列的 獲得方法，長(zhǎng)距離RT-PCR擴(kuò)增并克隆Hll cDNA的整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程。 (一)RT-PCR擴(kuò)增//. co"foWw浙江株Hll的cDNA序列
1. 參考分子克隆第三版一步法從組織中制備RNA進(jìn)行//. cowtoWM總 RNA抽提，經(jīng)甲醛凝膠電泳確定無(wú)降解后，-8(TC保存。
2. 引物設(shè)計(jì)按照Smith (1997)等發(fā)表的序列，根據(jù)其閱讀框的序列 特點(diǎn)，兩端分別加上Sal I和HindIII酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基設(shè)計(jì)引物Pl/P2 (參考 SEQNOl和SEQN0 2),引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
3. H. ZJ株cDNA的合成在一支1.5ml Eppendorf管中，依次 加入3 jil總RNA、 DEPC處理ddH20 5 jil、 0.5 |il Ribonuclease inhibitor、 2 pi 01igo(dT)18，小心混勻，65。C保溫5min，室溫放置10min，室溫高速離心5 s， 然后再按次序加入4 pi 5x MMLV緩沖液、0.5 |il Ribonuclease inhibitor、 2 )il 100mMDTT、 2 pi dNTP mix、 lplMMLV，小心混勻，37。C保溫1 h， 90。C處理5min，冰上冷卻，室溫高速離心5s， -20 。C凍存。
4.基因的PCR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用SuperTaq酶擴(kuò) 增Hll基因。擴(kuò)增條件如下94 。C預(yù)變性2 min， 94 °C 30 s， 58 °C 30 s， 68 °C 3min， 30個(gè)循環(huán)，最后68 "C延伸10min。循環(huán)反應(yīng)完畢后，取5 pl反應(yīng)產(chǎn)物 在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀(guān)察結(jié)果(參見(jiàn)附圖2)，然后利用凝膠回收試劑 盒回收PCR產(chǎn)物備用。
(二) //. co"toWusZJ株Hll基因的克隆
1. PCR產(chǎn)物和pUCm-T的連接在lO)il連接體系中依次加入如下成分 10x連接緩沖液1 W、 pUCm-T酶切載體1 |iil、 PCR純化回收酶切產(chǎn)物7 |il、 T4 DNA連接酶1 ^， 16 'C連接過(guò)夜。
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取連接產(chǎn)物5nl，加入到200 pl感受態(tài)細(xì)胞，冰浴20 min，室溫放置10 min，加入1000 pl LB培養(yǎng)基，37 。C ， 150 r/min震蕩40 min。 取300 pl均勻涂布于含X-gal和IPTG的LB Amp瓊脂板上，37 。C培養(yǎng)24 h， 挑取白斑菌落(陽(yáng)性克隆)。
3. pUCm-T-Hll質(zhì)粒的提取和鑒定挑取若干個(gè)白斑，分別接種于5 ml含 Amp的LB培養(yǎng)液中，37 'C搖菌，抽提質(zhì)粒。堿法抽取的質(zhì)粒用Sal I和HindIII 酶切鑒定正確后(參見(jiàn)附圖3)，將菌液送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè) 序結(jié)果表明，Hll的cDNA序列共有2919bp，與SmMi等(1997)克隆的Hll 基因相比，有15個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中5個(gè)有意義突變，IO個(gè)無(wú)意義突變。 5個(gè)有意義突變分別為第550位T-C;第1577位A-G;第1681位G-A;第2444 位C-T;第2642位G-A,，具體序列參考SEQ NO 3 (GenBankNO.: AY819650)。
4. DNAstar軟件分析表明Hll cDNA序列編碼972 AA，表達(dá)蛋白分子量 為110.8 KDa，等電點(diǎn)為6.85，同源性為99.2% (參考SEQNO 4)。與上述3中 對(duì)應(yīng)的發(fā)生突變的氨基酸依次為第184位Phe-Leu;第526位Lys-Arg;第561 位Glu-Lys;第815位Ser-Phe;第881位Gly-Glu的改變，參見(jiàn)附圖4。
實(shí)施例2
本實(shí)施例描述了本發(fā)明主要利用基因步移技術(shù)獲得Hll基因的基因組序 列過(guò)程。
(一)Hll部分基因組序列的獲得取用PBS緩沖液洗滌過(guò)的//. co"toW船50 mg移入冰浴的Collection Tube中，用研磨棒快速研磨成糊狀后， 按照TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit的方法提取基因組DNA，-2(TC保存。
以提取的H co"tor加基因組DNA序列為模板，利用引物Hc-GSF / Hc-GSR (參考SEQ NO 5和SEQ NO 6)，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(50 fil) : TaKaRa LA Taq(5 U/|il) 0.5 lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pi, dNTP Mixture (各2.5 mM) 8 |til，基因組DNA 0.7 (il， Hc-GSF(20 |iM) 1 (il, Hc-GSR(20 pM) 1 ddH20 38 (il。反應(yīng)條件為94 。C預(yù)變性3 min; 94 °C,60 s, 58 °C 60 s， 72 °C 6 min; 72 °C 10 min; 30個(gè)循環(huán)。利用引物Hc-GSF/ Hc-GSR擴(kuò)增獲得部分 基因組序列，長(zhǎng)度為4806bp。
(二) 利用基因步移的方法獲得Hll的基因組序列以及部分5'側(cè)翼序 列首先在已獲得的4S06bp片段沿3'方向設(shè)計(jì)特異性引物HCF-SPl / HCF-SP2 / HCF-SP3，設(shè)計(jì)方法參考Takara Genome Walking Kit,參見(jiàn)圖1 (參考SEQNO 7, SEQ NO 8和SEQ NO 9)，利用該引物與試劑盒提供的API兼并引物進(jìn)行
基因步移的相關(guān)反應(yīng)，具體流程如下
(1) 以基因組DNA為模板，以HCF-SPl為上游引物，API Primer為下 游引物，進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)。50(1l反應(yīng)體系組成如下基因組DNA模板1 (xl， TaKaRa LA Taq(5卵)0.5 lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pi, dNTP Mixture (各2.5mM) 8 nl， HCF-SPl (10 pmol/(il)引物l|id， API引物(100 pmol/pl) 1 |al， ddH20 33.5 (il。反應(yīng)條件為
94°C 1 min; 98 。C 1 min;
94。C 30 s， 65 °C 1 min， 94°C 30 s， 25 °C 3 min， 94°C 30 s， 65 °C 1 min， 94°C 30 s， 65°C 1 min， 94。C 30 s， 44°C 1 min， 72 。C 10 min
(2) 以第一輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。50pl反 應(yīng)體系組成如下第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1^1， TaKaRa LA Taq(5U/|LU) 0.5(il， lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5pl, dNTP Mixture (各2.5mM) 8^1， HCF-SP2
(10pmol/|il)引物l|til， API引物(100pmol/nl) l(il， ddH20 33.5^1。反應(yīng)條 件為
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; ^
72。C2min，共5個(gè)循環(huán)； 72。C 2 min; 72 。C 2 min;'
72°C 2 min; 72°C 2min;-
共15個(gè)循環(huán)94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; 共15個(gè)循環(huán) 94°C 30 s， 44°C 1 min， 72°C 2 min; 72 。C 10 min
(3)以第二輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第三輪PCR反應(yīng)。50 pl反 應(yīng)體系組成如下第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1^1， TaKaRa LA Taq(5 U/|ul) 0.5 |ul, lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pl， dNTP Mixture (各2.5 mM) 8 |nl， HCF-SP3( 10 pmol/^il)引物1 pl， API引物(100pmol/|Lil) 1 |al， ddH20 33.5 pl。反應(yīng)條件 為
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min;
共15個(gè)循環(huán)
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; 94°C 30 s， 44。C 1 min， 72。C 2 min; 72°C 10 min
(4) 取上述各步PCR反應(yīng)液5 pl進(jìn)行1%的Agarose凝膠電泳，結(jié)果如 附圖5所示。
(5) 使用凝膠回收試劑盒，割膠回收第三輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序，結(jié)果分析獲得H11基因的部分5'側(cè)翼 序列。在獲得的序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物3HcHPF/3HcHPR， (3HcHPF: 5-CAGAAGAAGAGTGTGACTGATGT陽(yáng)3', 3HcHPR: 5，-CCAGTTCACATTCTTGGGGTAT-3')，用于鑒定擴(kuò)增獲得的5'側(cè)翼區(qū)序列。鑒 定結(jié)果表明，獲得5，側(cè)翼區(qū)序列為1848bp。
(6) 按照同樣的操作流程，最終擴(kuò)增獲得的Hll基因組序列全長(zhǎng)為14959 bp，包含25個(gè)外顯子，24個(gè)內(nèi)含子以及長(zhǎng)度為1848 bp的5'側(cè)翼序列，參考 序列SEQNO 10 (GenBankNO.:FG481146)，外顯子與內(nèi)含子之間通過(guò)典型的 GT......AG連接。
實(shí)施例3
本實(shí)施例描述了本發(fā)明對(duì)Hll部分功能域基因的原核表達(dá)過(guò)程。
1. 參考Hll的cDNA序列(SEQN03)，設(shè)計(jì)引物HPSF/HPSR，兩端分 別加上Nde I禾口 Xho I酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)性堿基(SEQ NO 11和SEQ NO 12)，引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
2. Hll部分功能域(HPS)核酸序列的PCR擴(kuò)增以實(shí)驗(yàn)室保存的pUCm-T-Hll質(zhì)粒為模板，用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增，條件為94 'C預(yù)變性3 min; 94。C30s， 58.7。C30s， 68 °C 3 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 。C延伸10 min。 反應(yīng)完畢后，取5nl反應(yīng)產(chǎn)物在1.0。/。的瓊脂糖凝膠上電泳，觀(guān)察結(jié)果，參見(jiàn) 圖6。
3. Hll部分功能域(HPS)的原核表達(dá) A^fe/和J^o/酶切HPS基因片 段和質(zhì)粒pET-28b，并用DNA回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，按T4 DNA連 接酶說(shuō)明進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21， PCR、酶切鑒定陽(yáng)性(參 見(jiàn)圖7，圖8)，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
4. IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白及純化取50 pl含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌 種液接種到5ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37 "C搖床中以220轉(zhuǎn)/分振搖 培養(yǎng)，至菌液的OD值約為0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L后 30 'C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)前(0h)和誘導(dǎo)后2、 4、 6、 8h吸取5ml菌 樣于4°C， 5000 rpm離心5 min，收集細(xì)菌沉淀，用PBS重懸。用PBS洗2次， 加1 ml裂解緩沖液、10 ^溶菌酶，冰浴30 min，超聲波裂解菌體(條件為200 w， 處理4s，間隔4s，共40次)后12000 rpm離心1 min,沉淀用PBS重懸加入等 量2xSDS凝膠加樣緩沖液，上清也加入等量上樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2 min, -2(rC備用。同時(shí)設(shè)立帶pET-28b質(zhì)粒的BL21大腸桿菌對(duì)照，SDS-PAGE 鑒定，參見(jiàn)圖8。將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行超聲裂解，收集上清液加入到用PBS (pH7.4)預(yù)先平衡的鎳瓊脂糖凝膠柱中。控制流速lml/min，經(jīng)PBS平衡后 用含不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行階段洗脫，流速2 ml/min，收集洗脫液，經(jīng) Western-blot鑒定，參見(jiàn)圖9。本發(fā)明涉及的序列 <110>浙江大學(xué)
<120>捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因的獲得方法及應(yīng)用 <160> 12
<210> 1
<211>24
<212>DNA
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<221> CONFLICT <400> 4
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<400> 5
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卿agagcccttcaggaagaaactccaggtccttatcggtgtctcctgcccag犯<210> 11 <211〉 33 <212>DNA
<213>捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng) (Haemonchus contortus)
<220>
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<400> 11
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〈210〉 12 <211> 29 <212> DNA
<213>捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng) (Haemonchus contortus)
<220>
<221>CDS
<400> 12
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權(quán)利要求
1. 一種獲取捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因的方法，所述捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)命名為H.contortus，其特征在于通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)H. contortus浙江株總RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆所述的H. contortus浙江株總RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆參照Smith 1997年發(fā)表的H.contortus H11基因序列設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)SEQ NO 1和SEQ NO 2，以H.contortus浙江株的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與PUCm-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序見(jiàn)SEQ NO 3；(2)H11 cDNA序列同源性比較及氨基酸序列分析H11 cDNA序列同源性比較及氨基酸序列分析利用生物軟件DNAStar對(duì)獲得的H11基因進(jìn)行基本的特征分析，并與Smith等克隆的H11進(jìn)行同源性比較，見(jiàn)SEQ NO 4；(3)H11基因組序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析H11基因組序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析利用DNAStar軟件分析H11及其同源基因T07F10.1a、CBG09515，根據(jù)T07F10.1a、CBG09515的內(nèi)含子、外顯子分布特點(diǎn)，參考獲得的H11 cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)SEQ NO 5和SEQ NO6，以H.contortus的基因組DNA為模板，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增，獲得H11基因的部分基因組序列，測(cè)序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因的方法， 其特征在于分離獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)浙江株的Hll基因的cDNA序列SEQ N03全長(zhǎng)2919bp，編碼972AA，表達(dá)蛋白的分子量為110.8 KDa，等電點(diǎn)為 6.85，與1997年Sm池公布的序列比對(duì)分析，同源性為99.2%，有5個(gè)氨基酸 發(fā)生突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因的方法， 其特征在于分離獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)浙江株的Hll基因的基因組序列SEQ NO IO通過(guò)基因步移的方法獲得，全長(zhǎng)14959 bp，包含25個(gè)外顯子，24個(gè)內(nèi) 含子以及長(zhǎng)為1848 bp的5'側(cè)翼序列，外顯子與內(nèi)含子之間通過(guò)典型的GT…… AG連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因在利 用重組蛋白制備亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種獲取捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(H.contortus)微粒體氨肽酶基因的方法，通過(guò)總RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆，H11 cDNA序列同源性比較及氨基酸序列分析，H11基因組序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明參考H11基因的cDNA序列，可方便、完整、準(zhǔn)確地獲得H11的基因組序列，可利用H11的基因組序列分析H11 mRNA的轉(zhuǎn)錄特征，為H.contortus的疫苗研制提供了可靠的背景資料和素材。本發(fā)明提供的捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)微粒體氨肽酶基因可在利用重組蛋白制備亞單位疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101434951SQ200810163618
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者周前進(jìn), 姜小磊, 張紅麗, 杜愛(ài)芳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)