專利名稱：：一種纖維素乙醇的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物能源開發(fā)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體一種涉及纖維素乙醇的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：隨著石油資源的枯竭、石油價格的上漲和環(huán)境的惡化，尋找新型可再生資源替代化石資源和開發(fā)潔凈能源已成為工業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的研究熱點。生物質(zhì)能的開發(fā)，可以緩解對石油資源的依賴、控制二氧化碳的排放，并促進農(nóng)業(yè)新型產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，對推動我國社會主義新農(nóng)村建設(shè)具有重要意義。燃料乙醇作為一種可再生的潔凈能源，從上世紀70年代在美國、巴西開始推行。我國乙醇的生產(chǎn)能力已達到500多萬噸/年，其中燃料乙醇的年產(chǎn)量保持在110萬噸左右，僅次于巴西、美國，居世界第三位。由于大量使用玉米為原料開發(fā)生物能源導(dǎo)致玉米價格持續(xù)增長，所以在經(jīng)過了將糧食轉(zhuǎn)化為乙醇的熱潮之后，纖維素乙醇技術(shù)的開發(fā)和纖維素乙醇的商業(yè)化生產(chǎn)正漸成氣候和規(guī)模。木質(zhì)纖維素原料是地球上產(chǎn)量最大的可再生資源，包括林木、農(nóng)作物秸稈、農(nóng)副產(chǎn)品加工下腳料等，在自然生態(tài)系統(tǒng)的能量流與物質(zhì)循環(huán)流中占有重要位置，是生產(chǎn)燃料酒精的潛在資源，對解決未來能源問題有著巨大的潛力。目前的纖維素乙醇的中試技術(shù)存在非常突出的問題。一是市場上出現(xiàn)的商業(yè)化的工業(yè)酵母可以發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，但不是纖維二糖，生產(chǎn)中要添加除纖維素酶外的價格昂貴的P-葡萄糖苷酶，以避免纖維二糖抑制。利用纖維素酶將纖維素水解為簡單糖。這些簡單糖中有一種糖是纖維二糖，包括兩個分子的葡萄糖，可以分解為葡萄糖。但纖維素酶沒有足夠的P-葡萄糖苷酶，使纖維素水解分解的纖維二糖變?yōu)槠咸烟?。纖維二糖會抑制內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，在同步糖化發(fā)酵工藝中會阻礙整個乙醇的速率和產(chǎn)率，而且由于需要大量補充價格昂貴的P-葡萄糖苷酶，導(dǎo)致工藝成本非常高。另一方面，發(fā)酵纖維素二糖的酵母已經(jīng)找到，但對酒精的耐受力很低。二是同步糖化發(fā)酵技術(shù)無法保證酶解溫度和發(fā)酵溫度的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。一般酶水解溫度在40-5(TC，而釀酒酵母的發(fā)酵溫度在28-35°C，因此工藝上只能折中進行，導(dǎo)致酶的用量過大或酵母的用量過大，同步糖化發(fā)酵時間一般要超過100小時，發(fā)酵效率低下。三是在高底物含量的條件下，大量的纖維素未被轉(zhuǎn)化，酶解效果顯著降低，乙醇的產(chǎn)率也很低，一般只能達到3-5%(v/v)目前乙醇的發(fā)酵制備速率和產(chǎn)率不能滿足同步糖化工藝的要求，沒有經(jīng)濟性。國內(nèi)專利(CN101130792A)報道了酶解秸桿制備燃料乙醇的方法，發(fā)酵時間10-15天，酶解效率十分低下，沒有工業(yè)化的經(jīng)濟可行性。國內(nèi)另一篇專利(CN101270372A)報道了一種纖維素乙醇發(fā)酵液中糖液的濃縮方法，目的也是想解決酶解后的糖濃度過低的問題，這表明現(xiàn)在酶解技術(shù)不能滿足工業(yè)化要求。雖然采用這個濃縮專利技術(shù)可以改變已經(jīng)酶解糖的濃度，但對纖維素的酶解率低下的問題并沒有解決，會導(dǎo)致原料利用率低，生產(chǎn)成本高的問3題。專利CN101230359報道一種利用改性聚二甲基硅氧烷高分子膜提濃的纖維素乙醇工藝，也是想解決發(fā)酵酒精濃度過低，蒸餾成本過高的問題，但也無法回避酶解和發(fā)酵效率低的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種纖維素乙醇的生產(chǎn)方法，通過提高同步糖化發(fā)酵工藝的效率，最終提高纖維素乙醇的生產(chǎn)速率和產(chǎn)率。為實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，提供的技術(shù)方案如下—種纖維素乙醇的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)將含有纖維素和/或半纖維素原料的培養(yǎng)基加入到發(fā)酵反應(yīng)釜中；2)向發(fā)酵反應(yīng)釜中加入纖維素酶，并接種葡萄牙假絲酵母(Cmididalusiteniae)^3)在纖維素酶和葡萄牙假絲酵母的共同作用下進行同步糖化發(fā)酵，分離得到纖維素乙醇。其中，步驟l)中纖維素和/或半纖維素原料的來源為可再生的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。如麥桿，稻桿和速生林等，均可以作為纖維素乙醇的原料。該類生物質(zhì)含有植物干重的20_70%的纖維素和10_40%的半纖維素，以及部分木質(zhì)素。同時也包括環(huán)境和生物中廢棄的富含纖維素的各種生物質(zhì)。其中，步驟1)中所述培養(yǎng)基包括15%_30%的纖維素和/或半纖維素原料，還包括少量的酵母抽提物、蛋白胨、抗生素，控制PH值在3.5-6.0。培養(yǎng)基可以根據(jù)液體性質(zhì)添加吐溫80，麥角甾醇等。其中，步驟2)中纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量P-葡萄糖苷酶。其中，步驟2)中葡萄牙假絲酵母優(yōu)選經(jīng)過乙醇、纖維二糖馴化的酵母。馴化用的培養(yǎng)基含有纖維二糖和適量乙醇。馴化采用纖維二糖5%、10%、15%三個濃度梯度，逐代劃線分離，然后采用1%，2%，3%乙醇梯度馴化，分離得到優(yōu)勢菌株。其中，步驟3)中同步糖化發(fā)酵的酸堿度條件是pH值3.5-6.0，反應(yīng)溫度35_45°C，優(yōu)選40-45。C。本發(fā)明中用于同步糖化發(fā)酵的葡萄牙假絲酵母具有較高的乙醇耐受力和較高的乙醇生產(chǎn)速率，能夠以纖維素、半纖維素為原料在纖維素酶的共同作用下同步糖化發(fā)酵高效制備纖維素乙醇。實驗表明，通過比較葡萄牙假絲酵母與其他酵母利用葡萄糖和纖維二糖發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其具有較高的生產(chǎn)乙醇的速率和產(chǎn)率；另外，葡萄牙假絲酵母與其他酵母相比對乙醇的耐受能力較強。圖1為不同酵母與葡萄牙假絲酵母同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力比較。圖2為不同酵母對乙醇耐受力的比較。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明的內(nèi)容做詳細描述。本發(fā)明中所涉及的發(fā)酵原料包括纖維素和/或半纖維素。其來源為可再生的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。如麥桿，稻桿和速生林等，均可以作為纖維素乙醇的原料。該類生物質(zhì)含有植物干重的20_70%的纖維素和10_40%的半纖維素，以及部分木質(zhì)素。同時也包括環(huán)境和生物中廢棄的富含纖維素的各種生物質(zhì)。本發(fā)明中所使用的纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量P-葡萄糖苷酶。利用纖維素酶將纖維素水解為簡單糖，如葡萄糖。這些簡單糖中有一種糖是纖維二糖，包括兩個分子的葡萄糖，可以分解為葡萄糖。P-葡萄糖苷酶能夠使纖維素水解分解的纖維二糖變?yōu)槠咸烟?，但纖維素酶中只含有少量P-葡萄糖苷酶，因此纖維素酶本身不能充分利用纖維二糖。本發(fā)明中使用的葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)可能利用纖維素水解物纖維二糖和葡萄糖，也能利用從半纖維素中水解的甘露糖和半乳糖，以上組合的糖或其他相關(guān)糖也可以利用其發(fā)酵。其中，可利用的二糖，如蔗糖，麥芽糖，乳糖和纖維二糖，但不包括密二糖和海藻糖，也能利用多糖水解后的單糖如淀粉和纖維素水解后的葡萄糖和其他單糖如果糖，山梨糖，甘露糖和半乳糖。下面具體說明本發(fā)明涉及的同步糖化發(fā)酵高效制備纖維素乙醇的步驟和過程?！⑵咸蜒兰俳z酵母的培養(yǎng)及馴化從土樣中分離出來葡萄牙假絲酵母，采用土豆瓊脂培養(yǎng)基富集。這種酵母菌在生物學(xué)上是純種，被鑒定為Candidalusitaniae(CLAS5566)。一個樣收藏在三峽大學(xué)艾倫再生能源研究所保藏中心。馴化用的培養(yǎng)基含有纖維二糖和適量乙醇。馴化采用5%、10%、15%三個濃度梯度，逐代劃線分離，然后采用1%，2%，3%乙醇梯度馴化，分離得到優(yōu)勢菌株。二、發(fā)酵條件1、發(fā)酵工藝溶氧控制發(fā)酵工藝的溶氧要求范圍寬。溶氧既可以是間歇發(fā)酵的微氧，也可以是連續(xù)發(fā)酵中的接種的底物通入少量空氣。而且也可以是厭氧發(fā)酵。技術(shù)取決于最初的細胞密度，底物濃度和接種條件。2、發(fā)酵培養(yǎng)基的配方這種用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是常見的培養(yǎng)基，含有適當(dāng)?shù)牡础⒌V物質(zhì)、微生素和碳源。這些碳源包括己糖(葡萄糖，半乳糖和甘露糖)和二糖(纖維二糖)。發(fā)酵接種用培養(yǎng)基主要包括18%的纖維素，1%的安琪酵母抽提物，2%的蛋白胨，2mg/L抗生素，pH值在3.5-6.0。培養(yǎng)基可以根據(jù)液體性質(zhì)添加吐溫80，麥角甾醇等。3、發(fā)酵工藝的溫度控制本發(fā)酵工藝溫度可以從28"到45"，然而最適溫度為40_45°C。三、同步糖化發(fā)酵在同步糖化發(fā)酵工藝中，糖化涉及纖維素的水解過程。利用纖維素酶將纖維素水解為簡單糖。這些簡單糖中有一種糖是纖維二糖，包括兩個分子的葡萄糖，可以分解為葡萄糖。本發(fā)明使用的酵母菌是葡萄牙假絲酵母Candidalusitaniae，在42。C下可以很好的發(fā)酵纖維二糖，可以用在同步糖化發(fā)酵中，提供更快的產(chǎn)酒速率和更高的乙醇產(chǎn)率，優(yōu)于目前的已知的纖維二糖發(fā)酵的其他酵母。表1通過比較同步糖化發(fā)酵與間歇糖化發(fā)酵對最終產(chǎn)酒的影響，說明同步糖化發(fā)酵工藝比間歇糖化發(fā)酵工藝纖維素利用率提高50%，發(fā)酵效率提高約兩倍，詳細結(jié)果見下表。表1同步糖化發(fā)酵與間歇糖化發(fā)酵對最終產(chǎn)酒的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1描述不同酵母同步糖化發(fā)酵數(shù)據(jù)。CLAS5566與其他酵母菌釀酒酵母，耐高溫活性干酵母比較6天后，利用酵母菌CLAS5566乙醇濃度達到90g/L左右，清楚看到與其他酵母相比在速率和產(chǎn)率方面優(yōu)于其他酵母。圖2顯示，在40°C，25%的纖維素中得到的CLAS5566，耐乙醇濃度可達到100g/L，乙醇耐受力明顯優(yōu)于釀酒酵母，耐高溫活性干酵，略低于安琪公司超級酒酵母。規(guī)模制備例1將含有纖維素的培養(yǎng)基加入到一個6L的反應(yīng)釜中含水2L，裝樣量達到2.5L，以確保接種時有足夠的空間。培養(yǎng)基混合在發(fā)酵器中，含有脂類物質(zhì)(30ml/L油酸)，滅菌120°C30到40min。抗生素含有500mg的10mg/L的penicillin和500mg(10mg/L)的str印tomcycin，pH在4.5-5.0。接著，將纖維素酶加入，接種纖維素乙醇專用酵母CLAS5566，細胞密度2Xl(f，稀釋至3L，用水兌稀。酶破壞纖維素為葡萄糖和纖維二糖，酵母發(fā)酵為乙醇，控制溫度38°C，同步糖化發(fā)酵72小時，得到89g/L乙醇，接著從發(fā)酵底物中分餾出乙醇，得到纖維素乙醇。規(guī)模制備例2將含有纖維素的培養(yǎng)基加入到一個20L的反應(yīng)釜中含水4L，裝樣量達到5.5L，以確保接種時有足夠的空間。培養(yǎng)基混合在發(fā)酵器中，含有脂類(麥角甾醇5mg/L)，滅菌120°C30到40min?？股睾?00mg的10mg/L的penicillin和500mg(10mg/L)的str印tomcycin，pH在4.0-4.5。接著，將纖維素酶加入，接種纖維素乙醇專用酵母CLAS5566，細胞密度2X108，稀釋至5L，用水兌稀。酶破壞纖維素為葡萄糖和纖維二糖，酵母發(fā)酵為乙醇，控制溫度42°C，同步糖化發(fā)酵96小時，得到98g/L乙醇，接著從發(fā)酵底物中分餾出乙醇，得到纖維素乙醇。以上對本發(fā)明所提供纖維素乙醇的生產(chǎn)方法進行了詳細介紹。需要指出的是，具體實施方式所描述的內(nèi)容是為更好的實施本發(fā)明而優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于上述實施方式所述的技術(shù)方案，而應(yīng)以權(quán)利要求書所述的實質(zhì)內(nèi)容為準(zhǔn)，任何可能的工藝上的改變只要不脫離本發(fā)明權(quán)利要求的實質(zhì)內(nèi)容均屬于本發(fā)明所保護的范圍。權(quán)利要求一種纖維素乙醇的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟1)將含有纖維素和/或半纖維素原料的培養(yǎng)基加入到發(fā)酵反應(yīng)釜中；2)向發(fā)酵反應(yīng)釜中加入纖維素酶，并接種葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)；3)在纖維素酶和葡萄牙假絲酵母的共同作用下進行同步糖化發(fā)酵，分離得到纖維素乙醇。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟l)中纖維素和/或半纖維素原料的來源為可再生的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟l)中所述培養(yǎng)基包括15%-30%的纖維素和/或半纖維素原料4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟1)中所述培養(yǎng)基還包括少量的酵母抽提物、蛋白胨和抗生素。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟l)中所述培養(yǎng)基控制pH值在3.5-6.0。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟2)中纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量P-葡萄糖苷酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟2)中葡萄牙假絲酵母為經(jīng)過纖維二糖和乙醇馴化的酵母。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于馴化采用纖維二糖5%、10%、15%三個濃度梯度，逐代劃線分離，然后采用1%，2%，3%乙醇梯度馴化，分離得到優(yōu)勢菌株。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中同步糖化發(fā)酵的反應(yīng)溫度35-45。C。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中同步糖化發(fā)酵的反應(yīng)溫度40-45。C。全文摘要本發(fā)明公開了一種纖維素乙醇的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟1)將含有纖維素和/或半纖維素原料的培養(yǎng)基加入到發(fā)酵反應(yīng)釜中；2)向發(fā)酵反應(yīng)釜中加入纖維素酶，并接種葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)；3)在纖維素酶和葡萄牙假絲酵母的共同作用下進行同步糖化發(fā)酵，分離得到纖維素乙醇。本發(fā)明中用于同步糖化發(fā)酵的葡萄牙假絲酵母具有較高的乙醇耐受力和較高的乙醇生產(chǎn)速率，能夠以纖維素、半纖維素為原料在纖維素酶的共同作用下同步糖化發(fā)酵高效制備纖維素乙醇。文檔編號C12R1/72GK101760482SQ20081018946公開日2010年6月30日申請日期2008年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日發(fā)明者余明華,俞學(xué)鋒,劉代武,姚鵑,曾晶,李志軍,李知洪,龔大春申請人:安琪酵母股份有限公司