專(zhuān)利名稱(chēng)：：細(xì)胞因子與腫瘤靶向蛋白的融合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥用組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤塊是免疫療法成功的主要限制因素。在常規(guī)上，外科手術(shù)療法、化學(xué)療法和》欠射療法用于減小腫瘤的體積；才艮據(jù)腫瘤的定位、擴(kuò)散和對(duì)治療的內(nèi)在抗性，這些療法能夠獲得不同程度的成功。盡管這些療法顯著改善患者存活率，但仍然存在顯著缺陷。通過(guò)外科手術(shù)減小腫瘤體積能夠非常有效地除去原發(fā)性腫瘤塊，但對(duì)于彌散性轉(zhuǎn)移瘤的臨床應(yīng)用性有限。另一方面，化學(xué)療法存在選擇出抗性個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)，而這些抗性個(gè)體將是無(wú)法治療的。此外，化學(xué)療法通常對(duì)于患者有極大毒性，并且有強(qiáng)烈的免疫抑制效應(yīng)。出于這些原因，有必要發(fā)展根據(jù)不同原則的用于治療腫瘤的低毒性并且高效根除彌散性損害的有效方法。已經(jīng)描述一些細(xì)胞因子的抗胂瘤活性。一些細(xì)胞因子已經(jīng)用于人體治療。例如，細(xì)胞因子如IL-2和IFN-y已經(jīng)在不同類(lèi)型腫瘤的患者體內(nèi)顯示有效抗胂瘤活性，所述腫瘤類(lèi)型例如腎轉(zhuǎn)移癌、毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、黑素瘤和多發(fā)性骨髓瘤等。已經(jīng)顯示其它細(xì)胞因子對(duì)一些肺瘤類(lèi)型顯示某種抗腫瘤活性，所述細(xì)胞因子如IFN-P、腫瘤壞死因子(TNF)oc、TNFp、IL-1、4、6、12、15和集落刺激因子(CFS)。一般而言，細(xì)胞因子的治療應(yīng)用受到它們系統(tǒng)性毒性的強(qiáng)烈限制。例如，最初發(fā)現(xiàn)TNF能夠誘導(dǎo)一些腫瘤的出血性壞死，并且TNF對(duì)不同腫瘤系有體外細(xì)胞毒性效應(yīng)；但隨后證明TNF有強(qiáng)烈的促炎活性，在TNF超量產(chǎn)生的情況下，會(huì)嚴(yán)重危害患者的身體。由于系統(tǒng)性毒性是在人體應(yīng)用藥學(xué)有效量細(xì)胞因子的主要問(wèn)題，因此，目前正在評(píng)估新型衍生物和治療策略，目的是降低這類(lèi)生物效應(yīng)物的毒性效應(yīng)，同時(shí)保持它們的治療功效。一些新型方法涉及a)發(fā)展能夠傳遞TOF進(jìn)入腫瘤并增加局部濃度的融合蛋白。例如，已經(jīng)產(chǎn)生由TNF和腫瘤特異性抗體組成的融合蛋白；b)t艮維持抗腫瘤活性并且系統(tǒng)性毒性降低的TNF突變體。由此，已經(jīng)制備能夠選擇性識(shí)別僅一種受體的突變體；c)應(yīng)用能夠降低TNF某些毒性效應(yīng)又不損失其抗腫瘤活性的抗TNF抗體。已經(jīng)有文獻(xiàn)描述這樣的抗體；d)應(yīng)用半衰期更長(zhǎng)的TNF衍生物(例如與聚乙二醇綴合的TNF)。EP251494公開(kāi)一種用于給予診斷劑或治療劑的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白綴合的抗體，能夠與所述綴合抗體復(fù)合的試劑，以及診斷劑或治療劑與生物素綴合而組成的化合物。順序給予上述化合物，并在給藥之間有足夠間隔，以便通過(guò)所述抗體識(shí)別的耙細(xì)胞表面生物素-抗生物素蛋白之間的相互作用，定位所述治療劑或診斷劑。已經(jīng)描述的治療劑或診斷劑包括金屬螯合物，尤其是放射性核素與低分子量抗腫瘤藥物例如順鉑、多柔比星等的螯合物。EP496074/>開(kāi)一種方法，所述方法順序給予一種生物素化抗體、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白以及一種生物素化診斷劑或治療劑。雖然一般性提到細(xì)胞毒性劑如蓖麻毒蛋白，但主要公開(kāi)與放射性標(biāo)記化合物有關(guān)的應(yīng)用。WO95/15979公開(kāi)一種將高毒性劑定位到細(xì)胞耙表面的方法，所述方法主要步驟如下首先給予第一種綴合物，所述化合物包含與一種配體或一種抗配體綴合的特異性靶分子；然后給予第二種綴合物，所述綴合物包含與一種抗配體或與所述配體結(jié)合的毒性劑。WO99/13329公開(kāi)一種將分子靶向到腫瘤血管生成性血管的方法，所述方法的原理是將所述分子與NGR受體的配體綴合。已經(jīng)提示許多分子作為可能的候選物，但僅僅專(zhuān)門(mén)論述多柔比星。未曾公開(kāi)應(yīng)用NGR受體的配體作為細(xì)胞因子載體，以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在WO01/61017中，本發(fā)明的發(fā)明人描述驚人的發(fā)現(xiàn)通過(guò)將某些細(xì)胞因子與氨肽酶N受體(CD13)的配體偶聯(lián)，能顯著改善所述細(xì)胞因子的治療指數(shù)，并且增強(qiáng)它們的治療性質(zhì)。CD13是一種150kDa跨膜糖蛋白，在各個(gè)物種之間高度保守。CD13在正常細(xì)胞中表達(dá)，也在骨髓腫瘤細(xì)胞系、血管生成性?xún)?nèi)皮和一些上皮中表達(dá)。CD13受體通常被定義為"NGR"受體，因?yàn)槠潆呐潴w都具有氨基酸"NGR"基序。HalinC等(2002)NatureBiotechnology20:264-269乂>開(kāi)一種融合蛋白，所述融合蛋白包括與特異性針對(duì)纖連蛋白癌胚ED-B結(jié)構(gòu)域的人抗體片段融合的IL-12。Camemolla等(2002)Blood99(5):1659-65公開(kāi)IL-2與抗ED-B抗體的融合蛋白。CortiA等(1998)CancerResearch58:3866-3872公開(kāi)一種將TNF耙向腫瘤的間接方法或"預(yù)靶"方法，所述方法包括用生物素化抗體和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素預(yù)靶腫瘤細(xì)胞，一段時(shí)間后再給予生物素化TNF。Hoogenboom等(1991)Mol.Immunol.28:1027-1037公開(kāi)一種融合蛋白，所述融合蛋白如下構(gòu)建將抗運(yùn)鐵蛋白受體mAb的部分重鏈基因與TNF-oc基因融合。Yang等(1995)Hum.Antibod.Hybrodomas6:129-136公開(kāi)將TNF的N末端與針對(duì)結(jié)腸癌、胃癌和卵巢腺癌表達(dá)的腫瘤相關(guān)TAG72抗原的mAb的絞鏈區(qū)C末端融合。Yang等(1995)MolImmunol32:873-881公開(kāi)單價(jià)Fv-TNF與所述TAG72抗原的融合蛋白的生產(chǎn)。就我們所知，目前沒(méi)有報(bào)道這些綴合物體內(nèi)活性的數(shù)據(jù)。Xiang等(1993)CancerBiother8:327-337公開(kāi)針對(duì)TAG72的單鏈Fv和IFN-y的重組雙功能分子；Xiang等(1994)ImmimCellBiol72:275-2857>開(kāi)了針對(duì)TAG72的單鏈Fv和IL-2的重組雙功能分子。然而，仍然需要其它的和改良的用于癌癥治療和診斷的藥用組合物和方法。目前，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向傳遞細(xì)胞因子的概念能夠廣泛應(yīng)用，并且顯著增加化療藥物的治療指數(shù)。由于這些綴合物起作用(把向受體、TNF受體)所需多4介相互作用的復(fù)雜性，還不清楚除CD13以外的血管受體能否起作用。發(fā)明簡(jiǎn)述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種細(xì)胞因子與一種腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物，前提是當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF-a、TNF-P或IFN-y時(shí)，所述TTM不是CD13配體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是IL-2或IL-12時(shí)，所述TTM不是抗纖連蛋白抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF時(shí)，所述TTM不是抗運(yùn)鐵蛋白受體的抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF、IFN-y或IL-2時(shí)，所述TTM不是抗TAG72抗原的抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是IFN時(shí)，所述TTM不是av(33整聯(lián)蛋白配體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNP時(shí)，所述TTM不是纖連蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述綴合物不是生物素化TNF。所述細(xì)胞因子最好是一種炎性細(xì)胞因子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是一種化療細(xì)胞因子。所述細(xì)胞因子最好是TNFa、TNFp、IFNoc、IFN卜IFNy、IL-1、2、4、6、12、15、EMAPII、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是TNFa、TNF(3或IFNy。所述靶化合物可以或者在腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，或者在與內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸或者臨近的基質(zhì)中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TTM是肺瘤血管系統(tǒng)靶向部分(TVTM》在另一實(shí)施方案中，所述TVTM是一種腫瘤血管系統(tǒng)受體、標(biāo)記或其它細(xì)胞外成分的結(jié)合配偶體。在另一實(shí)施方案中，所述TTM是一種腫瘤受體、標(biāo)記或其它細(xì)胞外成分的結(jié)合配偶體。在另一實(shí)施方案中，所述TTM是一種抗體或配體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TTM包括NGR或RGD基序，或者所述TTM是MV-tat、膜聯(lián)蛋白V、骨橋蛋白、纖連蛋白、I型或IV型膠原蛋白、透明質(zhì)酸、肝配蛋白，或者所述TTM是癌胚纖連蛋白的一種結(jié)合配偶體；或者所述TTM是上述物質(zhì)的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TTM不是HIV-tat。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TTM包括NGR基序。所述TTM優(yōu)選是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC、線性或環(huán)狀CNGRC。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TTM包含RGD基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TTM靶向VEGFR、ICAM1、2或3、PECAM隱l、CD31、CD13、VCAM-1、選擇蛋白、ActRII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、ocvp3整聯(lián)蛋白、av卩5整聯(lián)蛋白、FGF-1、2、3或4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纖連蛋白、PD-ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。在另一實(shí)施方案中，所述TTM并不靶向VEGFR。所述綴合物優(yōu)選為融合蛋白的形式。在另一實(shí)施方案中，所述綴合物為核酸形式。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包含本發(fā)明核酸的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供制備綴合物的方法，所述方法包括在允許表達(dá)所述綴合物的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明要求保護(hù)的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種藥用組合物，所述組合物包括「本發(fā)明的綴合物以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含另一種抗腫瘤藥物或診斷性腫瘤成像化合物。所述另一種抗腫瘤藥物最好是多柔比星或美法侖。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提掩浪照本發(fā)明的綴合物或藥用組合物用于制備藥物的應(yīng)用，其中所述藥物用于癌癥治療或診斷。另一方面，本發(fā)明提供一種治療或診斷癌癥的方法，所述方法包括給予需要患者有效量依照本發(fā)明的綴合物或藥用組合物。下面表A顯示可以在本發(fā)明中應(yīng)用的優(yōu)選耙向部分和細(xì)胞因子的組合。表A細(xì)月包因子靶向部分IFN-a包含RGD的肽IFN-(3包含RGD的肽IL-2包含RGD的肽IL-12包含RGD的肽EMAPII包含RGD的肽VEGF包含RGD的肽IL-1包含RGD的肽IL畫(huà)6包含RGD的肽IL-12包含RGD的肽PDGF包含RGD的肽PD-ECGF包含RGD的肽cxc趨化因子包含RGD的肽cc趨化因子■包含RGD的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>IL畫(huà)1抗PECAM-1/CD31抗體IL畫(huà)6抗PECAM-1/CD31抗體IL國(guó)12抗PECAM-1/CD31抗體PDGF抗PECAM-1/CD31抗體PD-ECGF抗PECAM-1/CD31抗體cxc趨化因子抗PECAM-1/CD31抗體cc趨化因子抗PECAM-1/CD31抗體c趨化因子抗PECAM-1/CD31抗體IL-15抗PECAM-1/CD31抗體TNF畫(huà)ocVCAM-1的配體TNF-PVCAM-1的配體IFN-otVCAM-1的配體IFN-J3VCAM-1的配體IFN-yVCAM-1的配體IL-2VCAM-1的配體IL-12VCAM-1的酉己^EMAPIIVCAM-1的配體VEGFVCAM-1的配體IL-1VCAM-1的配體IL-6VCAM-1的配體IL-12VCAM-1的配體PDGFVCAM-1的配體PD-ECGFVCAM-1的配體cxc趨化因子VCAM-1的配體cc趨化因子VCAM-1的配體c趨化因子VCAM-1的配體IL-15VCAM-1的配體<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>TNF-aActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體TNF-卩ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IFN-aActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IFN-PActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體畫(huà)-yActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL-2ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL國(guó)12ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體EMAPIIActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體VEGFActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL-1ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL-6ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL-12ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體PDGFActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體PD-ECGFActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體cxc趨化因子ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體cc趨化因子ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體c趨化因子ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體IL-15ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配體TNP國(guó)a抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體TNF-P抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體而-a抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體IFN國(guó)P抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體IFN-y抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體IL-2抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體IL-12抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體EMAPII抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體VEGF抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>IL國(guó)1抗FGF-1、2、3或4抗體IL-6抗FGF-1、2、3或4抗體IL-12抗FGF-1、2、3或4抗體PDGF抗FGF-1、2、3或4抗體PD-ECGF抗FGF-1、2、3或4抗體cxc趨化因子抗FGF-1、2、3或4抗體cc趨化因子抗FGF-1、2、3或4抗體c趨化因子抗FGF-1、2、3或4抗體IL-15抗FGF-1、2、3或4抗體TNF-aIL-1R的配體TNF-卩IL-1R的配體IFN-aIL-1R的配體IFN-pIL-1R的配體IFN-yIL-1R的配體IL-2IL-1R的配體IL-12IL-1R的配體EMAPIIIL-1R的配體VEGFIL-1R的配體IL-1IL-1R的配體IL畫(huà)6IL-1R的配體IL-12IL-1R的配體PDGFIL-1R的配體PD-ECGFIL-1R的配體cxc趨化因子IL-1R的配體cc趨化因子IL-1R的配體c趨化因子IL-1R的配體IL-15IL-1R的配體<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>TNF-aMMP的配體TNF-pMMP的配體IFN-aMMP的配體IFN-卩MMP的配體IFN-yMMP的配體IL-2MMP的配體IL-12MMP的配體EMAPIIMMP的配體VEGFMMP的配體IL隱1MMP的配體IL-6MMP的配體IL-12MMP的配體PDGFMMP的配體PD-ECGFMMP的配體cxc趨化因子MMP的配體cc趨化因子MMP的配體c趨化因子MMP的配體IL-15MMP的配體TNF-a抗MMP抗體TNF-卩抗MMP抗體IFN-a抗MMP抗體IFN-p抗MMP抗體IFN-y抗MMP抗體IL-2抗MMP抗體IL-12抗MMP抗體EMAPII抗MMP抗體VEGF抗MMP抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>TNF-oc抗TNFR抗體TNF-P抗TNFR抗體麗-oc抗TNFR抗體顧-P抗TNFR抗體IFN-y抗TNFR抗體IL-2抗TNFR抗體IL-12抗TNFR抗體EMAPII抗TNFR抗體VEGF抗TNFR抗體IL-1抗TNFR抗體IL-6抗TNFR抗體IL-12抗TNFR抗體PDGF抗TNFR抗體PD-ECGF抗TNFR抗體CXC趨化因子抗TNFR抗體cc趨化因子抗TNFR抗體c趨化因子抗TNFR抗體IL-15抗TNFR抗體TNF畫(huà)ccPDGFR的配體TNF-(3PDGFR的配體IFN-aPDGFR的配體IFN-卩PDGFR的配體IFN-yPDGFR的配體IL-2PDGFR的配體IL-12PDGFR的配體EMAPIIPDGFR的配體VEGFPDGFR的配體<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>包含NGR的肽，或者所述綴合物包含TNF-a或TNF-P以及包含RGD的肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述綴合物為融合蛋白形式。本發(fā)明的另一方面提供一種藥用組合物，所述組合物包含有效量TNF與第一種TTM的綴合產(chǎn)物或者編碼同樣物質(zhì)的多核苦酸，并且包含有效量IFN-Y與第二種TTM或者編碼同樣物質(zhì)的多核苷酸，其中所述第一種TTM和所述第二種TTM竟?fàn)幉煌荏w。本發(fā)明的一些關(guān)4建好處化療藥物要到達(dá)實(shí)體瘤中的癌癥細(xì)胞，必須進(jìn)入腫瘤血管，然后穿過(guò)血管壁，最后遷移穿過(guò)間質(zhì)。異質(zhì)性腫瘤灌注、血管滲透性和細(xì)胞密度以及間質(zhì)壓力增加是限制藥物進(jìn)入遠(yuǎn)離血管的瘤細(xì)胞并由此限制化療有效性的關(guān)鍵障礙(l)。因此，目標(biāo)在于改善藥物穿透腫瘤的策略具有極大的實(shí)驗(yàn)價(jià)值和臨床價(jià)值。不斷增加的證據(jù)顯示腫瘤壞死因子a(TNF)和具備強(qiáng)有力抗腫瘤活性的炎性細(xì)胞因子可以用于該目的。例如，與單獨(dú)使用化療藥物相比，在美法侖或多柔比星區(qū)域孤立性肢體灌注中增加TNF在患有肢端軟組織肉瘤或黑素瘤的患者體內(nèi)產(chǎn)生更高的反應(yīng)率(2-6)。TNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能改變、腫瘤間質(zhì)壓力降低以及化療藥物穿透和腫瘤血管損傷增加被認(rèn)為是TNF與化療之間協(xié)同作用的重要機(jī)制(3,4，7-10)。不幸的是，系統(tǒng)性給予TNF伴隨著禁止性毒性，其最大耐受劑量(8-10lag/kg)比估計(jì)的有效劑量低10-50倍(ll,12)。出于這個(gè)原因，已經(jīng)放棄系統(tǒng)性給予TNF,并且該細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用僅限于局部區(qū)域性治療。然而，TNF活性的一些特征，尤其是對(duì)腫瘤相關(guān)血管的選擇性和與化療藥物的協(xié)同作用，仍然有更廣泛治療應(yīng)用的可能性(13)。TNF的血管效應(yīng)為發(fā)展"血管靶，，策略提供了基本原理，該策略目標(biāo)在于增加局部有效性并^f吏得能夠系統(tǒng)性給予治療劑量。我們最近已經(jīng)證明，通過(guò)將TNF偶聯(lián)到CNGRC肽，能夠?qū)⒃摰鞍装邢騻鬟f到腫瘤血管，CNGRC肽是一種以腫瘤新生血管系統(tǒng)為耙的氨肽酶N(CD13)配體(14)。在當(dāng)前工作中，我們已經(jīng)研究用其它綴合物^^向血管能否增強(qiáng)化療藥物在腫瘤中的穿透并改善它們的功效。此外，我們考慮用所述綴合物靶向血管是否會(huì)降低藥物穿透屏障并且能否增加到達(dá)癌癥細(xì)胞的化療藥物的量。為減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量，使剩余的腫瘤細(xì)胞能夠被抗腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞完全破壞，我們必須考慮一種減小腫瘤的方法，該方法與化療不同，沒(méi)有免疫抑制性。在這一方面，我們相信將腫瘤血管作為殺死腫瘤細(xì)胞的靶看起來(lái)是最有前途的癌癥治療方法之一。腫瘤誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮由非轉(zhuǎn)化細(xì)胞組成，因此，所述細(xì)胞不發(fā)生治療誘導(dǎo)的突變。因此，在原則上可以給予以腫瘤血管內(nèi)皮為耙的重復(fù)治療，而不存在選擇出抗性變體的危險(xiǎn)。第二，通過(guò)破壞相對(duì)少數(shù)量的腫瘤血管，有可能破壞相當(dāng)大數(shù)量依賴(lài)血液支持存活的腫瘤細(xì)胞。因此，破壞腫瘤相關(guān)血管、破壞新血管形成并且不引起免疫抑制的生物學(xué)療法將是在免疫療法或其它治療干預(yù)之前減小腫瘤的一種非常有吸引力的方法。在能夠影響腫瘤血管以及免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞因子和生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中，單獨(dú)應(yīng)用TNFa或者將TNFa與干擾素y和化療藥物聯(lián)合應(yīng)用無(wú)疑是最有效的方法之一。自發(fā)現(xiàn)TNFa以來(lái)，已經(jīng)很好地確認(rèn)該細(xì)胞因子在24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)動(dòng)物腫瘤大量出血性壞死和腫瘤萎縮。.目前已經(jīng)完全確認(rèn)當(dāng)通過(guò)孤立性肢體灌注將高劑量TNF與干4尤素y和美法侖聯(lián)合局部給藥時(shí)，TNF也能夠破壞患者體內(nèi)肢端轉(zhuǎn)移黑素瘤的腫瘤大血管和小血管。TNF能夠引起一連串級(jí)聯(lián)事件，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞破壞、血小板凝集、血管內(nèi)血纖維蛋白沉積和凝結(jié)，并使最大程度地阻止腫瘤循環(huán)。引人注目的是，與腫瘤臨近的正常血管不受影響，這指示TNF能夠通過(guò)某種機(jī)制區(qū)分正常組織的血管系統(tǒng)以及腫瘤的血管系統(tǒng)。因此，一種有吸引力的可能性是在其它治療干預(yù)之前，利用TNF來(lái)誘導(dǎo)減少腫瘤體積。與常規(guī)化療劑相比，用TNF減少胂瘤體積的另一種潛在好處是它不是一種免疫抑制劑，但相反，它是一種重要的免疫反應(yīng)激活劑。TNF確實(shí)能夠激活抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞是免疫反應(yīng)重要的關(guān)鍵介質(zhì)，并且TNF能夠激活各種促成有效免^應(yīng)的機(jī)制。不幸的是，由于存在劑量限制性系統(tǒng)性毒性并且治療指數(shù)差，目前TNF作為抗癌癥藥物的臨床應(yīng)用局限于局部區(qū)域性治療?？扇苄陨锘钚訲NF是一種同源三聚體蛋白，在皮摩爾水平時(shí)緩慢解離為無(wú)活性的單體亞單位(l)。當(dāng)三聚體TNF與55-60kDa和75-80kDa這兩種不同的細(xì)胞表面受體(2)p55TNFR和p75TNFR分別作用并隨后形成同型群集時(shí)，誘導(dǎo)生物學(xué)活性。據(jù)認(rèn)為，所述p55TNFR介導(dǎo)大多數(shù)TNF效應(yīng)(3，4,5,6,7，)，而所述p75TNFR由于其有更高的親和性(Kd=0.1x10-9M，而p55TNFR是0.5x10'9M),在增加TNF的局部濃度和將所述配體傳遞到p55TNFR的過(guò)程中起重要作用(8,9)。除了這些支持性或者調(diào)節(jié)性的效應(yīng)外，p75TNFR介導(dǎo)的直接信號(hào)傳遞也能夠促成幾種細(xì)胞反應(yīng)，例如胸腺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的增殖、GM-CSF分泌(2,10,11)，并且可以用于局部確定TNF內(nèi)源膜結(jié)合形式誘導(dǎo)的局部限制性反應(yīng)。證明TNF抗腫瘤功效的臨床試驗(yàn)顯示給予治療有效性大劑量TNF伴隨著不可接受的高水平系統(tǒng)性毒性，劑量限制性毒性通常是高血壓。因此，基本上已經(jīng)停止為腫瘤患者系統(tǒng)性給予TNF的嘗試。然而，TNF在一些動(dòng)物模型中的顯著抗腫瘤活性使得人們?nèi)匀挥锌赡茉谌梭w內(nèi)治療應(yīng)用TNF。然而，這需要尋找在系統(tǒng)性給藥時(shí)降低TNP毒性的方法，或者將TNF以相對(duì)或絕對(duì)選擇性傳遞到實(shí)際的治療靶(腫瘤)的方法?？焖贊庾NF(靜脈內(nèi))的人體最大耐受劑量是218-410|ig/m2(28)，比動(dòng)物體內(nèi)的有效劑量低約10倍(29)。根據(jù)來(lái)自鼠模型的數(shù)據(jù)，相信在人體內(nèi)獲得抗腫瘤效應(yīng)需要高至少I(mǎi)O倍的劑量。一種曾經(jīng)探索利用TNF的抗腫瘤活性同時(shí)避免其系統(tǒng)性毒性的方法是區(qū)域性或局部給藥。由此，TNF局部給藥在卡波西肉瘤、漿細(xì)胞瘤、卵巢腺癌和肝內(nèi)各種轉(zhuǎn)移性腫瘤中顯示鼓舞人心的反應(yīng)率(30，31)。至于區(qū)域性給藥，在將高劑量TNF與美法侖在孤立性月支體灌注中聯(lián)合應(yīng)用以治療肢端黑素瘤和肉瘤時(shí)，獲得驚人的結(jié)果。該方法獲得90-10()o/。的完全反應(yīng)率，使腫瘤出現(xiàn)出血性壞死(32),該觀察結(jié)果與來(lái)自一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤模型的臨床前研究一致。雖然這些結(jié)果是鼓舞人心的，但這些方法的應(yīng)用性由于兩個(gè)主要原因而可能仍然受到限制。第一，現(xiàn)在以及將來(lái)，在可以設(shè)想應(yīng)用局部區(qū)域療法的大多數(shù)情況下，有可能應(yīng)用其它公知的干預(yù)方法(如外科手術(shù)、》丈射療法)更多。第二，才艮據(jù)定義，惡性腫瘤傾向于擴(kuò)散，并且奉預(yù)先排除局部區(qū)域療法的情況下，對(duì)于新治療方法的醫(yī)學(xué)需要最迫切。在關(guān)于高溫孤立性肢體灌注的第一個(gè)臨床研究中，單劑量4mgTNP與美法侖和干擾素Y聯(lián)合給藥獲得高反應(yīng)率(32)。其它研究工作顯示可以省略干擾素y,并且甚至更低劑量的TNF足以誘導(dǎo)治療反應(yīng)(33，34)。由于這些治療并非沒(méi)有毒性風(fēng)險(xiǎn)，因此用TNF衍生物靶向血管可能代表在該情況下降低毒性效應(yīng)的一種替代方法。發(fā)明詳述下面通過(guò)非限制性舉例的方式描述本發(fā)明的各種優(yōu)選特征和實(shí)施方案。雖然本文提到的技術(shù)一般是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，但可以參考尤其是Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(1989)和Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)第四版，JohnWiley&Sons,Inc(以及CurrentProtocolsinMolecularBiology完整版)。綴合物本發(fā)明涉及一種綴合物，所述綴合物是通過(guò)遺傳融合或化學(xué)偶聯(lián)形成的分子，包含連接至少一個(gè)細(xì)胞因子的至少一個(gè)靶向部分/多肽。"連接，，指第一個(gè)和笫二個(gè)序列相互連接，以便所述第二個(gè)序列能夠借助所述第一個(gè)序列轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞。由此，綴合物包括其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與一種細(xì)胞因子通過(guò)它們的多肽骨架而連接的融合蛋白,所述融合蛋白如下獲得遺傳表達(dá)編碼這些蛋白的DNA分子，直接合成蛋白，然后通過(guò)交聯(lián)劑連接預(yù)先形成的序列，形成偶聯(lián)蛋白。該術(shù)語(yǔ)在本文中也包括所述細(xì)胞因子與所述靶向蛋白的締合，如聚集。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述第二個(gè)序列可包括多核苷酸序列。該實(shí)施方案可以視為蛋白/核酸復(fù)合物。所述第二個(gè)序列可以與所述第一個(gè)序列來(lái)自同一物種〗旦在本發(fā)明的綴合物中以不同于天然狀態(tài)的方式存在，或者來(lái)自不同物種。本發(fā)明的綴合物能夠靶向細(xì)胞，以便連接所述轉(zhuǎn)運(yùn)序列的多肽序列所對(duì)應(yīng)的效應(yīng)物功能能夠起作用。所述肽可以直接偶聯(lián)到所述細(xì)胞因子上，或者通過(guò)一個(gè)間隔區(qū)間接連接到所述細(xì)胞因子，所述間隔區(qū)可以是一個(gè)氨基酸、一個(gè)氨基酸序列或一個(gè)有機(jī)殘基，例如6-氨基辛?；?N-羥基琥珀酰亞胺。所述肽配體最好連接到所述細(xì)胞因子的N末端，以便最小化所述修飾細(xì)胞因子與其受體結(jié)合的任何干擾?；蛘撸鲭目梢赃B接到氨基或羧基鍵合受體的氨基酸殘基，該氨基酸殘基可以在所述分子上天然存在,或者使用遺傳工程技術(shù)人工插入。最好使用5'-連續(xù)序列編碼所述肽的cDNA，制備所述修飾細(xì)胞因子。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供TNF與CNGRC序列之間的綴合產(chǎn)物，其中所述TNF的氨基末端通過(guò)間隔區(qū)G(甘氨酸)連接到所述CNGRC肽。細(xì)胞因子藥物穿透進(jìn)入瘤細(xì)胞對(duì)于實(shí)體瘤化療的有效性是至關(guān)重要的?；熕幬镆竭_(dá)實(shí)體瘤中的癌癥細(xì)胞，必須進(jìn)入腫瘤血管，然后穿過(guò)血管壁，最后遷移穿過(guò)間質(zhì)。異質(zhì)性腫瘤灌注、血管滲透性和細(xì)胞密度以及間質(zhì)壓力增加是限制藥物進(jìn)入瘤細(xì)胞并由此限制化療有效性的關(guān)鍵障礙。因此，具有影響這些因素的效應(yīng)的細(xì)胞因子可用于本發(fā)明中?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞因子非限制性實(shí)例有TNFoc、TNF卩、IFNot、IFN卩、IFNy、IL-1、2、4、6、12、15、EMAPII、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。TNFTNF作為炎癥因子起作用，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮屏障功能改變、降低腫瘤間質(zhì)壓力以及增強(qiáng)化療藥物穿透作用和腫瘤血管損害的效應(yīng)。基于下面的觀察，首次提出存在腫瘤壞死因子的想法腫瘤患者在細(xì)胞感染后偶爾出現(xiàn)腫瘤的自發(fā)性退化。隨后在20世紀(jì)60年代的研究指出細(xì)胞產(chǎn)物作用下產(chǎn)生的宿主相關(guān)性(或內(nèi)源性)介質(zhì)有可能引起所述觀察到的效應(yīng)。1975年，顯示一種細(xì)菌誘導(dǎo)的循環(huán)因子對(duì)植入小鼠皮下的腫瘤有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。該因子被命名為腫瘤壞死因子(TNF)，隨后得到分離、克隆，并發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥的分子家族的原型。TNF受體和TNF超家族的其它成員也構(gòu)成相關(guān)蛋白的超家力美。TNF相關(guān)配體通常具有多種共同的特性。這些特性不包括高度總氨基酸(aa)序列同源性。除神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和TNF-(3外，所有配體都作為II型跨膜蛋白(細(xì)胞外C末端)合成，包含一個(gè)短的胞質(zhì)區(qū)段(10-80個(gè)氨基酸殘基)以及一個(gè)相對(duì)長(zhǎng)的細(xì)胞外區(qū)(140-215個(gè)氨基酸殘基)。NGF在結(jié)構(gòu)上與TNP無(wú)關(guān)，但也包括在該超家族中，僅僅因?yàn)樗軌蚪Y(jié)合TNFRSF低親和性NGF受體(LNGFR)。NGF具有典型信號(hào)序列肽，屬于分泌型。與此不同，TNF-P雖然也完全分泌，但具有與II型跨膜蛋白更相關(guān)的一級(jí)結(jié)構(gòu)?？梢哉J(rèn)為T(mén)NF-(3是具有無(wú)功能或無(wú)效跨膜區(qū)段的II型蛋白。一般地說(shuō)，TNFSF成員形成三聚體結(jié)構(gòu)，它們的單體由p鏈組成，形成兩個(gè)(3折疊結(jié)構(gòu)。這些分子的三聚體結(jié)構(gòu)提示TNSF和TNFRSF超家族的配體和受體在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中經(jīng)歷"群集"。TNF-a:人類(lèi)TNP-a是一種由233個(gè)氨基酸殘基組成的未糖基化多肽，或者是跨膜蛋白，或者是可溶性蛋白。當(dāng)TNTF-oc作為26kDa膜結(jié)合蛋白表達(dá)時(shí)，包括一個(gè)29氨基酸殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)28氨基酸殘基的跨膜區(qū)段以及一個(gè)176氬基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)。所述可溶性蛋白由一種85kDaTNF-a轉(zhuǎn)化酶(TACE)介導(dǎo)的蛋白水解切割產(chǎn)生，獲得一種17kDa、157個(gè)氨基酸殘基的分子，該分子通常作為同源三聚體循環(huán)。TNF-p/LT-a:TNF-P也稱(chēng)為淋巴毒素a(LT-a)，該分子的克隆與TNF-oc的克隆同時(shí)發(fā)生。雖然TNF-P作為一種171個(gè)氨基酸、25kDa的糖基化多肽ii^v循環(huán)，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為194個(gè)氨基酸殘基的更大形式。人類(lèi)TNF-(3cDNA編碼一個(gè)205個(gè)氨基酸殘基(在小鼠中是202個(gè)氨基酸殘基)的可讀框，在分泌過(guò)程中可能發(fā)生某種類(lèi)型的蛋白水解加工。與TNF-ot—樣，循環(huán)中的TNF-J3作為非共價(jià)連接的三聚體存在，并且已知其與TNF-a結(jié)合同樣的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TNF是TNF的一種突變形式，能夠選擇性結(jié)合其中一種TNF受體(LoetscherH等(1993)JBiolChem268:26350-7;VanOstadeX等(1993)Nature361:266-9)。已經(jīng)探索了幾種目標(biāo)在于降低TNTF的系統(tǒng)性毒性并保持其抗腫瘤活性的方法。雖然最終目的與前一部分相同，即增加治療指數(shù)，但基本原理卻顯著不同。在前面的情形中，一般性增強(qiáng)一種生物活性，即細(xì)胞毒性，最初被i人為是TNF體外相關(guān)性抗腫瘤活性；而在當(dāng)前情形中，選擇性修飾TNF的生物學(xué)表現(xiàn),保存一些活性，而喪失另一些活性。根據(jù)后一種原理進(jìn)行的工作大部分是利用這樣一種可能性即工程化TNF突變體，使其僅結(jié)合所述兩種TNFR中的其中一種。這一方向的努力開(kāi)始于下面的觀察人類(lèi)TNF僅結(jié)合兩種小鼠TNFR中的其中一種(p55TNFR)，與小鼠p75TNFR之間的相互作用是物種特異性的(2)。體內(nèi)研究顯示當(dāng)給予正常小鼠時(shí)，人類(lèi)TNF的系統(tǒng)性毒性比小鼠TNF低約50倍，而抗腫瘤活性相當(dāng)(44)。這些觀察提示保持與p75TNFR結(jié)合的TNF突變體可能比天然TNF有更有利的治療指數(shù)。之后通過(guò)定點(diǎn)誘變方法確實(shí)獲得這樣的受體選擇性TNF突變體(4，45)。用p55TNFR特異性突變體進(jìn)行的研究顯示在體內(nèi)抗腫瘤活性上它與天然TOF—樣有效，對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活性則被大大降低，而這兩種細(xì)胞類(lèi)型相信在TNF誘導(dǎo)的系統(tǒng)性毒性中起重要作用(6)。雖然考慮到這些突變體在抗腫瘤療法中的可能治療應(yīng)用，這些結(jié)果是非常鼓舞人心的，但觀察到p55TNFR在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)也在系統(tǒng)性毒性中起重要作用(46),以及當(dāng)所述突變體與增加對(duì)TNF敏感性的試劑(如IL-1、LPS或者在該情況中最重要的是在腫瘤本身存在下，所述試劑4吏生物對(duì)TNF壽文感，其作用方式與前人提到的外源給藥物質(zhì)相似)聯(lián)合給藥時(shí)毒性降低的效果減少(47)，使這種希望大大受挫?；谝陨峡紤]，我們提出將這些或者其它TNF突變蛋白與一種ocv(33配體偶聯(lián)，可能改善它們的治療指數(shù)。許多其它炎性細(xì)胞因子也具有增加內(nèi)皮血管滲透性的性質(zhì)，并且認(rèn)為本發(fā)明可以與增加所述細(xì)胞因子表達(dá)的試劑一起應(yīng)用于所述細(xì)胞因子。炎性細(xì)胞因子也稱(chēng)為促炎細(xì)胞因子，是多種分子量在5kDa到70kDa之間的多肽和糖蛋白。它們對(duì)于炎癥反應(yīng)有刺激性效應(yīng)。最重要的炎性細(xì)胞因子是TNF、IL-1、IL-6和IL-8。下表顯示一些被歸類(lèi)為炎性細(xì)胞因子的細(xì)胞因子。組別各個(gè)細(xì)胞因子內(nèi)源細(xì)月包因子IL畫(huà)1、TNF-a、IL-6正調(diào)節(jié)IL-1、TNF-ot、IL-6、IFN-a、IFN-(3、趨化因子刺激產(chǎn)生急性期反應(yīng)物IL-1、IL-6、IL國(guó)ll、TNF-a、IFN-Y、TGF-(3、LIF、OSM、CNTF化學(xué)引誘物細(xì)胞因子cxc趨化因子IL-8、PF誦4、PBP、NAP-2、卩-TGcc趨化因子MIP-la、MIP-lp、MCP-1、MCP-2、MCP-3、RANTESc趨化因子淋巴細(xì)胞趨化蛋白刺激炎性細(xì)胞因子IL-12TGF-P:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，LIF:白血病抑制因子；OSM:制癌蛋白M;CNTF:睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；PF-4:血小板因子4;PBP:血小板堿性蛋白；NAP-2:嗜中性粒細(xì)胞激活蛋白2;卩-TG:P-血小板球蛋白；MIP:巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白；MCP:單核細(xì)胞趨化蛋白。IL-ll、IFN-a、IFN-P以及尤其是趨化因子超家族成員也正調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在一些情況下，TGF-p具有多種炎癥效應(yīng)，包括對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和失活單核細(xì)胞的化學(xué)引誘物效應(yīng)。IL-2因?yàn)镮L-2/IL-2R系統(tǒng)在介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)中的核心作用，很明顯監(jiān)測(cè)和操作該系統(tǒng)有重要的診斷和治療意義。由于IL-2具有刺激攻擊腫瘤性TAK細(xì)胞和TIL(腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞)細(xì)胞的能力，它已經(jīng)顯示作為一種抗癌癥藥物的前途。然而，IL-2的毒性仍然是個(gè)問(wèn)題，值得研究。本發(fā)明解決了這個(gè)問(wèn)題。IL-15白介素15(IL-15)是一種新型細(xì)胞因子，與IL-2有許多共同的生物學(xué)性質(zhì)，但與IL-2缺乏tt酸序列同源性。IL-15最初在用猴腎上皮細(xì)胞系(CVI/EBNA)條件化的培養(yǎng)基中根據(jù)其對(duì)于鼠T細(xì)胞系CTLL-2的促有絲分裂活性而得到鑒定。IL-15也獨(dú)立地作為人成年T細(xì)胞白血病細(xì)胞系(HuT-102)產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)，它刺激T細(xì)胞增殖，被命名為IL-T。根據(jù)IL-2作為T(mén)細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和TIL的刺激物的活性，目前正在對(duì)IL-2進(jìn)行臨床試驗(yàn)，測(cè)試其對(duì)于治療癌癥和治療病毒感染的潛在應(yīng)用。因?yàn)镮L-15與IL-2有相似生物學(xué)活性，因此IL-15也有相似的治療潛力。趨化因子趨化因子是一個(gè)絕大部分由小分子分泌蛋白組成的超家族，作用與淋巴細(xì)胞運(yùn)輸、募集和再循環(huán)。它們也在許多病理生理學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，所述病理生理學(xué)過(guò)程例如變態(tài)反應(yīng)、感染性自身免疫病、血管發(fā)生、炎癥、腫瘤生長(zhǎng)和造血發(fā)生。這些蛋白中約80%的成熟形式有66到78個(gè)氨基酸(aa)。其余蛋白更大，在蛋白核心的上游存在其它氨基酸，或者作為延伸的C末端區(qū)段組成部分的其它氛基酸。所有趨化因子都通過(guò)七跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行信號(hào)傳遞。已知至少有十七種趨化因子，許多這些受體表現(xiàn)混雜的結(jié)合性質(zhì)，即幾種不同的趨化因子能夠通過(guò)同一種受體進(jìn)行信號(hào)傳遞。沖艮據(jù)保守氨基酸序列基序，趨化因子分為亞家族。大多數(shù)家族成員具有至少四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，所述四個(gè)半胱氨酸殘基形成兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。根據(jù)頭兩個(gè)半胱氨酸殘基的位置定義亞家族*oc亞家族，也稱(chēng)為CXC趨化因子，該家族在所述前兩個(gè)半胱氨酸殘基之間有一個(gè)氨基酸將這兩個(gè)殘基分開(kāi)。根據(jù)緊接著第一個(gè)半胱氨酸殘基之前是否存在glu-leu-arg(ELR)氨基酸基序，可以將該組進(jìn)一步分類(lèi)。目前有五種CXC特異性受體，它們命名為CXCR1到CXCR5。ELR+趨化因子結(jié)合CXCR2，通常作為嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)物和激活物起作用。ELR趨化因子結(jié)合CXCR3到5，主要作用于淋巴細(xì)胞。在寫(xiě)作本文時(shí)，在科技文獻(xiàn)上已經(jīng)報(bào)道14種編碼CXC趨化因子的不同人類(lèi)基因，此外還有一些由于可變剪接造成的多樣性。*(3亞家族，也稱(chēng)為CC趨化因子，所述前兩個(gè)半胱氨酸殘基相互臨近，沒(méi)有間插的氨基酸。目前有24種不同的人類(lèi)P亞家族成員。該組的受體命名為CCR1到CCRll。不同CC家族成員的耙細(xì)胞包括大多數(shù)類(lèi)型的白細(xì)胞。*有兩種已知蛋白與趨化因子同源，但不屬于a亞家族或p亞家族。淋巴細(xì)胞趨化蛋白是已經(jīng)喪失第一個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸的y類(lèi)(C趨化因子)的唯一成員。淋巴細(xì)胞趨化蛋白受體命名為XCR1。FractaMne是S類(lèi)的唯一已知成員(CX3C趨化因子)，在前兩個(gè)半胱氨酸殘基之間有三個(gè)間插氨基酸。該分子在趨化因子中是獨(dú)特的，因?yàn)樗荖末端趨化因子結(jié)構(gòu)域與長(zhǎng)粘蛋白樣柄融合的跨膜蛋白。fractalkine受體被稱(chēng)為CX3CR1。VEGF本發(fā)明還可應(yīng)用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。血管生成是從以前存在的血管系統(tǒng)發(fā)育出新血管的過(guò)程。VEGF在胚胎發(fā)育、組織的正常生長(zhǎng)、傷口愈合、雌性生殖循環(huán)(即排卵、月經(jīng)和胎盤(pán)發(fā)育)中起必不可少的作用，并且在許多疾病中起主要作用。特別關(guān)注癌癥，因?yàn)槿绻瘟鰶](méi)有新的血液供給，其生長(zhǎng)大小在數(shù)微米范圍內(nèi)。此外，形成血管是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散及生長(zhǎng)所必需的。一種最重要的內(nèi)皮生長(zhǎng)存活因子是VEGF。VEGF誘導(dǎo)血管形成以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其在調(diào)節(jié)血管形成中具有重要作用。VEGF是一種結(jié)合肝素的糖蛋白，作為45kDa的同二聚體分泌。大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型分泌VEGF,但內(nèi)皮細(xì)胞本身通常不分泌VEGF。由于VEGF-A(即最先發(fā)現(xiàn)的VEGF)增加血管滲透性，因此它被稱(chēng)為血管滲透因子。此外，VEGF引起血管舒張，部分是通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮合成酶。VEGF也能夠刺激細(xì)胞遷移并抑制編程性細(xì)胞死亡。有幾種VEGF-A的剪接變體。主要的幾種分別包括121、165、189和206個(gè)氨基酸，其中每一種都包含添加的一個(gè)特異性的外顯子。EMAPII內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞激活多肽-II(EMAP-n)是一種細(xì)胞因子，作為腫瘤血管發(fā)育過(guò)程中的抗血管生成因子起作用，并且強(qiáng)烈抑制腫瘤生長(zhǎng)。重組人EMAP-II是一種包含166個(gè)氨基酸殘基的18.3kDa蛋白。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EMAPII增加血管內(nèi)皮的滲透性。PDGF也已經(jīng)有人提出血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)拮抗劑可能增加許多種類(lèi)抗肺瘤藥劑在普通實(shí)體瘤中的藥物t聶入和治療效應(yīng)。PDGF是一種30kDa的細(xì)胞因子，受傷時(shí)由血小板釋放，刺激臨近細(xì)胞生長(zhǎng)并4務(wù)復(fù)傷口。PD-ECGF正如它的名字所提示的，血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)最初從血小板中根據(jù)其刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的能力而被分離。其相關(guān)蛋白^JM抑制素。靶向部分我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)將細(xì)胞因子靶向腫瘤血管，可以增加所述細(xì)胞因子的治療指數(shù)。此外，由于已知腫瘤細(xì)胞能夠形成腫瘤血管系統(tǒng)內(nèi)層組成部分，因此本發(fā)明包括直接靶向腫瘤細(xì)胞以及靶向其血管系統(tǒng)。任何方便的肺瘤或腫瘤血管系統(tǒng)(尤其是內(nèi)皮細(xì)胞)靶向部分可以用于本發(fā)明的綴合物。已知許多這樣的靶向部分，這些靶向部分和由它們可獲得的任何部分都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向部分是由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體的結(jié)合配偶體，例如配體；或者是腫瘤細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)的一種標(biāo)記或成分的結(jié)合配偶體，例如抗體。更具體地說(shuō)，所述靶向部分是由胂瘤相關(guān)血管表達(dá)的受體的結(jié)合配偶體，例如配體；或者是與血管生成血管結(jié)合的細(xì)胞外基質(zhì)的一種內(nèi)皮標(biāo)記或成分的結(jié)合配偶體，例如抗體。術(shù)語(yǔ)結(jié)合配偶體在本文中以其最廣泛的意義使用，包括天然和合成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中包括配體和抗體或其結(jié)合片段。因此，所述結(jié)合配偶體可以是一種抗體或其片段(如Fab、Fv、單鏈Fv)、一種肽或一種肽模擬物，肽^f莫擬物即一種類(lèi)似肽的分子，它能夠結(jié)合所述受體、所述細(xì)胞的胞外成分的標(biāo)記。下面描述合適靶向結(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例以及所述綴合物可以靶向的受體/標(biāo)記。CD13已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將某些細(xì)胞因子偶聯(lián)到氨肽酶-N受體的配體(CD13)，可以顯著改善它們的治療指數(shù)，增強(qiáng)它們的免疫治療效應(yīng)。CD13是一種在各種物種中高度保守的150kDa跨膜糖蛋白。它在正常細(xì)胞表面表達(dá)，也在骨髓腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，在形成血管性?xún)?nèi)皮以及一些上皮中表達(dá)。CD13受體通常被鑒定為"NGR"受體，因?yàn)樗碾呐潴w共有氨基酸"NGR"基序。所述配體最好是包含NGR基序的直鏈或環(huán)狀肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC或環(huán)狀CNGRC,或者更優(yōu)選是肽CNGRC。其它細(xì)節(jié)可以見(jiàn)我們的WO01/61017,該文通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TNF受體與TNF超家族的成員一樣，TNF受體超家族(TNFRSF)的成員也共有許多特性。具體地說(shuō)，TNFRSF中的分子都是I型(N末端在胞外)跨膜糖蛋白，在它們的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)到六個(gè)結(jié)合配體的富含半胱氨酸的40氨基酸殘基基序。此外，有功能的TNFRSF成員一般是通過(guò)內(nèi)部半胱氨酸二硫鍵穩(wěn)定的三聚體或多聚體復(fù)合物。與TNFSF的大多數(shù)成員不同，TNFRSF成員以膜結(jié)合形式和可溶形式兩種形式存在。最后，雖然所述超家族成員胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列同源性不超過(guò)25%，多種受體能夠在多種細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡信號(hào)，這^是示它們有共同的功能。CD40:CD40是一種50kDa的277個(gè)氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，主要與B細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。人類(lèi)CD40cDNA在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，編碼一個(gè)20氛基酸殘基的信號(hào)序列、一個(gè)173氨基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)、一個(gè)22氨基酸殘基的跨膜區(qū)段以及一個(gè)62氨基酸殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在細(xì)胞外區(qū)內(nèi)有四個(gè)富含半胱氨酸的基序，這些基序伴隨著富含絲氨酸和蘇氨酸的近膜序列。在多種已知表達(dá)CD40的細(xì)胞中，包括內(nèi)皮細(xì)胞。TNFRI/p55/CD120a:TNFRI是一種55kDa的455個(gè)氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，看起來(lái)由幾乎所有具核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。該分子具有一個(gè)190氨基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)、一個(gè)25氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和一個(gè)220氨基酸殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。TNF-a和TNF-P都結(jié)合TNFRI。在多種已知表達(dá)TNFRI的細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞是其中一種。TNFRII/p75/CD120b:人類(lèi)TNFRII是一種75kDa的461氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，最初從人類(lèi)肺成纖維細(xì)胞文庫(kù)中分離。該受體包括一個(gè)240氨基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)、一個(gè)27氨基酸殘基頂跨膜區(qū)段和一個(gè)173氨基酸殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定TNFRII的可溶形式，該可溶形式看起來(lái)是來(lái)自名為T(mén)RRE(TNF受體釋放酶)的金屬蛋白酶的蛋白水解切割。該脫落過(guò)程看起來(lái)與可溶性TNFRI的脫落過(guò)程相互獨(dú)立。在多種已知表達(dá)TNFRII的細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞是其中一種oCD134L/OX40L:OX40即OX40L的受體，是一種有P艮表達(dá)的T細(xì)胞激活標(biāo)記物，看起來(lái)在炎癥位點(diǎn)促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的存活(并且有可能延長(zhǎng)免疫反應(yīng))。OX40L也顯示有限的表達(dá)。根據(jù)目前的報(bào)道，僅有激活的CD4+、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)該因子。人類(lèi)配體是一種32kDa的183氨基酸殘基的糖基化多肽，包括21氨基酸殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)23氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和一個(gè)139氨基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)。VEGF受體家族在VEGF受體家族中有三種受體。它們與多種IgG樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和酪氨酸激酶活性具有共同特征。VEGF受體1(VEGFR1，也稱(chēng)為Flt-l)、VEGFR2(也稱(chēng)為KDR或Flt-l)和VEGFR3(也稱(chēng)為Flt-4)的酶結(jié)構(gòu)域由一個(gè)插入序列分開(kāi)。內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)其它VEGF受體，即Neuropilin-l和Neuropilin-2。VEGF-A結(jié)合VEGFRl和VEGFR2，也結(jié)合Neuropilin-l和Neuropilin-2。P1GF和VEGF-B結(jié)合VEGFRl和Neuropilin-l。VEGF-C和VEGF-D結(jié)合VEGFR3和VEGFR2。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV-tat和由其衍生的肽靶向VEGFR。PDGF受體在大多數(shù)常見(jiàn)的實(shí)體瘤中，PDGF受體在基質(zhì)部分表達(dá)。在一個(gè)大鼠結(jié)腸癌模型中，抑制基質(zhì)表達(dá)的PDGF受體將P務(wù)低腫瘤間質(zhì)壓力并增加胂瘤跨毛細(xì)管轉(zhuǎn)運(yùn)。PSMA前列腺特異性膜抗原(PSMA)也是一種極好的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，可以由此產(chǎn)生PSMA抗體。細(xì)胞粘著分子(CAM)細(xì)胞粘著分子(CAM)是細(xì)胞表面蛋白，涉及細(xì)胞(通常是白細(xì)胞)之間的相互結(jié)合，或者白細(xì)胞結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，或者白細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)。損傷和感染時(shí)產(chǎn)生的特異性信號(hào)控制某些這些粘著分子的表達(dá)和激活。這些CAM結(jié)合它們的受體/配體而引發(fā)的相互作用和反應(yīng)在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要作用，而所述炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)構(gòu)成機(jī)體抵抗這些攻擊的一道防線。大多數(shù)已經(jīng)表征的CAM分為三大蛋白家族免疫球蛋白(Ig)超家族、整聯(lián)蛋白家族或選擇蛋白家族。L-選擇蛋白是細(xì)胞表面分子選擇蛋白家族的一個(gè)成員，包含一個(gè)NH2末端C型凝集素結(jié)構(gòu)域、一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)補(bǔ)體控制結(jié)構(gòu)i或(complementcontroldomain)、一個(gè)15#^酸殘基間隔區(qū)、一個(gè)跨膜序列和一個(gè)短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定內(nèi)皮細(xì)月包表面L-選擇蛋白的三種配體，這三種配體都包含O-糖基化粘蛋白或粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域。第一種配體GlyCAM-l幾乎僅在外周淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的高內(nèi)皮小靜脈內(nèi)表達(dá)。第二種L-選擇蛋白配體最初稱(chēng)為sgp90,現(xiàn)在已知是CD34。這種唾液粘蛋白樣糖蛋白通常用作純化多能干細(xì)胞的表面標(biāo)記，在廣泛多種非淋巴組織的血管中表達(dá)，并且在外周淋巴結(jié)的毛細(xì)血管內(nèi)表達(dá)。L-選擇蛋白的第三種配體是MadCAM-l,—種在粘膜淋巴結(jié)高內(nèi)皮小靜脈上存在的粘蛋白樣糖蛋白。P-選擇蛋白是細(xì)胞表面分子選擇蛋白家族的一個(gè)成員，包括一個(gè)NH2末端C型凝集素結(jié)構(gòu)域、一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域、九個(gè)補(bǔ)體控制結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定四糖唾液酸Lewisx(sLex)是P-選擇蛋白以及E-選擇蛋白的配體，但P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白都可以在合適條件下結(jié)合sLex和sLea。據(jù)報(bào)道，P-選擇蛋白也選擇性結(jié)合在鼠骨髓細(xì)胞表面存在的160kDa糖蛋白以及在骨髓細(xì)胞、血液嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面存在的一種稱(chēng)為P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)的糖蛋白，PSGL-1配體也能夠結(jié)合E-選擇蛋白。特異性針對(duì)PSLG-1的單克隆抗體能夠完全抑制P-選擇蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞滾動(dòng)反應(yīng)，提示即使P-選擇蛋白能夠在體外條件下結(jié)合多種糖蛋白，但可能生理上重要的結(jié)合受到更多限制。許多證據(jù)指示P-選擇蛋白參與骨髓細(xì)胞以及B細(xì)胞和一個(gè)T細(xì)胞亞群粘著激活的內(nèi)皮。Ig超家族CAMIg超家族CAM是不依賴(lài)于鈣的跨膜糖蛋白。Ig超家族的成員包括細(xì)胞間粘著分子(ICAM)、血管細(xì)胞粘著分子(VCAM-1)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子(PECAM-1)和神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(NCAM)。每一種Ig超家族CAM都有一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與細(xì)胞骨架相互作用的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含保守半胱氨酸殘基的幾個(gè)Ig樣鏈內(nèi)二硫鍵結(jié)合環(huán)。一般地說(shuō)，它們結(jié)合整聯(lián)蛋白或其它Ig超家族CAM。所述神經(jīng)元CAM涉及神經(jīng)元才莫式化。內(nèi)皮CAM在免疫反應(yīng)和炎癥中起重要作用。更具體地說(shuō)，血管細(xì)胞粘著分子(VCAM-l、CD106或INCAM-110)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子(PECAM-1/CD3)和細(xì)胞間粘著分子1、2&3(ICAM-l、2&3)是五種在功能上相關(guān)的CAM/IgSF分子，在白細(xì)胞-結(jié)締組織/內(nèi)皮細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。這些分子主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，通常調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移穿過(guò)血管壁，并且是血管生成過(guò)程中產(chǎn)生內(nèi)皮附著位點(diǎn)，這些分子都是本發(fā)明的合適靶。人類(lèi)CD31是一種130kDa的I型(細(xì)胞外N末端)跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞粘著分子(CAM)或者IgSFl的C2樣亞組。成熟分子長(zhǎng)711個(gè)氨基酸(aa)殘基，包含一個(gè)574氨基酸殘基的細(xì)胞外區(qū)、一個(gè)19氨基酸殘基的跨膜區(qū)段以及一個(gè)118氨基酸殘基的胞質(zhì)尾。在所述細(xì)胞外區(qū)中，有九個(gè)潛在的N連接糖基化位點(diǎn)；由于其預(yù)測(cè)分子量是80kDa,因此看起來(lái)大部分這些位點(diǎn)都被占據(jù)。所述細(xì)胞外區(qū)最驚人的特性是存在六個(gè)Ig同源性單位，所述Ig同源性單位類(lèi)似于IgSF的C2結(jié)構(gòu)域。雖然它們?cè)跀?shù)量上不同，但這些組件的存在是所有IgSF粘著分子(ICAM-1、2、3&VCAM-1)的共同特征。整聯(lián)蛋白整聯(lián)蛋白是ot亞單位和卩亞單位非共價(jià)結(jié)合的異二聚體。目前，已經(jīng)鑒定16種oc亞單位和8種j3亞單位。它們能夠以不同方式結(jié)合，形成不同類(lèi)型整聯(lián)蛋白受體。針對(duì)幾種整聯(lián)蛋白的受體是粘著細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，例如纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。許多整聯(lián)蛋白識(shí)別tt^列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，該氨基酸序列RGD存在于它們結(jié)合的纖連蛋白或其它粘著蛋白上?？梢允褂冒鯮GD序列的肽和蛋白片段調(diào)節(jié)識(shí)別RGD的整聯(lián)蛋白的活性。因此，本發(fā)明可以使用整聯(lián)蛋白識(shí)別的肽作為靶向部分。這些肽傳統(tǒng)上稱(chēng)為"包含RGD的肽"。這些肽可以包括已經(jīng)鑒定為結(jié)合整聯(lián)蛋白的肽基序。這些基序包括氨基酸序列DGR、NGR和CRGDC。所述肽基序可以是線性或環(huán)狀的。所述基序在下面通過(guò)引用結(jié)合到本文的與RGD肽描述有關(guān)的專(zhuān)利中有更詳細(xì)的描述美國(guó)專(zhuān)利5,536,814，該專(zhuān)利描述環(huán)狀CRGDCL、CRGDCA和GACRGDCLGA。美國(guó)專(zhuān)利4,578,079涉及通式為X-RGD-T/C-Y的合成肽，其中X和Y是氨基酸。美國(guó)專(zhuān)利5,547,936描述一種包含序列X-RGD-XX的肽，其中X可以是氨基酸。美國(guó)專(zhuān)利4,988,621描述多種包含RGD的肽。美國(guó)專(zhuān)利4,879,237描述通式為RGD-Y的一般肽以及肽G-RGD-AP,其中Y是氨基酸。美國(guó)專(zhuān)利5,169,930描述結(jié)合ccv卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白的肽RGDSPK。美國(guó)專(zhuān)利5,498,694和5,700，908涉及卩3整聯(lián)蛋白亞單位的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，雖然該結(jié)構(gòu)域確實(shí)包含序列RDG,但嚴(yán)格來(lái)說(shuō)該序列不是包含RGD的肽。WO97/08203描述作為結(jié)構(gòu)模擬物或RGD結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)狀肽。美國(guó)專(zhuān)利5,612,311描述15種包含RGD的肽，所述肽能夠或者通過(guò)C-C連接環(huán)化，或者通過(guò)其它基團(tuán)如青霉胺或疏基正丙酸類(lèi)似物而環(huán)化。美國(guó)專(zhuān)利5,672,585介紹了一種包括含RGD肽的通式結(jié)構(gòu)。一類(lèi)優(yōu)選的肽是那些RGD的天冬氨酸殘基衍生成為O-曱氧基酪氨酸衍生物的肽。美國(guó)專(zhuān)利5,120,829描述一種RGD細(xì)胞粘著促進(jìn)結(jié)合位點(diǎn)和一種疏水附著結(jié)構(gòu)域。美國(guó)專(zhuān)利5,587,456中描述D形式。美國(guó)專(zhuān)利5,648,330描述一種對(duì)于GPIib/IIIa有高親和力的環(huán)狀包含RGD的肽。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶向部分是avP3或avP5整聯(lián)蛋白的配體。以前已經(jīng)報(bào)道應(yīng)用avp3配體傳遞細(xì)胞毒性化療藥物到腫瘤(『尸/卯-27575S/79卯7S)。然而，在這些專(zhuān)利申請(qǐng)中，其目的是將毒性化合物傳遞到腫瘤血管，例如化療藥物或毒素或抗血管生成化合物。與此不同，TNF是一種內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞功能的激活物，而不是抑制劑或毒性化合物。例如，相信TNF是一種促血管生成分子，而不是一種抗血管生成分子。此外，盡管發(fā)現(xiàn)TNF對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞系有細(xì)胞毒性，但已知在保護(hù)性機(jī)制沒(méi)有被阻斷(例如用轉(zhuǎn)錄/翻譯抑制劑阻斷)的情況下，TNF極少能殺死培養(yǎng)細(xì)胞。因此，看起來(lái)TNF的抗腫瘤活性是基于其對(duì)各種細(xì)胞的激活效應(yīng)，甚少或并不是基于對(duì)腫瘤細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性效應(yīng)。因此，可以將TNF視為生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，而不是傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化合物。因此，僅根據(jù)專(zhuān)利『尸/卯-"5/5&^PP9M，傳遞到av卩3的TNF的治療性質(zhì)是不明顯的。預(yù)期包含ACDCRGDCFCG基序的分子靶向激活的鼠血管以^A血管(72)因此，技術(shù)人員預(yù)期人類(lèi)RGD-TNF將比人類(lèi)TNF在患者體內(nèi)有更好的抗腫瘤特性，正如我們?cè)谛∈篌w內(nèi)用鼠RGD-TNF所觀察到的那樣。人體快速濃注TNF(靜脈內(nèi))的最大耐受劑量是218-410(ag/m2(28)，約比動(dòng)物體內(nèi)的有效劑量低10倍(29)。根據(jù)來(lái)自鼠模型的數(shù)據(jù)，相信在人體內(nèi)獲得抗腫瘤效應(yīng)需要10-50倍的劑量(35)。在關(guān)于高溫孤立性肢體灌注的第一個(gè)臨床研究中，單劑量4mgTNF與美法侖和干擾素Y聯(lián)合給藥獲得高反應(yīng)率(32)。其它工作顯示可以省略干擾素y，并且甚至更低劑量的TNF足以誘導(dǎo)治療反應(yīng)(33，34)。由于這些治療并非沒(méi)有毒性風(fēng)險(xiǎn)(35),因此應(yīng)用RGD-TNF可能代表至少在該情況下P爭(zhēng)低毒性效應(yīng)的一種替代方法。此外，可以使用RGD-TNFcDNA替代TNF基因用于基因治療目的(76)，而原則上可以聯(lián)合應(yīng)用生物素化RGD-TNF和生物素化抗體和抗生物素蛋白預(yù)靶向腫瘤(71)，以進(jìn)一步增加其治療指數(shù)。活化素已知表達(dá)ActRII的細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞。ActRIIB表達(dá)與ActRII表達(dá)同時(shí)出現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到這種現(xiàn)象。已知表達(dá)ActRI的細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞。也已經(jīng)在內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定出ActRIB。血管生成素血管生成素(ANG)是一種14kDa的非糖基化多肽，因?yàn)槠湔T導(dǎo)新血管生長(zhǎng)的能力而得名。膜聯(lián)蛋白V膜聯(lián)蛋白V是具有血管抗凝劑活性的蛋白的鈣和磷脂結(jié)合家族的一個(gè)成員。膜聯(lián)蛋白V存在各種不同名稱(chēng)胎盤(pán)蛋白4(PP4)、胎盤(pán)抗凝蛋白I(PAP1)、鈣磷脂結(jié)合蛋白I(CPB-I)、依賴(lài)于鈣的磷脂結(jié)合蛋白33(CaBP33)、血管抗凝蛋白a(VACa)、錨定蛋白CII、脂皮質(zhì)蛋白V、內(nèi)聯(lián)蛋白II和組織促凝血酶原激酶抑制劑。據(jù)報(bào)道，在腫瘤細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合位點(diǎn)是6-24x106個(gè)/細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)是8.8x106個(gè)/細(xì)胞。CD44另一種明顯涉及白細(xì)胞粘著事件的分子是CD44,該分子在造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)。CD44有顯著的產(chǎn)生可變剪接形式的能力，它的許多可變剪接形式在活性上不同。這種顯著的靈活性^f吏人們猜測(cè)CD44通過(guò)其變化的性質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞用以成功生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的一些方法中起作用。CD44是一種80-250kDaI型(細(xì)胞外N末端)跨膜糖蛋白。已知表達(dá)CD44H的細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞。存在多種CD44配體，包括骨橋蛋白、纖連蛋白、I型和IV型膠原蛋白和透明質(zhì)酸。據(jù)報(bào)道，與纖連蛋白的結(jié)合局限于表達(dá)硫酸軟骨素的CD44變體，其中硫酸軟骨素附著位點(diǎn)位于外顯子v8-vl1。有人提出，透明質(zhì)酸結(jié)合可能事實(shí)上存在于所有CD44同種型。主要結(jié)合位點(diǎn)之一可能在外顯子2的中心，涉及賴(lài)氨酸殘基和精氨酸殘基。除已知透明質(zhì)酸結(jié)合基序簡(jiǎn)單表達(dá)外的其它因素看起來(lái)對(duì)于透明質(zhì)酸結(jié)合也是必需的。表達(dá)外顯子、獨(dú)特胞質(zhì)尾、糖基化模式和細(xì)胞活性狀態(tài)綜合促進(jìn)成功的透明質(zhì)酸結(jié)合。因此，就其透明質(zhì)酸結(jié)合功能而言，每一種表達(dá)CD44的細(xì)胞都存在大量"潛在的"靈活性。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)術(shù)語(yǔ)"成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子"(FGF)是對(duì)于該細(xì)胞因子家族局限性描述。FGF的功能不限于細(xì)胞生長(zhǎng)。雖然某些FGF確實(shí)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，但目前已經(jīng)知道，最初的FGF分子(FGF-2或堿性FGF)也誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和其它細(xì)胞的增殖。它還能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和延長(zhǎng)神經(jīng)元的存活。目前，F(xiàn)GF超家族包括23種成員，所有成員都包含一個(gè)保守的120氨基酸(aa)核心區(qū)，該區(qū)包含六個(gè)相同的散在分布的氛基酸。FGF-1:人類(lèi)FGF-1(也稱(chēng)為酸性FGF、FGFa、ECGF和HBGF-1)是一種17-18kDa的未糖基化多肽，在三個(gè)胚層的各種細(xì)胞中表達(dá)。其結(jié)合分子可能是一種FGF受體。已知表達(dá)FGF-1的細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞。FGF-2:人類(lèi)FGF-2也稱(chēng)為堿性FGF、HBGF-2和EDGF,是一種18Da未糖基化多肽，已知具有細(xì)胞內(nèi)活性和細(xì)胞外活性。FGF-2分泌后，在細(xì)胞表面HS或者基質(zhì)糖胺聚糖上匯集。雖然FGF-2作為單體分泌，但細(xì)胞表面HS看起來(lái)將單體FGF-2二聚體化成為非共價(jià)連接的邊對(duì)邊構(gòu)型，該構(gòu)型隨后能夠使FGF受體二聚體化并將其激活。已知表達(dá)FGF-2的細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞。FGF-3:人類(lèi)FGF-3是z'W-2基因的產(chǎn)物[即由整合區(qū)2衍生，該區(qū)是小鼠染色體7上的一個(gè)區(qū)，包含在反轉(zhuǎn)錄病毒插入后被偶然激活的基因(^-2/FGF-3)]。該分子作為28-32kDa的222個(gè)M酸的糖蛋白合成，包含多種肽基序。已經(jīng)報(bào)ii^達(dá)FGF-3的細(xì)胞局限于發(fā)育細(xì)胞和肺瘤。已知表達(dá)FGF-3的腫瘤包括乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系。FGF-4:人類(lèi)FGF-4是一種22kDa的176個(gè)絲酸的糖蛋白，是受到發(fā)育調(diào)節(jié)的基因的產(chǎn)物。該分子作為206個(gè)氨基酸前體合成，包含一個(gè)大的還未定義的30個(gè)M酸序列以及兩個(gè)肝素結(jié)合基序(氨基酸51-55和140-143)。所述肝素結(jié)合位點(diǎn)與FGF-4活性直接相關(guān)肝素/類(lèi)肝素調(diào)節(jié)FGF-4激活FGFR1和FGFR2的能力。已知表達(dá)FGF-4的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和胚胎細(xì)胞。在人類(lèi)胃癌中也鑒定出該分子，使其獲得另一個(gè)命名(/fef-l/fef);在卡波西肉瘤中也分離出該分子，使其又獲得一個(gè)命名(K-FGF)。IL-1RIL-1通過(guò)結(jié)合于特異性受體而起作用。已經(jīng)鑒定兩種不同的IL-1受體結(jié)合蛋白以及一種非結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)輔助蛋白。上述每一種蛋白都有三個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣(Ig樣)結(jié)構(gòu)域，因此它們都是IV型細(xì)胞因子受體家族的成員。這兩種受體結(jié)合蛋白分別稱(chēng)為I型IL-1受體(IL-1RI)和II型IL-1受體(IL-1RII)。人類(lèi)IL-1Rl是一種552個(gè)tt酸的80kDa跨膜糖蛋白，該蛋白已經(jīng)從內(nèi)皮細(xì)胞分離出來(lái)。RTK已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個(gè)受體酪氨酸激酶(RTX)新家族，即Eph受體及其配體肝配蛋白，參與血管裝配、血管生成、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A類(lèi)Eph受體和它們的配體在腫瘤和相關(guān)的血管系統(tǒng)中水平提高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基質(zhì)蛋白酶(MMP)涉及肺瘤生長(zhǎng)、血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。也有人提議將它們作為腫瘤標(biāo)記。NG2NG2是一種大的整合于膜上的硫酸軟骨素蛋白聚糖，它首先被鑒定為未成熟神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的一種細(xì)胞表面分子。隨后發(fā)現(xiàn)NG2在廣泛范圍內(nèi)的未成熟細(xì)胞內(nèi)以及幾種極度惡性的腫瘤內(nèi)表達(dá)。人們已經(jīng)提議使用NG2作為腫瘤血管系統(tǒng)靶分子。具體地說(shuō)，膠原酶-l(Cl)是一種在新形成的微血管中存在的主要基質(zhì)金屬蛋白酶，是新血管形成的標(biāo)記。癌胚纖連蛋白已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血管生成期間纖連蛋白癌胚片段(Fn-f)的表達(dá)增加，有人提出將它作為腫瘤血管生成的一種標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，TTM是針對(duì)纖連蛋白癌胚ED-B結(jié)構(gòu)域的抗體或其片段。在Halin等(2002)NatureBiotechnology20:264-269中描述所述抗體的制備及其與IL-12的綴合。腱生蛋白腱生蛋白是在包括腦癌和乳腺癌以及黑素瘤等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)糖蛋白。它在惡性但沒(méi)有完全分化的腫瘤中表達(dá)，它與腫瘤血管的聯(lián)系使其成為了解惡性腫瘤生物學(xué)和血管生成的重要靶，并且也是治療癌癥的靶和標(biāo)記。所述靶向部分最好是能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管系統(tǒng)表面分子的多肽。除上面提到的分子外，其它已知或可獲得的類(lèi)似表面分子也可以成為這種重要序列的靶?？梢哉J(rèn)識(shí)到，技術(shù)人員可以應(yīng)用常規(guī)蛋白結(jié)合測(cè)定以鑒定結(jié)合表面分子的分子。也可以認(rèn)識(shí)到，技術(shù)人員可以應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)來(lái)發(fā)展結(jié)合表面分子的序列。如上文針對(duì)合成化合物所描述的高通量篩選也可以用于鑒定靶向分子。本發(fā)明還設(shè)想應(yīng)用竟?fàn)幮运幬锖Y選測(cè)定，其中能夠特異性結(jié)合靶的中和抗體與受試化合物竟?fàn)幗Y(jié)合靶。結(jié)合配偶體(BP)靶向部分通常采用表面分子結(jié)合配偶體(BP)的形式，包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者由一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。配體本發(fā)明的靶向部分可以為配體形式。配體可以是天然的或合成的。術(shù)語(yǔ)"配體，，也指化學(xué)修飾配體。BP的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域可以構(gòu)成例如一種受體的天然配體，天然配體可以是粘著分子或生長(zhǎng)因子受體配體(如表皮生長(zhǎng)因子)，或者保持與所述受體的結(jié)合活性的天然配體的片段。合成配體包括設(shè)計(jì)配體。在本文中，術(shù)語(yǔ)"設(shè)計(jì)配體"指其三維形狀與受體三維形狀的比較，有可能結(jié)合所述受體的試劑。抗體一方面，所述結(jié)合結(jié)合域可以來(lái)自免疫球蛋白(Ig)可變區(qū)的重鏈序列和輕鏈序列。所述可變區(qū)可以來(lái)自天然人類(lèi)抗體或者來(lái)自另一物種的抗體，如嚙齒動(dòng)物抗體。另一方面，所述可變區(qū)可以來(lái)自一種工程化抗體(如人源化抗體)，或者來(lái)自免疫或未免疫動(dòng)物的噬菌體展示文庫(kù)或者來(lái)自經(jīng)過(guò)誘變的噬菌體展示文庫(kù)。在第二種情況下，所述可變區(qū)可以來(lái)自單鏈可變片段(scFv)。所述BP可以包括其它序列，所述序列促成多聚體化，或者所述序列作為各結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的間隔區(qū)，或者所述序列來(lái)自在編碼所述BP的基因中插入限制性位點(diǎn)，包括Ig絞鏈序列或新型間隔區(qū)以及工程化的接頭序列。除一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)外，所述BP可以包括全部或部分Ig重鏈恒定區(qū)，并且可以因此包括整個(gè)天然Ig、工程化的Ig、工程化的Ig樣分子、單鏈Ig或者單鏈Ig樣分子。所述BP也可以包含來(lái)自另一蛋白如毒素的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。本文使用的"抗體"指一種蛋白，該蛋白包括一個(gè)或多個(gè)實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽?？贵w可以是完整的免疫球蛋白，或者是多個(gè)片段，包括不同肽酶消化產(chǎn)生的已經(jīng)明確鑒定的片段。雖然根據(jù)完整蛋白的消化已經(jīng)定義各種抗體片段，但技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)化學(xué)方法或利用重組DNA方法從新合成抗體片段。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體也包括對(duì)完整抗體進(jìn)行修飾而產(chǎn)生的抗體片段，或者使用重組DNA方法從新合成的抗體片段。術(shù)語(yǔ)"抗體"涵蓋的抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFV雙抗體和Fd片段。本發(fā)明還才是供針對(duì)所述表面蛋白的單克隆或多克隆抗體。因此，本發(fā)明還提供產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆或多克隆抗體的方法。假如需要多克隆抗體，就用攜帶一種或多種表位的免疫原性多肽免疫選定哺乳動(dòng)物(如小鼠、兔、山羊、馬等)。收集來(lái)自所述免疫動(dòng)物的血清，根據(jù)已知程序處理。假如血清在包含針對(duì)一種表位的多克隆抗體的同時(shí)，還包含針對(duì)其它抗原的抗體，那么可以通過(guò)免疫親合層析純化所述多克隆抗體。產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。為制備所述抗體，本發(fā)明還提供半抗原化到另一種多肽的本發(fā)明多肽或其片段，用作動(dòng)物或人類(lèi)的免疫原。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員也可以容易地產(chǎn)生針對(duì)所述多肽中結(jié)合細(xì)胞表面表位的單克隆抗體。通過(guò)雜交瘤制造單克隆抗體的一般方法是眾所周知的。可以通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生無(wú)限增殖的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系，或者利用其它方法，例如用癌性DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或者用EB病毒轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)各種特性篩選針對(duì)表位產(chǎn)生的各組單克隆抗體，即篩選同種型和表位親和性。另一種方法涉及篩選噬菌體展示文庫(kù)，其中例如噬菌體在它們的衣殼表面表達(dá)攜帶各種互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的scFv片段。該技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。為本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整抗體中保持對(duì)靶抗原的結(jié)合活性的片段，特別指出與該定義相反的情況除外。如上文提到的，所述片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段以及單鏈抗體(scFV)。此外，所述抗體及其片段可以是人源化抗體，例如在EP-A_239400中描述的人源化抗體。篩選本發(fā)明的一個(gè)方面涉及篩選能夠結(jié)合腫瘤或腫瘤血管系統(tǒng)細(xì)胞表面分子的試劑的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞表面分子與一種試劑接觸，然后確定所述試劑是否結(jié)合所述細(xì)胞表面分子。本文中術(shù)語(yǔ)"試劑"包括但不限于可從天然或非天然的任何合適來(lái)源獲得或產(chǎn)生的化合物，例如受試化合物?？梢詮幕衔镂膸?kù)設(shè)計(jì)或獲得所述試劑，所述化合物文庫(kù)可以包括肽以及其它化合物，例如小的有機(jī)分子，尤其是新型前導(dǎo)化合物。例如，所述試劑可以是天然物質(zhì)、生物大分子或生物學(xué)材料(例如細(xì)菌、真菌或動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織)提取物、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、合成的受試化合物、半合成的受試化合物、結(jié)構(gòu)或功能模擬物、肽、肽模擬物、衍化受試化合物、從完整蛋白切割下來(lái)的肽、用合成方法(例如使用肽合成儀)或通過(guò)重組技術(shù)或綜合方法而合成的肽、重組受試化合物、天然或非天然受試化合物、融合蛋白或其等同物、以及上述物質(zhì)的突變體、衍生物或它們的組合物。所述試劑可以是氨基酸序列或其化學(xué)衍生物。所述物質(zhì)甚至可以是有機(jī)化合物或其它化合物。所述試劑甚至可以是核苷酸序列，所述核苦酸序列可以是有義序列或反義序列。蛋白術(shù)語(yǔ)"蛋白"包括單鏈多肽分子以及多個(gè)多肽的復(fù)合物，在所述多個(gè)多肽的復(fù)合物中，各個(gè)組成多肽通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式連接。術(shù)語(yǔ)"多肽"包括兩個(gè)或多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度(通常超過(guò)5個(gè)、10個(gè)或20個(gè)氨基酸)的肽。多肽同源物可以知道，在本發(fā)明中應(yīng)用的多肽序列不限于具體序列或其片段，而且包括從任何來(lái)源獲得的同源序列，例如相關(guān)病毒/細(xì)胞蛋白、細(xì)胞同源物和合成肽以及它們的變體或衍生物。本發(fā)明的多肽序列也包括由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽。多肽變體、衍生物和片段有關(guān)本發(fā)明氨基酸序列的"變體"或"衍生物"包括所述序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或添加，只要獲得的氨基酸序列最好具有靶向活性，優(yōu)選具有序列表中多肽的至少25-50%的活性，更優(yōu)選在實(shí)質(zhì)上具有至少相同活性。因此，可以修飾序列以用于本發(fā)明。通常進(jìn)行修飾以保持所述序列活性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以進(jìn)行氨基酸取代，例如從1、2或3到10、20或30個(gè)tt酸取代，只要修飾后的序列保持至少約25到50%或基本相同的活性。然而，在替代實(shí)施方案中，可以有意對(duì)本發(fā)明多肽氨基酸序列進(jìn)行修飾，以降低所述多肽的生物學(xué)活性。例如可以使用仍然能夠結(jié)合靶分子但缺少功能效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的截短的多肽。一般地說(shuō)，與序列表中描述的對(duì)應(yīng)區(qū)相比，最好改變變體或衍生物20°/。、10%或5%以下的氨基酸殘基。氨基酸取代可以包括應(yīng)用非天然類(lèi)似物，例如增加作為治療藥物給予的多肽的血漿半衰期(詳見(jiàn)下文關(guān)于生產(chǎn)用于治療的肽衍生物)?？梢赃M(jìn)行保守性取代，例如根據(jù)下表制造。第二列同一欄內(nèi)的氨基酸，最好第三列同一行內(nèi)的氨基酸可以相互取代<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>本發(fā)明的多肽也包括上述多肽及其變體的片段，包括所述序列的片段。優(yōu)選片段包括那些包括表位的片段。合適片段至少長(zhǎng)約5個(gè)氨基酸，例如10個(gè)、12個(gè)、15個(gè)或20個(gè)氮基酸。它們的長(zhǎng)度也可以少于200個(gè)、100個(gè)或50個(gè)氨基酸。所述蛋白及其等位基因變體和物種變體的多肽片段可以包含一個(gè)或多個(gè)(如2、3、5或10個(gè))取代、缺失或插入，包括保守取代。當(dāng)例如通過(guò)重組技術(shù)進(jìn)行取代、缺失和/或插入時(shí)，最好改變少于序列表氨基酸殘基的20%、10%或5%。通常通過(guò)重組方法生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白，所述重組方法例如下面所述的方法。然而，可以使用技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，通過(guò)合成方法制造所述蛋白，例如固相合成。用于肽化學(xué)合成的各種技術(shù)的綜述見(jiàn)Borgia和Fields,2000，TibTech18:243-251，在該文的參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述了這些技術(shù)。制備在WO01/61017中已經(jīng)描述制備CD13L-IFN的方法。例如，可以通過(guò)遺傳工程或化學(xué)合成使干擾素Y與CNGRC肽融合?？紤]到干擾素Y的二聚體結(jié)構(gòu)，在N末端或C末端攜帶兩個(gè)CNGRC部分的綴合物優(yōu)選提供多價(jià)高親合力相互作用。使用相似方法，可制備與CNGRC-TNF聯(lián)合使用的CRGDC-IFN-y綴合物。技術(shù)人員可以容易地制備av(33-L-TNF與抗體或抗體片段的綴合物，所述抗體或抗體片段針對(duì)腫瘤細(xì)胞或肺瘤相關(guān)血管，進(jìn)一步增加該TNFf;t生物到腫瘤的耙向。例如，avP3L-TNF可以偶聯(lián)抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體或抗其它腫瘤抗原性標(biāo)記(如基質(zhì)金屬蛋白酶(57)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(58))的抗體，或者偶聯(lián)靶向細(xì)胞外基質(zhì)成分的抗體，例如抗腱生蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB結(jié)構(gòu)域抗體?？梢酝ㄟ^(guò)各種方法制備所述av(33L-TNF綴合物。例如，所述av(33L是一種抗體或其片段，最好是人類(lèi)來(lái)源的抗體或攜帶人源化支架結(jié)構(gòu)的抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述av(33L是一種肽。例如，最近已經(jīng)使用噬菌體肽文庫(kù)發(fā)現(xiàn)結(jié)合avP3的一種肽。該肽的特征在于存在序列CRGDC?？梢証使用眾所周知的重組DNA技術(shù)或通過(guò)化學(xué)綴合，將肽或抗體偶聯(lián)到TNF。也可以通過(guò)間接綴合制備這些分子例如，可以使它們生物素化，然后使用四價(jià)抗生物素蛋白作為非共價(jià)交聯(lián)劑偶聯(lián)。治療肽可以將本發(fā)明的肽作為治療藥物給予患者。優(yōu)選使用不僅僅包括天然氨基酸、而且包括修飾氨基酸的肽，例如以便降低免疫原性、增加其在患者體內(nèi)的循環(huán)半衰期、增加生物利用率和/或增強(qiáng)功效和/或特異性。已經(jīng)使用多種方法修飾用于治療應(yīng)用的肽。一種方法是將所述肽或蛋白連接到多種聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)5,091,176、5，214，131和5,264,209。也可以使用多種非編碼性氨基酸或修飾氨基酸如D-feJ^酸和N-曱基M酸取代天然氨基酸，對(duì)肽進(jìn)行修飾。另一種方法是使用雙功能交聯(lián)劑，例如N-琥珀酰亞胺基3-(2他咬基二硫基)丙酸酯、琥珀酰亞胺基6-[3-(2吡p定基二硫基)丙酰胺基]己酸酯和磺基琥珀酰亞胺基6-[3-(2吡p先基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,580,853)。優(yōu)選使用本發(fā)明構(gòu)象受到限制的肽^f汙生物。構(gòu)象限制指肽三維形狀的穩(wěn)定性?xún)?yōu)選構(gòu)象。構(gòu)象限制包括涉及限制肽內(nèi)一個(gè)殘基的構(gòu)象活動(dòng)性的局部限制；涉及限制一組殘基的構(gòu)象活動(dòng)性的區(qū)域限制，涉及的殘基可以形成某種二級(jí)結(jié)構(gòu)單位；以及涉及整個(gè)肽結(jié)構(gòu)的整體限制?？梢酝ㄟ^(guò)共價(jià)修飾如環(huán)化，或通過(guò)插入y-內(nèi)酰胺或其它類(lèi)型的鍵，穩(wěn)定所述肽的活性構(gòu)象。例如，可以將側(cè)鏈環(huán)化到骨架，以便在相互作用位點(diǎn)的每一側(cè)創(chuàng)造L卞內(nèi)酰胺。一般地，見(jiàn)Hruby等，"合成肽的應(yīng)用,"SyntheticPeptides:AUser'sGuide:259-345(W.H.Freeman&Co.1992)。也可以如下獲得環(huán)化例如，形成半胱氨酸橋^t,偶聯(lián)相應(yīng)末端氨基酸的氨基末端基團(tuán)和羧基末端基團(tuán)；或用Asp、Glu或相關(guān)類(lèi)似物的氣基偶聯(lián)Lys殘基或相關(guān)類(lèi)似物的M基團(tuán)。也可以采用碘乙酸酐，使賴(lài)氨酸殘基的s氨基基團(tuán)偶聯(lián)多肽的a氨基基團(tuán)。見(jiàn)Wood和Wetzel，1992,Int，lJ.PeptideProteinRes.39:533-39。在美國(guó)專(zhuān)利5,891,418中描述的另一種方法是在肽結(jié)構(gòu)中包括螯合金屬離子的骨架。通常優(yōu)選的金屬肽骨架基于給定金屬離子內(nèi)配位層所必需的特定配位基團(tuán)的必需數(shù)目。一般地說(shuō)，大多數(shù)有用的金屬離子具有配位數(shù)四到六。狀鏈中配位基團(tuán)包括胺、酰胺、咪唑、胍基官能度的氮原子；硫醇或二硫化物的硫原子；以及羥基、酚、羰基或羧基官能度的氧原子。此外，可以用在化學(xué)上改變肽鏈或各個(gè)氨基酸，以包括配位基團(tuán)，例如肟、肼基、硫氫基、磷酸基、氰基、吡啶子基、哌啶子基或嗎啉代。所述肽構(gòu)建物可以是線性或環(huán)狀，然而通常優(yōu)選線性構(gòu)建物。小線性肽的一個(gè)例子是Gly-Gly-Gly-Gly,該肽在骨架上具有四個(gè)氮原子(N4復(fù)合系統(tǒng))，能夠與配位數(shù)為四的金屬離子*。改善治療肽性質(zhì)的另一技術(shù)是使用不屬于肽的肽模擬物。可以使用多種有用技術(shù)闡明肽的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些技術(shù)包括氨基酸測(cè)序、x-射線晶體學(xué)、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、計(jì)算機(jī)輔助分子建模、肽作圖以及它們的組合。對(duì)肽的結(jié)構(gòu)分析一般提供大量數(shù)據(jù)，其中包括所述肽的氨基酸序列和其原子成分的三維位置。根據(jù)該信息，可以設(shè)計(jì)不屬于肽的肽模擬物，所述肽模擬物具有治療活性所需的化學(xué)官能性但更穩(wěn)定，例如對(duì)于生物學(xué)降解更不敏感。美國(guó)專(zhuān)利5,811,512中提供了該方法的一個(gè)例子。化學(xué)合成本發(fā)明治療性肽的技術(shù)在上面參考文獻(xiàn)中描述，另見(jiàn)綜述Borgia和Fields,2000,TibTech18:243-251，而且詳見(jiàn)所述文獻(xiàn)中的參考文獻(xiàn)。雙功能衍生物本發(fā)明的另一實(shí)施方案是雙功能衍生物，在所述雙功能衍生物中受到TTM修飾的細(xì)胞因子偶聯(lián)抗腫瘤抗原或其它腫瘤血管生成標(biāo)記(如av整聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶或血管生長(zhǎng)因子)的抗體或它們的片段，或者偶聯(lián)對(duì)抗細(xì)胞外基質(zhì)成分的抗體或其片段，例如抗腱生蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB結(jié)構(gòu)域抗體。最近已經(jīng)報(bào)道，制備TNF與胃腺癌和卵巢腺癌表達(dá)的抗腫瘤相關(guān)TAG72抗原的mAb絞鏈區(qū)之間的融合產(chǎn)物。本發(fā)明的再一實(shí)施方案是用生物素蛋白/抗生物素蛋白系統(tǒng)預(yù)靶向腫瘤。根據(jù)該方法，在不同階段，在腫瘤抗原性位點(diǎn)獲得三元復(fù)合物，所述三元復(fù)合物由以下部分組成l)生物素化mAb、2)抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)和3)用TTM和生物素修飾的二價(jià)細(xì)胞因子。多份資料證明與用免疫綴合物常規(guī)靶向相比，所述預(yù)靶向方法實(shí)際上增加耙向耙的活性分子與游離活性分子的比例，由此降低治療毒性。該方法用生物素化TNF產(chǎn)生有利的結(jié)果，所述生物素化TNF能夠在正常TNF沒(méi)有活性的條件下，在體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性并減少腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。也可以使用同時(shí)結(jié)合腫瘤抗原和修飾細(xì)胞因子的雙特異性抗體，通過(guò)兩相程序進(jìn)行所述預(yù)靶向方法。最近已經(jīng)描述應(yīng)用對(duì)抗癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體作為T(mén)NF腫瘤預(yù)靶向的方法。腫瘤預(yù)靶向是最近發(fā)展的另一種方法?？梢愿鶕?jù)"兩步驟"或"三步驟"方法(59)，用各種不同類(lèi)的化合物進(jìn)行預(yù)靶向。一個(gè)具體例子可以幫助闡述該原則，該具體例子根據(jù)應(yīng)用于腫瘤放射性免疫閃爍照相術(shù)的抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)。在這種情況下，首先給予特異性4f對(duì)肺瘤相關(guān)抗原的生物素化mAb("把向"分子，第一步)。第二天，給予抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白("追蹤"分子，第二步)；抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白是四價(jià)大分子，結(jié)合生物素化mAb，促進(jìn)快速去除多余的循環(huán)分子。又一天后，給予放射性核素標(biāo)記的生物素("效應(yīng)物"分子，第三步)。這個(gè)時(shí)候"靶向"大分子和"追蹤，，大分子都已經(jīng)從循環(huán)中有效清除。這使得所述效應(yīng)物能夠快速擴(kuò)散和定位到腫瘤，以及快速排泄多余的循環(huán)游離分子。這與直接標(biāo)記的mAb形成明顯對(duì)比；直接標(biāo)記的mAb循環(huán)顯著更長(zhǎng)時(shí)間，由此增加放射性免疫閃爍照相術(shù)的背景以及放射免疫療法的毒性副作用。幾個(gè)報(bào)道已經(jīng)顯示與使用免疫綴合物的常規(guī)靶向相比，所述預(yù)靶向方法確實(shí)可以顯著改善靶與血液的比例，并降低治療毒性(60,61,62,63)。應(yīng)用預(yù)耙向策略于4吏用生物素化TNF的胂瘤療法被認(rèn)為尤其有<介值，因?yàn)榕cTNF-TNFR相互作用的親和力相比，生物素-抗生物素蛋白相互作用有顯著更高的親和力(1(T15M)。預(yù)期這將允許生物素化TNF有效地優(yōu)選結(jié)合預(yù)中靶細(xì)胞而不是表達(dá)TNFR的細(xì)胞，增強(qiáng)其在腫瘤位點(diǎn)的持久性。在該基本原理的基礎(chǔ)上，最近已經(jīng)描述用三步驟mAb/抗生物素蛋白系統(tǒng)耙向生物素化TNF(Moro,1997)。已經(jīng)用Thy1.1等位基因轉(zhuǎn)染小鼠RMA淋巴瘤細(xì)胞，創(chuàng)造獨(dú)特的turn,Gasparri等(71)?？梢允褂靡环N相似方法進(jìn)一步增加生物素化avJ33L-TOF的治療指數(shù)。所述av(33L-TNF預(yù)靶向策略不一定限制于"三步驟"方法。文獻(xiàn)中描述的"兩步驟"方法的例子基于應(yīng)用雙特異性抗體，所述雙特異性抗體一個(gè)臂特異性針對(duì)腫瘤抗原，另一個(gè)臂特異性針對(duì)TNF。具體地說(shuō)，最近已經(jīng)描述應(yīng)用針對(duì)癌胚抗原和TOF的雙功能性抗體，將TNF靶向肺瘤(64)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包含在不同TNF亞單位上綴合TTM以及一種抗體或其片段(直接綴合或通過(guò)生物素-抗生物素蛋白橋鍵綴合)的細(xì)胞因子，其中所述抗體或其片段針對(duì)在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗原或胂瘤基質(zhì)的其它成分，如腱生蛋白和纖連蛋白EDB結(jié)構(gòu)域。這改善所述修飾細(xì)胞因子的腫瘤耙向特性，并且在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)三體_單體_三體轉(zhuǎn)化，緩慢釋放所述修飾細(xì)胞因子。例如TNF綴合物的修飾亞單位可以從耙向化合物解離并重新結(jié)合，形成未修飾的三體TNF分子，所述未修飾的三體TNF分子隨后擴(kuò)散到腫瘤微環(huán)境中。已經(jīng)顯示，生物活性TNF的釋i丈在靶向24-48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)。脂質(zhì)體形式的細(xì)胞因子制劑能夠改善其生物活性。事實(shí)上，已經(jīng)觀察到TNFM基團(tuán)的酰化作用誘導(dǎo)其疏水性增加，而不損失體外生物學(xué)活性。此外，已經(jīng)報(bào)道，結(jié)合脂質(zhì)的TNF的細(xì)胞毒性在體外不受影響，免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)不受影響，體內(nèi)毒性降低。將avp3L-TNF膠嚢化在脂質(zhì)體中是改善其生物學(xué)性質(zhì)的另一方法。觀察到TNF—些氨基基團(tuán)的?；瘜?dǎo)致其疏水性增加而不損失體外生物學(xué)活性，這提示該方法的可行性。已經(jīng)利用該發(fā)現(xiàn)，容易地使TNF整合例如脂載體。已經(jīng)報(bào)道，所述結(jié)合脂質(zhì)的TNF具有未受改變的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性，以及未受改變的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，同時(shí)體內(nèi)毒性效應(yīng)降低(48，49)。用聚乙二醇衍化av(33L-TNF(聚乙醇化)可以認(rèn)為是延長(zhǎng)其半衰期的優(yōu)選選擇。在許多情況下，TNF在體內(nèi)的測(cè)量半衰期并不真實(shí)。因此，觀察到該參數(shù)高度依賴(lài)于給藥劑量，在增加TNF劑量的情況下觀察到不成比例的半衰期增加(50)。對(duì)該現(xiàn)象的解釋是在低劑量下，可溶性循環(huán)TNTFR有效結(jié)合TNF(51)。所述可溶性TNFR在用TNF系統(tǒng)性治療的患者血清內(nèi)快速增加(52)，通過(guò)對(duì)表面結(jié)合受體的蛋白水解切割產(chǎn)生。在通常用于測(cè)量TNF水平的大多數(shù)測(cè)定中，結(jié)合于循環(huán)TNFR的TNTF可能逃過(guò)檢測(cè)。在所有可溶性TNFR(1^4TNFR以及TNF誘導(dǎo)的TNFR)飽和時(shí)的閾值水平以上，開(kāi)始4企測(cè)到未結(jié)合的循環(huán)TNF，由此更準(zhǔn)確地反映TNF的有效體內(nèi)半衰期。清楚的是，TNF的聚乙醇化預(yù)期不排除TNFR的清除效應(yīng)，因此，任何目標(biāo)在于延長(zhǎng)TNF半衰期，一般來(lái)說(shuō)降低TNF給藥劑量的方法必需處理以下事實(shí)即為了使TNF有活性，體內(nèi)TNF水平必須超過(guò)可溶性循環(huán)TNFR的結(jié)合量。然而，解決這個(gè)問(wèn)題的一種可能性是誘變CD13L-TNF，降低其與天然TNF受體相互作用的能力，由此可以給予更高劑量。聯(lián)合應(yīng)用方法已經(jīng)探索過(guò)的在系統(tǒng)給予TNF時(shí)獲得更有利治療指數(shù)的最早方法之一是聯(lián)合應(yīng)用TNF和其它藥物。技術(shù)人員希望發(fā)展出給予更低劑量TNF、既保持抗腫瘤活性、系統(tǒng)性毒性又低的治療方法。該原理在很大程度上是猜測(cè)的，因?yàn)椴豢赡芘懦龇椒赡茉诙拘苑矫娉霈F(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，并因此導(dǎo)致與單獨(dú)應(yīng)用TNF觀察到的相同治療指數(shù)。事實(shí)上，在人體中已經(jīng)研究過(guò)的所述聯(lián)合治療方案中，已經(jīng)證明是后一種情況。其中一種得到最廣泛研究的方法是聯(lián)合應(yīng)用TNF和IFN-y(36，37),具體地說(shuō)是因?yàn)檫@些細(xì)胞因子對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的協(xié)同作用。所述第二種方法是與化療聯(lián)合應(yīng)用。已經(jīng)在一些實(shí)驗(yàn)胂瘤模型中，研究聯(lián)合應(yīng)用TNF以及據(jù)說(shuō)與TNF協(xié)同作用的一些化合物的方法。不幸的是，這種治療伴隨著系統(tǒng)性毒性增加。靶向傳遞TNF到腫瘤血管是最近探索的增加TNF治療指數(shù)的一種方法。WO01/61017描述通過(guò)偶聯(lián)tntf和氨肽酶n(CD13)的一種配體而制備的TNF衍生物，所述TNF衍生物的治療指數(shù)改善，其中所述CD13是在腫瘤血管表達(dá)的一種膜蛋白酶。該細(xì)胞因子以非常復(fù)雜的方式與CD13和TNF受體相互作用，在低劑量選擇性激活腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞?？紤]到TNF與IFN對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)，推薦用綴合CD13配體的兩種細(xì)胞因子靶向內(nèi)皮細(xì)胞。然而，^R術(shù)人員預(yù)期這些修飾細(xì)胞因子在內(nèi)皮細(xì)胞表面竟?fàn)幫皇荏w(CD13),導(dǎo)致喪失靶向性和活性。WO01/61017教導(dǎo)如何制備該細(xì)胞分子與CD13配體的綴合物，如NGR-TNF和NGR-IFN-y。在我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的基本方法是給予同時(shí)綴合CD13配體(CNGRC)的TNF和IFN-y;這些實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)在動(dòng)物模型中注射這些修飾細(xì)胞因子時(shí)，它們的治療活性確實(shí)低于單獨(dú)給藥，大概是因?yàn)樗鼈兙範(fàn)幫粋€(gè)靶向受體。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)例如將TNF靶向一種不同于CD13的腫瘤血管受體并將IFN々耙向CD13(如通過(guò)將其偶聯(lián)到CNGRC肽)，或者相反，可以將這些細(xì)胞因子靶向血管而沒(méi)有交叉結(jié)合干擾。在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案中，TNF偶聯(lián)到av(33的配體，例如包含CRGDC基序的肽。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聯(lián)合應(yīng)用avb3L-IFN-y衍生物以及CD13配體-TNF。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供avb3L-TNF衍生物與CD13配體-IFN-y的聯(lián)合應(yīng)用。多核苷酸用于本發(fā)明的多核苷酸包括編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸序列。技術(shù)人員知道，由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，多種不同的多核苷酸可以編碼同一種多肽。此外，技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)，制造不影響本發(fā)明多核苷酸所編碼的多肽序列的核苷酸取代，以反應(yīng)本發(fā)明多肽所需要表達(dá)的任何具體宿主生物體內(nèi)的密碼子使用。本發(fā)明的多核苷酸可以包括DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈。它們也可以是在其中包括合成或修飾核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域內(nèi)已知多種不同類(lèi)型寡核苷酸修飾。這些包括甲基磷酸和硫代磷酸骨架、在所述分子3'末端和/或5'末端加入吖啶或聚賴(lài)氨酸鏈。為本發(fā)明的目的，可以用本領(lǐng)域內(nèi)可利用的任何方法修飾本文描述的多核苷酸?？梢赃M(jìn)行所述修飾以增強(qiáng)本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)活性或壽命。核苦酸載體可以將本發(fā)明的多核苷酸插入重組復(fù)制型栽體。所述載體可以用于在相容宿主細(xì)胞中復(fù)制所述核酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入一種復(fù)制型載體，將所述載體引入一種相容的宿主細(xì)胞，然后在產(chǎn)生所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞?？梢詮乃鏊拗骷?xì)胞中回收所述載體。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌如大腸桿菌(五.co//)、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和其它真核細(xì)胞系，例如昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞。載體中的本發(fā)明多核苷酸最好有效連接一種能夠使所述宿主細(xì)胞表達(dá)編碼序列的控制序列，即所述載體是一種表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)"有效連接，，指所述成分處于以既定方式起作用的關(guān)系。調(diào)節(jié)序列與編碼序列"有效連接"的方式使得在與所述控制序列相容的條件下表達(dá)所述編碼序列?？梢孕揎椝隹刂菩蛄?，例如通過(guò)加入其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，使所述控制序列指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑更敏感?？梢詫⒈景l(fā)明的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入如下文所述的合適宿主細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的蛋白。該過(guò)程可以包括以下步驟在使所述蛋白79編碼序列的載體表達(dá)的情況下，培養(yǎng)用如上文所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，然后可選地回收所表達(dá)的蛋白。所述載體可以是，例如，具有以下元件的質(zhì)?；虿《据d體一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，任選用于表達(dá)所述多核苷酸的啟動(dòng)子和任選所述啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)物。所述載體可以包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒中包含氨千青霉素抗性基因，或者在哺乳動(dòng)物載體中包含新霉素抗性基因。載體可以用于例如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。有效連接本發(fā)明蛋白編碼序列的控制序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)。可以選擇與所述表達(dá)載體設(shè)計(jì)使用的宿主細(xì)胞相容的控制序列。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，包括大小和復(fù)雜性各不相同的核酸區(qū)，從最小啟動(dòng)子到包括上游元件和增強(qiáng)子的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子通常選自在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，但可以使用原核啟動(dòng)子和在其它真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子通常來(lái)自病毒或真核一基因的啟動(dòng)子序列。例如，它可以是來(lái)自發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞的基因組。至于真核啟動(dòng)子，它們可以是以遍在方式發(fā)揮功能的啟動(dòng)子(例如a-肌動(dòng)蛋白、b-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白啟動(dòng)子)，或者是以組織特異性方式起作用的啟動(dòng)子(例如丙酮酸激酶編碼基因的啟動(dòng)子)。也可以使用特異性針對(duì)某些細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子。它們也可以是響應(yīng)特定刺激的啟動(dòng)子，例如結(jié)合類(lèi)固醇激素受體的啟動(dòng)子。也可以使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼氏鼠白血病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMLVLTR)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子或人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也是有利的，以便可以在細(xì)胞的生活周期內(nèi)調(diào)節(jié)異源基因的表達(dá)水平。誘導(dǎo)型指可以調(diào)節(jié)使用所述啟動(dòng)子獲得的表達(dá)水平。此外，通過(guò)力n入其它調(diào)節(jié)序列，修飾任何這樣的啟動(dòng)子，例如增強(qiáng)子序列。也可以使用包含來(lái)自上文所述兩種或多種不同啟動(dòng)子的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞可以將本發(fā)明的載體和多核苷酸引入宿主細(xì)胞，以復(fù)制所述載體/多核苷酸和/或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸編碼的本發(fā)明蛋白。雖然可以使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白，但優(yōu)選使用真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的各種技術(shù)，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化和電穿孔，將本發(fā)明的載體/多核苷酸引入合適宿主細(xì)胞。在將本發(fā)明載體/多核苷酸給予動(dòng)物的情況下，幾種技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，例如用重組病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰滲病毒和腺病毒感染、直接注射核酸以及生物彈道轉(zhuǎn)化。蛋白表達(dá)和純化可以使用包含本發(fā)明多核苷酸的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的蛋白?？梢栽谠试S表達(dá)本發(fā)明蛋白的合適條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。本發(fā)明蛋白的表達(dá)可以是組成型的，以便能夠持續(xù)地生產(chǎn)它們；或者表達(dá)是誘導(dǎo)型的，需要刺激以起始表達(dá)。在誘導(dǎo)型表達(dá)的情況下，可以在需要時(shí)起始表達(dá)，例如通過(guò)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物例如地塞米松或iptg?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種技術(shù)，從宿主細(xì)胞中提取本發(fā)明的蛋白，所述技術(shù)包括酶裂解、化學(xué)裂解和/或滲透裂解和物理破碎。給藥本發(fā)明蛋白優(yōu)選與各種成分組合制備本發(fā)明的組合物。所述組合物優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的合適載體、稀釋劑或賦形劑組合制備藥用組合物(可以用于人類(lèi)或動(dòng)物)。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液。賦形劑的詳細(xì)資料可見(jiàn)TheHandbookofPharmaceuticalExcipients，第二版,EdsWade&Weller,AmericanPharmaceuticalAssociation可以通過(guò)直接注射給予本發(fā)明的組合物?？梢耘渲扑鼋M合物，用于胃腸外給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、眼內(nèi)給藥、口服給藥或經(jīng)皮給藥。一般以約1到10mg的劑量給予所述綴合物?？梢耘渲扑鼋M合物，以便每日給藥、每周給藥或每月給藥提供所需的日劑量?？梢哉J(rèn)識(shí)到，可以方便地配制所述組合物，以便降低給藥頻率，例如每2、4、6、8、10或12小時(shí)給藥一次?？梢詫⒕幋a多肽成分的多核苷酸/載體作為棵核酸構(gòu)建物直接給藥，所述棵核酸構(gòu)建物最好還包含與所述宿主基因組同源的側(cè)翼序列?？梢酝ㄟ^(guò)幾種已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入棵核酸構(gòu)建物，例如那些包括應(yīng)用轉(zhuǎn)染劑的技術(shù)。這些試劑的例子包括陽(yáng)離子劑(例如磷酸4丐和DEAE-葡聚糖)和脂轉(zhuǎn)染劑(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常將核酸構(gòu)建物與所述轉(zhuǎn)染劑混合產(chǎn)生組合物。本發(fā)明的多核苷酸或載體最好與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合制備藥用組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。可以配制所述組合物，用于胃腸外給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、眼內(nèi)給藥或經(jīng)皮給藥。所述給藥途徑和劑量方案僅作為指導(dǎo)，因?yàn)榧夹g(shù)人員能夠容易地為任何具體患者和病理狀況決定最佳給藥途徑和劑量方案。病毒載體在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用病毒載體給予所述綴合物，更優(yōu)選使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒用于本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以衍生自任何合適的反轉(zhuǎn)錄病毒。已經(jīng)鑒定大量不同的反轉(zhuǎn)錄病毒。例子包括鼠白血病毒(MLV)、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人類(lèi)T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病毒(A-MLV)、禽髓細(xì)胞瘤病病毒29(MC29)和禽成紅血細(xì)胞性病病毒(AEV)。反轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)列表可見(jiàn)Coffin等，1997,"retroviruses",ColdSpringHarbourLaboratoryPress編輯JMCoffin,SMHughes,HEVarmus，第758-763頁(yè)。本領(lǐng)域內(nèi)有一些反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)的詳細(xì)資料。例如，HIV和Mo-MLV的詳細(xì)資料可見(jiàn)NCBIGenbank(基因組登記號(hào)分別是AF033819和AF0338U)。反轉(zhuǎn)錄病毒在廣義上可以分為兩類(lèi)即"簡(jiǎn)單型"和"復(fù)雜型，，。反轉(zhuǎn)錄病毒甚至可以進(jìn)一步分為七類(lèi)。其中五類(lèi)致癌性反轉(zhuǎn)錄病毒。其余兩類(lèi)是慢病毒和泡沫病毒。這些反轉(zhuǎn)錄病毒的回顧見(jiàn)Coffm等，1997(同上)。慢病毒組可以進(jìn)一步分為"靈長(zhǎng)類(lèi)"和"非靈長(zhǎng)類(lèi)"。靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒的例子包括人類(lèi)免疫缺陷病毒(mv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv),其中人類(lèi)免疫缺陷病毒是人類(lèi)自身免疫綜合征(AIDS)的致病因子。非靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒組包括原型"慢病毒，，綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/綿羊肺腺瘤病病毒(VMV)以及相關(guān)的羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)以及最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用載體將核苷酸序列形式的綴合物傳遞到造血干細(xì)胞(HSC)。基因傳遞涉及將表達(dá)盒傳遞到靶細(xì)胞如HSC，所述表達(dá)盒由一種或多種核苷酸序列以及控制它們表達(dá)的序列組成?？梢圆捎萌缦鲁绦蛟诨铙w外執(zhí)行在實(shí)驗(yàn)室中將所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，然后將所述修飾細(xì)胞給予接受者?；蛘撸梢圆捎萌缦鲁绦蛟隗w內(nèi)執(zhí)行基因轉(zhuǎn)移將所述表達(dá)盒直接轉(zhuǎn)移到個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞。在這兩種策略中，所述轉(zhuǎn)移方法通常使用一種載體的協(xié)助，這種載體幫助傳遞所述表達(dá)盒到合適的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。骨髓是用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSC的傳統(tǒng)來(lái)源，最近的研究發(fā)現(xiàn)外周血干細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞是同樣好或更好的靶細(xì)胞(Cassel等1993ExpHematol21:585-591;Bregni等1992Blood80:1418-1422;Lu等1993JExpMed178:2089-2096)。其它抗癌藥物本發(fā)明的綴合物可以與一種或多種其它活性藥物聯(lián)合應(yīng)用，所述其它活性試劑例如一種或多種細(xì)胞毒性藥物。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法還包括給予另一種活性藥物成分，例如細(xì)月包毒性藥物，所述另一種活性藥物成分或者作為與所述綴合物的聯(lián)合劑型給藥，或者作為單獨(dú)的劑型給藥。所述單獨(dú)的細(xì)胞毒性藥物劑型可以包括固體口服劑型、口服溶液劑型、糖漿劑型、酏劑劑型、注射劑型、經(jīng)皮劑型、經(jīng)粘膜劑型或其它劑型。所述綴合物和其它活性藥物成分可以在一種劑型中聯(lián)合使用，或者作為同時(shí)或順序使用的單獨(dú)劑型提供?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞毒性藥物的例子包括烷基化藥物，例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、氮芥、雌莫司汀、曲奧舒凡、塞替派、二溴甘露醇；細(xì)胞毒性抗生素，例如多柔比星、表柔比星、阿柔比星、伊達(dá)比星、柔紅霉素、米托蒽醌、博來(lái)霉素、放線菌素D和絲裂霉素；抗代i射藥，例如氨曱蝶呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、克拉屈濱、吉西他濱、氟尿嘧啶、雷替曲塞、巰嘌呤、替加氟、硫?yàn)踵堰?；長(zhǎng)春花生物堿，例如長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱以及依托泊苷；其它腫瘤藥物，例如安吖，定、六曱蜜胺、crisantaspase、達(dá)卡巴。秦和替莫哇胺、羥基脲、噴司他?。汇K化合物，包括卡鉑、順鉑、奧利沙鉑、外吩姆鈉、丙卡巴肼、雷佐生；紫杉烷類(lèi)，包括多西他塞和紫杉醇；拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，包括伊立替康和托泊替康、曲妥單抗和維A酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，另一種細(xì)胞毒性藥物是多柔比星或美法侖。本發(fā)明的綴合物也可以用于利用腫瘤細(xì)胞和血管對(duì)于化合物的滲透性而進(jìn)行有關(guān)診斷。例如，可以使用所述綴合物在對(duì)胂瘤的放射性免疫閃爍照相術(shù)或放射療法中增加腫瘤對(duì)放射標(biāo)記抗體或激素(腫瘤成像化合物)的攝入。附圖和實(shí)施例通過(guò)下面非限制性的實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中圖1展示在T/SA小鼠乳腺癌模型中，表征TNF的治療活性和毒性活性，以;S^征RGD-TNF與NGR-IFN聯(lián)合應(yīng)用的治療活性和毒性活性。該圖更詳細(xì)地顯示RGD-mTNF與NGR-mIFN-y聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤活性比mTNF與NGR-mIFN-y聯(lián)合應(yīng)用或者單獨(dú)應(yīng)用NGR-mIFN-y的抗腫瘤活性都強(qiáng)。這些結(jié)果指出將TNF和IFN-y靶向傳遞到胂瘤血管系統(tǒng)不同受體能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。85實(shí)施例實(shí)施例I制備TNF和RGD-TNF在大腸桿菌中通過(guò)胞質(zhì)cDNA表達(dá)產(chǎn)生鼠重組TNF和ACDCRGDCFCG(RGD-TNF)。對(duì)脂多糖刺激的鼠RAW-264.7單核細(xì)胞-巨嗟細(xì)胞分離的mRNA，使用5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3'和5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3'作為3'和5'引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合^i反應(yīng)(RT-PCR)制備編碼鼠Met-TNFl-156(66)的cDNA。用NdeI和BamHI(NewEnglandBiolabs,Beverley,MA)消化擴(kuò)增片段，克隆進(jìn)用同樣酶預(yù)先消化的pET-llb(Novagen,Madison,WI),獲得pTNF。對(duì)pTNF通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼ACDCRGDCFCG-TNF1-156的cDNA,使用5'-TGCAGATCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCTCAGATCATCTTCTC-3'作為5'引物，以及上述3'引物。如上文所述，消化擴(kuò)增片段并克隆進(jìn)pET-llb,用于轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Novagen)。根據(jù)pETllb生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，用異丙基-p-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)TNF和RGD-TNF表達(dá)。如下從兩升培養(yǎng)物中回收可溶性TNF和RGD-TNF:在2mM乙二胺四乙酸(etilendiaminetetraceticacid),20mMTris-HCl，pH8.0中超聲破碎細(xì)菌細(xì)胞，然后離心(15000xg,20分鐘，4°C)。兩種提取物都與硫酸銨(25%飽和度)混合，在4。C放置1小時(shí)，然后如上文所述離心。然后將上清液中的硫酸銨調(diào)整到65%飽和度，在4。C放置24小時(shí)，然后離心。每種沉淀物溶解于200ml1M硫酸銨，50mMTris-HCl，pH8.0，在苯基瓊脂糖6快速柱(Pharmacia-Upjohn)上通過(guò)疏水相互作用層析進(jìn)行純化(梯度洗脫，緩沖液A:50mM磷酸鈉，pH8.0，含lM疏酸銨；緩沖液B:20%甘油，5%曱醇，50mM磷酸鈉，pH8.0)。合并包含TKF免疫反應(yīng)性材料(通過(guò)蛋白質(zhì)印跡鑒定)的組分，對(duì)2mM乙二胺四乙酸，20mMTris-HCl,pH8.0透析，然后在DEAE瓊脂糖快速柱(Pharmacia-Upjohn)上通過(guò)離子交換層析純化(梯度洗脫，緩沖液A:20mMTris-HCl,pH8.0;緩沖液B:1M氯化鈉，20mMTris-HC1,pH8.0)。合并包含TNF免疫反應(yīng)性的組分，在用150mM氯化鈉，50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.3(PBS)預(yù)平衡和洗脫的聚丙烯酰胺葡聚糖-S-300HR(Pharmacia-Upjohn)上通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化。合并對(duì)應(yīng)于40000-50000Mr產(chǎn)物的組分，等分并凍存在-20。C。在層析步驟中使用的所有溶液都用無(wú)菌無(wú)熱原的水(Salf，Bergamo,Italy)制備。如前人所述(65)通過(guò)電噴射質(zhì)譜學(xué)測(cè)量純化的TNF和RGD-TNF的分子量。使用商業(yè)化蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce,Rockford，IL)，測(cè)量蛋白含量。使用12.5或15%聚丙烯酰胺凝膠，用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡分析。對(duì)TNF的非還原性SDS-PAGE顯示只有一條17-18kDa的帶，是單體TNF的預(yù)期條帶。對(duì)RGD-TNF的非還原性SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析則有不一致，顯示18、36和50kDa的不同免疫反應(yīng)型，可能對(duì)應(yīng)于單體、雙體和三體。在還原條件下，大多數(shù)50和36kDa帶轉(zhuǎn)化成18kDa型，這表明存在攜帶鏈間二硫鍵的RGD-TNF分子。所述18kDa帶占總物質(zhì)約1/2。這些電泳結(jié)果提示RGD-TNF是各種三體的混合物，其中包括由三個(gè)有正確鏈內(nèi)二硫4建(10-20%)的單體亞單位組成的三體，其余部分大多數(shù)是有一個(gè)或多個(gè)鏈間二石危鍵的三體。根據(jù)電噴射質(zhì)譜，TNF和RGD-TNF單體的分子量分別是17386.1±2.0Da和18392.8Da。這些值與Met-TNF1-156(17386.7Da)和ACDCRGDCFCG-TNF1-156(18392.9Da)的質(zhì)量有良好對(duì)應(yīng)。實(shí)施例nTNF和RGD-TNF的體外細(xì)胞毒性活性如前人所述(67),通過(guò)基于L-M小鼠成纖維細(xì)胞(ATCCCCL1.2)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞裂解測(cè)定估計(jì)TNF和RGD-TNP的生物活性。在30ng/ml放線菌素D存在下測(cè)定TNF和NGR-TNF對(duì)于RMA-T細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性(68)。每種樣品在三個(gè)不同稀釋度下雙份分析。結(jié)果表示為二至三次獨(dú)立測(cè)定的平均值土SD。才艮據(jù)使用L-M細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞裂解測(cè)定，TNF和RGD-TNF的體外細(xì)胞毒性活性分別是(1.2±0.14)x1()S單位/mg和(1.7土l)x108單位/mg。這些結(jié)果指出RGD-TNF分子中的ACDCRGDCFCG部分并不防止折疊、寡聚化和結(jié)合TNF受體。在以前的研究中，我們證實(shí)在30ng/ml放線菌素D存在下TNF能夠殺死RMA-T細(xì)胞；而在沒(méi)有轉(zhuǎn)錄抑制劑下，這些細(xì)胞抵抗TNF，甚至溫育幾天后也是如此(68)。在放線菌素D存在下，使用TNF((1.2±0.14)x1()8單位/mg,作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得RGD-TNF對(duì)于RMA-T細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性活性是(1.6+1.3)x1()S單位/mg。實(shí)施例III表征TNF和RGD-TNF的治療活性和毒性活性在RPMI1640，5。/。胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素，100|ig/ml鏈霉素，0.25(ig/ml兩性霉素B,2mM谷氨酰胺和50nM厶巰基乙醇中體外維持來(lái)自C57BL/6的Rauscher病毒誘導(dǎo)的RMA淋巴瘤(69)。從用編碼Thy1.1等位基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的RMA細(xì)胞系獲得RMA-T,如Moro,1997#28]所述培養(yǎng)。如前人所述()培養(yǎng)T/SA小鼠乳腺癌細(xì)胞。在動(dòng)物模型上的體內(nèi)研究得到SanRaffaeleHScientificInstitute倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，按照預(yù)定方針執(zhí)行。分別用5x104RMA-T或TSA活細(xì)胞在左肋脅皮下攻擊16-18g的C57BL/6小鼠(CharlesRiverLaboratories,Calco,Italy)。#^胂瘤十到十二天后，用無(wú)內(nèi)毒素0.9%氯化鈉溶液稀釋的250|ilTNF或RGD-TNF溶液l!M內(nèi)處理小鼠。初步實(shí)驗(yàn)顯示在TNF和RGD-TNF溶液中加入作為載體的/061清白蛋白并不改變抗腫瘤活性。每組5只小鼠，進(jìn)行每個(gè)實(shí)驗(yàn)。每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，以監(jiān)測(cè)肺瘤生長(zhǎng)。計(jì)算rlxr27c,估計(jì)腫瘤面積；計(jì)算rlxr2xr3x4/3ti,估計(jì)腫瘤體積；其中rl和r2是縱向和橫向半徑，r3是從正常皮膚表面突出的腫瘤厚度。在腫瘤達(dá)到1.0-1.3cm直徑之前處死動(dòng)物。腫瘤大小表示為平均值土SE(每組5-10只動(dòng)物)，用U企'驗(yàn)進(jìn)行比較。在C57BL6小鼠中使用RMA-T淋巴瘤和T/SA模型，比較RGD-TNF以及TNF的抗肺瘤活性和毒性。將鼠TNF給予攜帶已經(jīng)建立的皮下RMA-T腫瘤的動(dòng)物，導(dǎo)致24小時(shí)后肺瘤減小和腫瘤中心部分出血性壞死，然后生長(zhǎng)明顯延遲幾天(71)。一次用TNF處理并不誘導(dǎo)該肺瘤的完全退化，甚至在劑量才妄近LD50時(shí)也是如此，因?yàn)樵趬乃绤^(qū)域周?chē)匀淮嬖诨罴?xì)胞，所以處理后幾天紳瘤重新開(kāi)始生長(zhǎng)。在第一組實(shí)驗(yàn)中，我們研究TNF或RGD-TNF各種劑量(腹膜內(nèi))對(duì)于動(dòng)物存活率的效應(yīng)。為避免動(dòng)物過(guò)多受苦，當(dāng)肺瘤直徑大于l—1.3cm時(shí)處死動(dòng)物。TNF和RGD-TNF的致死率在處理后3天^:不同的(LD50,分別是6(ig和12pg),而它們的抗腫瘤活性明顯不同(表1)。例如，1嗎RGD-TNF比2呢TNF更有效地延遲腫瘤生長(zhǎng)。有趣的是，用16嗎RGD-TNF治愈一些動(dòng)物，而用TNF沒(méi)有治愈一只動(dòng)物。已經(jīng)治愈的動(dòng)物排斥致腫瘤性劑量RMA-T或野生型RMA細(xì)胞的進(jìn)一步攻擊，提示用RGD-TNF的一次處理能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。因此，在這些條件下，計(jì)算得到的RGD-TNF有效性/毒性比例是TNF的4倍。考慮到RGD-TNF制備物中帶有正確二硫鍵的形式占約10-20%,技術(shù)人員可以計(jì)算得到RGD-TNF的治療指數(shù)比TNF的治療指數(shù)高約20-40°/0。此外，RGD-TNF可以比TNF更有效地誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。由于RMA-T細(xì)胞并不表達(dá)ocv整聯(lián)蛋白(通過(guò)用抗av抗體的FACS)，而內(nèi)皮細(xì)胞可以表達(dá)該整聯(lián)蛋白，因此提示其作用機(jī)制基于耙向細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞。表1.植入腫瘤后用TNF或RGD-TNF(靜脈內(nèi))治療12天，攜帶RMA-Thy1.1淋巴瘤的小鼠的存活率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>a)兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(每個(gè)處理組5只動(dòng)物)的累計(jì)結(jié)果。在研究中不包括腹水瘤動(dòng)物。b)存活動(dòng)物在第90天用50,000個(gè)RMA-T細(xì)胞再次攻擊，然后在第115天用50,000個(gè)RMA細(xì)胞再次攻擊。同時(shí)，用同樣細(xì)胞處理五只正常動(dòng)物，檢查注射劑量的致瘤力。所有對(duì)照動(dòng)物在10天內(nèi)都出現(xiàn)腫瘤。上面說(shuō)明書(shū)中提到的所有公開(kāi)物特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的不偏離本發(fā)明范圍和精神的各種改變和變化對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。雖然已經(jīng)聯(lián)系具體優(yōu)選實(shí)施例描述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不適當(dāng)?shù)叵拗朴谒鼍唧w實(shí)施方案。對(duì)于分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的、對(duì)執(zhí)行本發(fā)明所述方式的各種改變將包括在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)1.CortiA等BiochemicalJournal.1992;284:905-10.2.TartagliaLA等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1991;88:9292-6.3.EspevikT等JournalofExperimentalMedicine.1990;171:415-26.4.LoetscherH等JournalofBiologicalChemistry.1993;268:26350-7.5.VanOstadeX等EuropeanJournalofBiochemistry.1994;220:771-779.6.BarbaraJA等EMBOJournal.1994;13:843-50.7.EngelmannH等J.Biol.Chem.1990;265:14497,8.BigdaJ等JournalofExperimentalMedicine.1994;180:445-60.9.TartagliaLA等JournalofBiologicalChemistry.1993;268:18542-8.10.VandenabeeleP等JournalofExperimentalMedicine.1992;176:1015-24.11.NaumeB等JournalofImmunology.1991;146:3045-8.12.GrellM等Cell.1995;83:793-802.13.CarswellEA等Proc.NatLAcad.Sci.USA.1975;72:3666-70.14.HelsonL等Nature.1975;258:731-732.15.TraceyKJ和CemmiA.AnnualReviewofCellBiology,1993;9:Sn-AS-IG.ElliottMJ等InternationalJournalofImmunopharmacology.1995;17:141-5.17.PalladinoMA,Jr.等JournalofImmunology.1987;138:4023-32.18.ClaussM等JournalofBiologicalChemistry.1990;265:7078-83.19.NawrothPP和SternDM.JournalofExperimentalMedicine.1986;163:740-5.、.20.ClaussM等JournalofExperimentalMedicine.1990;172:1535-45,21.McintoshJK等CancerResearch.1990;50:2463-9.22.MeuldersQ等KidneyInternational.1992;42:327-34.23.VandeWielPA等Immunopharmacology.1992;23:49-56.24.NawrothP等JournalofExperimentalMedicine.1988;168:637-47.25.StiyhnHansenA等EuropeanJournalofImmunology.1993;23:2358-64.26.TaylorA.FASEBJournal.1993;7:290-8.27.ShippMA和LookAT.Blood.1993;82:1052-70.28.FrakerDL，AlexanderHR和PassHI:"肺瘤生物學(xué)療法原則和實(shí)踐"，"TNF生物學(xué)療法系統(tǒng)性給藥和孤立性灌注".V.DeVita,S.Hellman和S.Rosenberg編輯J.B.LippincottCompany:Philadelphia.1995.329-345.29.FiersW:"腫瘤生物學(xué)療法原則和實(shí)踐"，"TNF生物學(xué)療法臨床前研究，，.V,DeVita，S.Hellman和S.Rosenberg編輯J.B.LippincottCompany:Philadelphia.1995.295-327.30.SidhuRS和BollonAP.PharmacologicalTherapy.1993;57:79-128.31.HieberU和HeimME.Oncology.1994;51:142-53.32.LienardD等WorldJournalofSurgery.1992;16:234-40.33.HillS等BritishJournalofSurgery.1993;80:995-7.34.EggermontAM等AnnalsofSurgery.1996;224:756-65.35.SchraffordtKoopsH等RadiotherapyandOncology.1998;48:1-4.36.WilliamsonBD等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1983;80:5397-401.37.FransenL等EuropeanJournalofCancer&ClinicalOncology.1986;22:419-26.38.RuffMR和GiffordGE:腫瘤壞死因子.見(jiàn)Lymphokines.E.Pick編輯AcademicPress:NewYork.1981.235-272.39.BeyaertR等CancerResearch.1993;53:2623-30.40.BeyaertR等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1989;86:9494-8.41.BalkwillFR等CancerResearch.1986;46:3990-3.42.SchillerJH等Cancer.1992;69:562-71.43.JonesAL等CancerChemotherapy&Pharmacology.1992;30:73-6.44.BrouckaertP等Lymphokine&CytokineResearch.1992;11:193-6.45.VanOstadeX等Nature.1993;361:266-9.46.VanZeeKJ等JournalofExperimentalMedicine.1994;179:1185-91.47.BartholeynsJ等Infection&Immunity.1987;55:2230-3.48.DebsRJ等JournalofImmunology.1989;143:1192-7.49.DebsRJ等CancerResearch.1990;50:375-80.50.KimuraK等CancerChemotherapy&Pharmacology.1987;20:223-9.51.AderkaD等CancerResearch.1991;51:5602-7.52.LantzM等Cytokine.1990;2:402-6.53.HoogenboomHR等MolecularImmunology.1991;28:1027-37.54.YangJ等HumanAntibodies&Hybridomas.1995;6:129-36.55.YangJ等MolecularImmunology.1995;32:873-81.56.PasqualiniR等NatureBiotechnology.1997;15:542-6.57.KoivunenE等NatureBiotechnology.1999;17:768-774.58.BrekkenRA等CancerResearch.1998;58:1952-1959.59.GoodwinDA.JournalofNuclearMedicine.1995;36:876-9.60.PaganelliG等CancerResearch.1991;51:5960-6.61.ModoratiG等BritishJournalofOphtalmology.1994;78:19-23.62.ColomboP等JournalofEndocrinologicalInvestigation.1993;16:841-3.63.PaganelliG,MagnaniP，SiccardiA和FazioF:"抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)用于腫瘤輩巴向的臨床應(yīng)用".見(jiàn)Cancertherapywithradiolabeledantibodies.D.Goldenberg編輯CRCPress:BocaRaton.1995.239-253.64.RobertB等CancerResearch.1996;56:4758-4765.65.CortiA等CancerResearch.1998;58:3866-3872.66.PennicaD等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1985;82:6060-4.67.CortiA等JournalofImmunologicalMethods.1994;177:191-198.68.MoroM等CancerResearch.1997;57:1922-8.69.LjunggrenHG和KarreK.JournalofExperimentalMedicine,1985;162:1745-59.70.CelikC等CancerResearch.1983;43:3507-10.71.GasparriA等CancerResearch.1999;59:2917-23.72.ArapW等Science.1998;279:377-80.73.TalmadgeJE等CancerResearch.1987;47:2563-70.74.PfizenmaierK等Journaloflmmunology.1987;138:975-80.75.AsherAL等Journaloflmmunology.1991;146:3227-34.76.MizuguchiH等CancerResearch.1998;58:5725-30.77.GasparriA等JournalofBiologicalChemistry.1997;272:20835-43.權(quán)利要求1.一種細(xì)胞因子和腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物，其前提條件是當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ時(shí)，所述TTM不是CD13配體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是IL-2或IL-12時(shí)，所述TTM不是抗纖連蛋白抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF時(shí)，所述TTM不是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF、IFN-γ或IL-2時(shí)，所述TTM不是抗TAG72抗原抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是IFN時(shí)，所述TTM不是αvβ3整聯(lián)蛋白配體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF時(shí)，所述TTM不是纖連蛋白。2.依照權(quán)利要求1的綴合物，其進(jìn)一步的前提條件是當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF-a或TNF-P時(shí)，所述TTM不是腫瘤特異性抗體。3.依照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的綴合物，其進(jìn)一步的前提條件是所述綴合物不是生物素化TNF。4.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述細(xì)胞因子是炎性細(xì)胞因子。5.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述細(xì)胞因子是化療細(xì)胞因子。6.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述細(xì)胞因子是TNFot、TNFP、IFNoc、IFN(3、IFNy、IL-1、2、4、6、12、15、EMAPII、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。7.依照權(quán)利要求8的綴合物，其中所述細(xì)胞因子是TNRx、TNF(3或IFNy。8.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述TTM是腫瘤血管把向部分(TVTM)。9.依照權(quán)利要求10的綴合物，其中所述TVTM是腫瘤血管受體、標(biāo)記或其它細(xì)胞外組分的結(jié)合配偶體，例如針對(duì)腫瘤血管的肽。10.依照權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的綴合物，其中所述TTM是腫瘤受體、標(biāo)記或其它細(xì)胞外組分的結(jié)合配偶體。11.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述TTM是抗體或配體、或它們的片段。12.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述TTM包含NGR或RGD基序；或者所述TTM是HIV-tat、膜聯(lián)蛋白V、骨橋蛋白、纖連蛋白、I型或IV型膠原蛋白、透明質(zhì)酸、肝配蛋白；或者所述TTM是癌胚纖連蛋白的結(jié)合配偶體；或者所述TTM是上述物質(zhì)的片段。13.依照權(quán)利要求12的綴合物，其中所述TTM包含NGR基序。14.依照權(quán)利要求13的綴合物，其中所述TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC、線性或環(huán)狀CNGRC。15.依照權(quán)利要求12的綴合物，其中所述TTM包含RGD基序。16.依照權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的綴合物，其中所述TTM靶向VEGFR、ICAM1、2或3、PECAM-1、CD31、CD13、VCAM-1、選擇蛋白、ActRII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、av(53整聯(lián)蛋白、avp5整聯(lián)蛋白、FGF-1、2、3或4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纖連蛋白、PD國(guó)ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。17.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其為表A中的綴合物。18.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物，其中所述綴合物為融合蛋白形式。19.依照權(quán)利要求l到18任一項(xiàng)的綴合物，其中所述綴合物為核酸形式。20.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求19的核酸。21.—種宿主細(xì)胞，其為用權(quán)利要求20的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。22.—種制備綴合物的方法，該方法包括在使得表達(dá)所述綴合物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞。23.—種藥用組合物，所述組合物包含任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。24.依照權(quán)利要求23的藥用組合物，其中所述組合物還包含其它抗胂瘤藥物或診斷性腫瘤成像化合物。25.依照權(quán)利要求24的藥用組合物，其中所述其它抗腫瘤藥物是多柔比星或美法侖。26.權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)定義的綴合物或依照權(quán)利要求23到25任一項(xiàng)的藥用組合物在制備用于治療或診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用。27.—種治療或診斷癌癥的方法，所述方法包括給予需要患者有效量的權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)定義的綴合物或依照權(quán)利要求23到25任一項(xiàng)的藥用組合物。28.—種藥用組合物，所述藥用組合物包含有效量的TNF與第一種TTM的綴合產(chǎn)物或者編碼所述綴合產(chǎn)物的多核苷酸，并且包含有效量的IFN-Y與第二種TTM的綴合產(chǎn)物或者編碼所述綴合產(chǎn)物的多核苦酸，其中所述第一種TTM和所述第二種TTM竟?fàn)幉煌荏w。29.依照權(quán)利要求28的組合物，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。30.依照權(quán)利要求28的組合物，其中所述第一種TTM或所述第二種TTM是CD13受體的配體。31.依照權(quán)利要求30的組合物，其中所述第一種TTM或所述第二種TTM包含NGR基序。32.依照權(quán)利要求30的組合物，其中所述第一種TTM或所述第二種TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC、線性或環(huán)狀CNGRC。33.依照權(quán)利要求28的組合物，其中所述第一種TTM或所述第二種TTM是avp3受體的配體。34.依照權(quán)利要求33的組合物，其中所述第一種TTM或所述第二種TTM包含RGD基序。35.依照權(quán)利要求28的組合物，其中所述第一種TTM是CD13受體的配體，所述第二種TTM是av(33受體的配體。36.依照權(quán)利要求28的組合物，其中所述第一種TTM是otvP3受體的配體，所述第二種TTM是CD13受體的配體。全文摘要一種細(xì)胞因子與腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物，前提條件是當(dāng)細(xì)胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ時(shí)，所述TTM不是CD13配體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是IL-12時(shí)，所述TTM不是抗纖連蛋白抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF時(shí)，所述TTM不是抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體；當(dāng)所述細(xì)胞因子是TNF、IFN-γ或IL-2時(shí)，所述抗體不是抗TAG72抗原的抗體。文檔編號(hào)C12N1/21GK101433722SQ20081018683公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2003年4月30日優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日發(fā)明者A·科爾蒂,F·庫(kù)爾尼斯申請(qǐng)人:莫爾梅德股份有限公司