專利名稱：一種產漆酶的靈芝菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生化領域，具體涉及一種發(fā)酵漆酶的真菌菌株。
背景技術：
漆酶(Laccase, EC1. 10. 3. 2)是一類含銅的多酚氧化酶，主要包括植物漆酶和真菌漆酶； 前者主要催化底物的氧化聚合，與植物傷口保護等有關[雷福厚等(2003)中國生漆，2003(1): 4-7];后者主要在木腐菌中發(fā)現(xiàn)，能促進木質素等底物的降解[Bajpai (1999) Biotech Prog， 15:147-157;涂寧宇等(2006)造紙科學與技術，25:27-31]。真菌漆酶的用途十分廣泛。在 木材加工中，用漆酶處理促使表面膠合，可替代膠合劑；在造紙工業(yè)中，漆酶用于漂白紙張， 降低紙漿硬度、降低化學品用量和降低能耗以及降低廢液中有機氯含量；在食品業(yè)中，漆酶 用于去除啤酒和果汁混濁；在紡織業(yè)中，漆酶用于脫色、漂白和去除木質素；在環(huán)境保護中， 漆酶用于污染物脫毒、土壤修復以及有機磷農藥分解等。因此，漆酶具有極大的應用潛力 [Bourbonnais等(1997) Appl Environ Microbial, 63:4627-4632;王國棟等(2003)植物學 通報，20:469-475]。
盡管漆酶的用途廣，但產量的不足極大地限制了其潛能的發(fā)揮。目說有關漆酶的研究多 是圍繞提高漆酶的產量而展開的，如篩選優(yōu)良的產漆酶菌株或構建基因工程菌，探索最佳的 產漆酶培養(yǎng)條件，以期能進行工業(yè)化生產。近十幾年尤其是近五六年來，這方面的研究取得
了一定的進展，然而仍存在著不少問題多數試驗菌株在人工和天然培養(yǎng)基上生長時的發(fā)酵 周期長、不易操作，產酶能力弱，且往往需要有毒或昂貴的誘導劑，不環(huán)保，致使利用現(xiàn)有 菌種生產成本高，限制了漆酶的產業(yè)化進程。
靈芝(fe/wArma)是一類寄生在樹木上的真菌，能產生漆酶，將所寄生樹木的木質素消 化。關于靈芝的研究主要圍繞著其藥用價值和保健功能這兩個方面展開，而關于靈芝漆酶的 研究尚不多見。國家知識產權局于2007年3月28日公開了一項發(fā)明專利申請"一種靈芝漆 酶的清潔高效生成方法"(申請?zhí)?00610096638. 5)，該申請涉及一種靈芝漆酶的生產方法， 該方法利用樹舌靈芝ST (CCTCC N0.M206100)在含有玉米粉、糧食麩皮和花生餅粉的培養(yǎng)基 中發(fā)酵5天，獲得酶活為9000U/L的靈芝漆酶。國外也有關于利用靈芝生產漆酶的研究，如 Trevor M等人利用fe/ ot/e，a ao^Der^y/ 7液體發(fā)酵14天，獲得酶活達34000 U/L (ABTS法) 的漆酶[Songulashvili G et W (2006) Biotechnol Lett 28:1425-1429]。雖然上述方
法利用靈芝發(fā)酵漆酶的產量有較大的提高，但是離產業(yè)化生產仍有相當的距離。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種產漆酶的靈芝菌菌株。
本發(fā)明所提供的靈芝菌菌株是韋伯靈芝TZC1 (fe/7oofe/y^ we力erj'朋y/z TZC1),己于2008 年9月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 2648。
本發(fā)明韋伯靈芝TZC1是從野生靈芝中分離出來的，經形態(tài)學和分子鑒定為韋伯靈芝 fe"ocfeme/bery朋咖(BRES & Henn. ex Sacc. ) Steyairt。依據《中國真菌志，第十八巻， 靈芝科》(2000)、《中國藥用真菌圖鑒》(1987)和《中國靈芝圖鑒》(2005)對本發(fā)明菌株進 行形態(tài)學檢驗，其宏觀特征和顯微特征符合韋伯靈芝fe/ oofe/^a ^6en'a77"瓜(BRES & Henn. ex Sacc. ) Steyarrt種的特征范圍。對從本發(fā)明菌株所產生的菌絲提取的DNA進行PCR擴增、 測序和序列比對，結果表明韋伯靈芝TZC1的ITS序列(如SEQ NO. 1所示)與韋伯靈芝的同 源性達99.9%;但TZC1的Mn-S0D基因的部分序列(如SEQN0.2所示)與韋伯靈芝的同源性 僅為96%。 .
本發(fā)明所述的韋伯靈芝TZC1在液體產酶基礎培養(yǎng)基中發(fā)酵，可獲得酶活高達46,780U/L (ABTS法檢測)的漆酶，比已經報道的最高的靈芝漆酶活性34，000U/L高出26.4M。所述的 液體產酶基礎培養(yǎng)基每升中含有馬鈴薯200g，葡萄糖20g， KH2P043g， MgS(V7H20 1.5g， 維生素Bi2mg，酵母膏5g和70mL微量元素溶液，余量為水，pH4.8;其中所述的微量元素 溶液是指含有MgS04.7H20 3g/L， MnS04.H20 0.5g/L, NaCl lg/L， FeS04.7H20 0.1g/L， CoCl2 0.1g/L， ZnSO4.7H2O0.1g/L， CuS04.5H20 0.1g/L， KA1(S04)2.12H20 0. 01g/L， H3B030. 01g/L， Na2Mo04 2H20 0. Olg/L的水溶液。
本發(fā)明所述的韋伯靈芝TZC1可以在上述培養(yǎng)基中發(fā)酵獲得，也可以在下述專用培養(yǎng)基發(fā) 酵獲得麩皮15~35g/L，葡萄糖5~25g/L，酵母粉l~10g/L， KH2P04 l~5g/L， MgSO40.5~5 g/L, VBil 5mg/L， Cu2+0.1~5wmol/L， Zn2+0.1~5 H mol/L， Mn2+5 100u mol/L，其余為水。將本 發(fā)明所述的韋伯靈芝TZC1菌絲按10%接種量接種于上述培養(yǎng)基中，在20~32°C、 120~250 r/min 條件下振蕩或攪拌培養(yǎng)6天，可獲得酶活高達8620,830U/L (ABTS法檢測)的漆酶。
本發(fā)明韋伯靈芝TZC1發(fā)酵所得的漆酶在pH值2. 64 5. 0范圍內活性較為穩(wěn)定，在pH 值為4.2時酶活最高。本發(fā)明韋伯靈芝TZC1發(fā)酵所得漆酶的酶促反應溫度范圍較廣，其最適 溫度為50 60°C， 70。C時為最高酶活的81. 7%， 20°C、 3(TC及4(TC均可達到最高酶活的88% 以上，10°。為最高酶活的65%。同時，這種漆酶具有較好的熱穩(wěn)定性，在40、 50、 60、 70和 75°C、 80。C下反應0.5h，其酶活分別為原酶活的99.1%、 96.2%、 93.7%、 67.2%、 6.5%和0; 在60。C時，反應1、 1.5、 3.5和4h的殘存酶活分別為69.1%、 68.2%、 47.1%和40.1%;在70°C時，反應l、 1.5和2h殘存酶分別為6.9。/。、 3.4%禾卩1.6%。金屬陽離子對所述漆酶的活性有較 大的影響，如Mg"、 Cu2+、 K+和Hg+對其活性有激活作用，而A產、Fe2+、 Zn2+、 Mn2+、 Ba2+ 則有抑制作用，尤其是F^+可使本發(fā)明所述的漆酶完全失活。
本發(fā)明TZC1發(fā)酵所分泌的漆酶能促進木質素的分解，對印染染料脫色具有顯著的促進 作用，對紙漿脫墨也具有一定的促進作用。


圖1是溫度與本發(fā)明漆酶酶活的關系曲線圖。 圖2是反映本發(fā)明漆酶熱穩(wěn)定性的曲線圖。
圖3是本發(fā)明漆酶在60°C和70°C時反應其酶活隨時間變化的曲線圖，其中*表示60°C ， "^"表示7(TC。
圖4是本發(fā)明漆酶在pH值為3-8的環(huán)境中pH值與酶活關系的曲線圖。 圖5是本發(fā)明漆酶在pH值為4-6的環(huán)境中pH值與酶活關系的曲線圖。 圖6是反映本發(fā)明漆酶的pH值穩(wěn)定性的曲線圖。 圖7是本發(fā)明漆酶用于染料脫色的效果圖。
具體實施例方式
以下實施例檢測酶活的方法均為ABTS法
液體搖瓶培養(yǎng)物取樣后以12,000:"/1^11離心101^11，上清液即為待測酶液。酶活測定以2,2'-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡稱ABTS)為底物，反應體系包括1.5mLpH 5.0醋酸緩沖 液、0.5mL0.5mmol/LABTS (pH 5.0醋酸緩沖液配制)及l(fā)mL適當稀釋的酶液(以pH 5.0醋 酸緩沖液稀釋)，室溫下測定反應的前3min內反應液在波長420nm處OD值的增加量，以滅 活酶液做空白對照。將每分鐘內生成l^unol反應物所需的酶量定義為一個酶活力單位，以酶 液事先滅活后的反應混合液為對照。定義每分鐘轉化lpmol的底物所需的酶量為一個酶活力 單位(U))其計算公式
鵬活力(U) 、^x^x酷液禾布釋倍數 其中，e 二3.6Xl()4mol,cm"; At: 3min; AOD: 3min內吸光度OD的變化值；V總酶 反應中，反應液的總體積；Vffi:酶反應中，酶液的體積。
例1韋伯靈芝TZC1在液體產酶基礎培養(yǎng)基中的發(fā)酵
1、菌種分離韋伯靈芝TZC1 (fe/wAr/^ (re6er^/7湖TZCl)子實體經釆用組織分離法分離純化，再轉接于新鮮的綜合PDA斜面培養(yǎng)基，于電熱恒溫培養(yǎng)箱28。C培養(yǎng)6天，挑取 菌絲塊以三點接種方法轉接到平板上，28。C培養(yǎng)4d，用無菌打孔器將平板菌種制成直徑10 mm，厚2mm的菌種塞，備用。
2、 種液培養(yǎng)將菌種塞接種到裝有50mL搖瓶種子培養(yǎng)基和10個直徑5mm的玻璃珠 的300ml三角錐形瓶中，每瓶接入3個菌塞，在28。C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)4天。
3、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按10%接種量將搖瓶種子接入裝有100mL液體產酶基礎培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中，在28。C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每天定時取樣檢測漆酶酶活(ABTS 法)，發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)至第6天酶活最高，達到46,780U/L，比已經報道的最高的靈芝漆酶活性 34,000U/L高出26.4%。
上述方法中所用到的培養(yǎng)基配方為
綜合PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgS(V7H2O 1.5g/L， 維生素B^mg/L，瓊脂15g/L。
搖瓶種子培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P043g/L， MgS04'7H20 1.5g/L， 維生素B!2mg/L，酵母膏5g/L， pH4.8。
液體產酶基礎培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P04 3g/L， MgS(V7H20 1.5g/L， 維生素Bi 2mg/L,酵母膏5g/L， 70mL/L微量元素溶液，pH4.8。其中所述的微量元素溶液 為含有以下組分的水溶液MgS047H20 3g/L， MnS(VH20 0.5g/L， NaCl lg/L， FeS(V7H20 0.1g/L， CoCl20.1g/L, ZnSO4.7H2O0.1g/L， CuS04'5H20 0.1g/L， KA1(S04)2'12H20 0. 01g/L， H3BO30.01g/L， Na2MoO4.2H2O0.01g/L。 例2韋伯靈芝TZC1在專用培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的發(fā)酵
1、 菌種分離韋伯靈芝TZC1 『e力eri朋湖TZCl)子實體經采用組織分離法 分離純化，再轉接于新鮮的綜合PDA斜面培養(yǎng)基，于電熱恒溫培養(yǎng)箱28'C培養(yǎng)6天，挑取 菌絲塊以三點接種方法轉接到平板上，28T:培養(yǎng)4d，用無菌打孔器將平板菌種制成直徑10 mm，厚2mm的菌種塞，備用。
2、 種液培養(yǎng)將菌種塞接種到裝有50mL搖瓶種子培養(yǎng)基和10個直徑5mm的玻璃珠 的300ml三角錐形瓶中，每瓶接入3個菌塞，在28t:、 160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4天。
3、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按10%接種量將搖瓶種子接入裝有l(wèi)OOmL本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基 的500mL三角瓶中，在28。C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)6天后，采用ABTS法測得酶活高達 8620,830U/L，是產酶基礎培養(yǎng)基上生產酶活的184倍(是利用fe/700fe，a at/印er^7 液體發(fā) 酵253倍)。將培養(yǎng)液離心，除去菌絲球即得到靈芝粗酶液，可以直接應用也可以純化加工后 再應用。上述方法中所用到的培養(yǎng)基配方為
綜合PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P04 3g/L， MgS04.7H20 1.5g/L， 維生素B! lmg/L，瓊脂15g/L。
搖瓶種子培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P043g/L， MgS04.7H20 1.5g/L， 維生素Bi2mg/L，酵母膏5g/L， pH4.8。
本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮25g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L， KH2P04 3g/L， MgS041.5g/L， VBi2mg/L， CuS04-5H20 0.5 u mol/L， ZnS04-7H20 0.5 u mol/L， MnS04'H20 50ymol/L，其余為水。
例3韋伯靈芝TZC1在專用培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的發(fā)酵
1、 菌種分離韋伯靈芝TZC1 (G朋o^m^w6m'"m/w TZC1)子實體經采用組織分離 法分離純化，再轉接于新鮮的綜合PDA斜面培養(yǎng)基，于電熱恒溫培養(yǎng)箱28'C培養(yǎng)6天，挑 取菌絲塊以三點接種方法轉接到平板上，28'C培養(yǎng)4d，用無菌打孔器將平板菌種制成直徑10 mm，厚2mm的菌種塞，備用。
2、 種液培養(yǎng)將菌種塞接種到裝有50mL搖瓶種子培養(yǎng)基和10個直徑5mm的玻璃珠 的300ml三角錐形瓶中，每瓶接入3個菌塞，在28。C、 160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4天。
3、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按10%接種量將搖瓶種子接入裝有l(wèi)OOmL本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基 的500mL三角瓶中，在28。C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)6天后，將培養(yǎng)液離心，除去菌絲球 即得到靈芝粗酶液，可以直接應用也可以純化加工后再應用。
上述方法中所用到的培養(yǎng)基配方為
綜合PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4'7H2O 1.5g/L， 維生素B, lmg/L，瓊脂15g/L。
搖瓶種子培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P043g/L， MgS(V7H20 1.5g/L， 維生素Bi2mg/L，酵母膏5g/L， pH4.8。
本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮15g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L， KH2P04 lg/L， MgS04 0.5g/L， VB^mg/L， CuS04-5H20 0.1pmol/L， ZnS04'7H20 O.l^mol/L, MnS04H20 5|imol/L， 其余為水。
例4韋伯靈芝TZC1在專用培養(yǎng)基中的發(fā)酵
1、菌種分離靈韋伯靈芝TZC1 (G""otfenw" weZ)en'"mw7 TZC1)子實體經采用組織分 離法分離純化，再轉接于新鮮的綜合PDA斜面培養(yǎng)基，于電熱恒溫培養(yǎng)箱28'C培養(yǎng)6天， 挑取菌絲塊以三點接種方法轉接到平板上，28'C培養(yǎng)4d，用無菌打孔器將平板菌種制成直徑 10mm，厚2mm的菌種塞，備用。2、 種液培養(yǎng)將菌種塞接種到裝有50mL搖瓶種子培養(yǎng)基和10個直徑5mm的玻璃珠 的300ml三角錐形瓶中，每瓶接入3個菌塞，在28。C、 160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4天。
3、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按10%接種量將搖瓶種子接入裝有l(wèi)OOmL本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基 的500mL三角瓶中，在28。C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)6天后，將培養(yǎng)液離心，除去菌絲球 即得到靈芝粗酶液，可以直接應用也可以純化加工后再應用。
上述方法中所用到的培養(yǎng)基配方為
綜合PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L， 維生素Bi lmg/L，瓊脂15g/L。
搖瓶種子培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， KH2P043g/L， MgS04'7H20 1.5g/L，維生 素Bt2mg/L，酵母膏5g/L， pH4.8。
本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮35g/L，葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L， KH2P04 5g/L， MgS04 5 g/L， VBi 5mg/L， CuS04'5H20 5,1/L， ZnS04.7H20 5|amol/L， MnS04-H20 100pmol/L，其余為水。
例5韋伯靈芝TZC1發(fā)酵所得漆酶的性能研究
1、 溫度對本發(fā)明漆酶酶促反應的影響 (1)溫度對漆酶活性的影響
讓反應體系分別在10°C、 20°C、 30°C、 40°C、 50°C、 60°C、 70°C、 80。C溫度下反應3min, 測定酶活力，以酶活最高者為100%計算相對酶活力。由圖1可知，本發(fā)明所生產的漆酶的酶 促反應溫度范圍較廣，其最適溫度為50~60°C， 7(TC時為最高酶活的81.7%， 20°C、 3(TC及 40。C均可達到最高酶活的88%以上，IO'C為最高酶活的65%。 (2)漆酶的熱穩(wěn)定性
將粗酶液分別在0。C、 10°C、 20°C、 30°C、 4CTC、 50°C、 60°C、 70°C、 75°C、 80°C、 90°C 水浴保溫30min后，然后迅速冷至室溫，測定酶活力，以未保溫的酶液的酶活為100%，計算 剩余酶活性，結果如圖2所示。進一步，將酶液在6(TC和7(TC的水浴中分別保溫lh、 1.5 h 、 2h、 2.5 h 、 3h、 3.5 h、 4h后迅速冷至室溫，后按前述方法測定和計算剩余酶活，結果如圖3 所示?？梢?，本發(fā)明所產生的漆酶具有較好的熱穩(wěn)定性，不同溫度處理30min， 40、 50、 60、 70、 75和80。C的酶活分別為原酶活的99.1。/。、 96.2%、 93.7%、 67.2%、 6.5%和0 (圖2)。在 60。C時，反應l、 1.5、 3.5和4h的殘存酶活分別為69.1%、 68.2%、 47.1%和40.1%;在70°C 時，反應l、 1.5和2h殘存酶分別為6.9。/。、 3.4%和1.6% (圖3)。
2、 pH值對本發(fā)明漆酶穩(wěn)定性的影響 (l)pH對漆酶活性的影響分別采用pH為3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0和8.0的醋酸緩沖液配制底物和稀釋酶液，使酶 液處在不同pH的緩沖液中，測定酶活力，以酶活最高者為100%，計算剩余酶活性。結果表 明，該酶的最合適pH值在5左右(圖4)。進一步采用pH為4.0、 4.2、 4.4、 4.6、 4.8、 5.0、 5.2、 5.4、 5.6、 5.8、和6.0的醋酸緩沖液配制底物和稀釋酶液，使酶液處在不同pH的緩沖液 中，測定酶活力，以酶活最高者為100%，計算剩余酶活性。結果表明，該酶的最合適pH值 為4.6 (圖5)。
(2) 漆酶的pH穩(wěn)定性
將粗酶液中加入pH值分別為3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0禾tl 8. 0的醋酸緩沖液，常溫下 維持lh后，測定酶活力，以沒有經過處理的酶液的酶活為100%，計算剩余酶活性。結果表 明，該酶在pH值為3~5.5時表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，pH值為6.0時殘余酶活為39.4%， pH值 為7.0殘余酶活為18.1%。
3、本發(fā)明漆酶在染料脫色中的應用
(1) 酶粗提液準備按10%接種量將搖瓶種子接入裝有l(wèi)OOmL本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基 的500mL三角瓶中，在28°C 、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)6天后，將發(fā)酵酶液在12000rm/min 的條件下離心2min，取上清，測酶活，備用。
(2) 染料的配制準確稱取0.5g染料，用0.2mol/LpH5.0的醋酸緩沖液定容至25ml，濃 度為20mg/ml。反應時的終濃度為200mg/L。染料包括分散藍2BLN 100%、陽離子藍X-GRRL 250%、直接湖藍5B、活性黑HGRF、考馬斯亮藍R250、本胺藍以及溴酚藍。
(3) 反應體系各處理的反應總體積為3000|il， pH5.0，反應溫度為28'C，反應24h后 照相記錄(圖7)。 CK: 2970^1醋酸緩沖液(0.2mol/LpH5.0) + 30^1染料;死酶體系2960^1 醋酸緩沖液(0.2mol/LpH5.0) + 30^1染料+ lOpl死漆酶(10U/ml);活酶體系2960nl醋酸 緩沖液(0.2mol/LpH5.0) + 30|^1染料+ 10(il活漆酶(10U/ml); ABTS: 2470^1醋酸緩沖液
(0.2mol/L pH5.0) + 30ul染料+ 0.5ml ABTS (0.5腿ol/L);活酶+ABTS: 2460nl ml醋酸 緩沖液(0.2mol/LpH5.0) + 30^1染料+10^1活漆酶(10U/ml)十0.5mlABTS (O.5mmol/L)。 由圖7可以看出，用韋伯靈芝TZC1漆酶處理所示染料，可以使分散藍、直接湖藍、活 性黑、苯胺藍以及溴酚藍脫色，添加ABTS促進這些染料脫色，并使只有漆酶不脫色的陽離 子藍活性黑HGRF和考馬斯亮藍R250脫色。
9SEQUENCE LISTING
<110>廣州大學
<120> —種產漆酶的靈芝菌株
<160> 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 728 <212> DNA
<213> Ganoderma weberianum TZC1 <400> 1
tcataaattt gtccagacaa ggacggttag aagctcgcca aaacgcttca cggtcgcggc 60 gtagacatta tcacaccgag agccgatccg caaggaatca agctaatgca' tttaagagga 120 gccgaccgaa acacggccga caagcctcca agtccaagcc tacaaaaccc gcaaaggtct 180' gtaagttgaa gatttcatga cactcaaaca ggcatgctcc tcggaatacc aaggagcgca 240 aggtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300 tcgctgcgtt cttcatcgat gcgagagcca agagatccgt tgctgaaagt tgtatataga 360 tgcgttscst cgcai3t3C3C 3ttctgst3c tttatsgagt ttgtgst333 cgc3ggc3C3 420 gacgccgctc tacaagctcg gtgaagagac ccgctttacg acgtttgaaa cccacagtaa 480gtgcacaggt gtagagtgga tgagcagggc gtgcacatgc ctcggaaggc cagctacaac 540
ccagtcaass ctcg3taatg atccttccgc aggttceicct acggaaacct tgttacgact 600
tttacttcct ctaaatgacc aagtttgatc aagttctcag cgacagggtg ccgttgccgg 660
ctccccgaag ccaatcccaa gacctcacta agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg 720
tgtgtacei
728
<210> 2 <211> 703 <212> DNA
<213> Ganoderma weberianum TZC1 <400> 2
aaggcgtgct cccagatatc gacgccgatg atggggacat gcgagaggag cgggtcctga 60 ttggcggtcg tcgttatctc gagacgcttc gtcgccgggt taagtccctg agtccaaacc 120 3tcc3ctt3g tseiaigcatcc gscgcgsggs sgcscacggc sgggcgsgst gaaaggttcc 180 ggsgctctst cgc3g3gcga tgstttgcgg csgatcgcas tcgcstcttc tctggcgtcs 240 ctgccgcgaa gcacgcatgc atcgcgatcg cggccccgaa gtccctcccg atcgcacacg 300 acagacagaa ggaatgggac ttacgagcca gccccagcca gagccctgga tggcagcagt 360 ggtggcgttg aactccttga tgaagttgtc gacggagccc cagttctgct cgatcgcgga 420
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C3tcgcgcgc g3t3g3tc3g tttccgcgag stttactcsc csccgccgtt gsscttgagg 600
gccgactgga gggcgatgcg ctccttgggg gtggaggcct tggcgtaggc ttgctcggcg 660 gcgttgagcg agttgacgta ggtctggtgg tgcttcttgt ggt 703
1權利要求
1、韋伯靈芝TZC1，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.2648。
2、 一種漆酶，該漆酶由權利要求1所述的韋伯靈芝TZC1發(fā)酵獲得。
3、 一種韋伯靈芝TZC1發(fā)酵漆酶的專用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為水溶液，所述的水溶液的溶 質由以下濃度的組分組成麩皮15~35g/L，葡萄糖5~25g/L，酵母粉l 10g/L， KH2P04 l~5g/L， MgSO40.5 5 g/L， VB' l~5mg/L， Cu2+ 0.卜5 u mol/L， Zn2+ 0.1~5 y mol/L， Mn2+ 5~100 P mol/L。
4、 一種生產漆酶的方法，該方法是將韋伯靈芝TZC1菌絲按10°/。的接種量接種于權利要 求3所述的專用培養(yǎng)基中，在20 32X:、 120~250 r/min條件下振蕩或攪拌培養(yǎng)6天，然后將 發(fā)酵液離心后取上清即可。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產漆酶的靈芝菌株，該靈芝菌是韋伯靈芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.2648。本發(fā)明韋伯靈芝TZC1在發(fā)酵過程中能產生漆酶，所得漆酶的活性可高達8620,830U/L，是現(xiàn)有技術中可達到最高酶活的253倍。本發(fā)明韋伯靈芝TZC1發(fā)酵所分泌的漆酶在較廣的溫度和pH值范圍內保持較好的活性，能促進木質素的分解，對印染染料脫色具有顯著的促進作用。
文檔編號C12N1/14GK101638621SQ200810198678
公開日2010年2月3日 申請日期2008年9月23日 優(yōu)先權日2008年9月23日
發(fā)明者周玉萍, 田長恩, 陳瓊華 申請人:廣州大學